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    关 键 词:
    一种 针对 中枢神经系统 DNA 疫苗
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410014598.X

    申请日:

    2014.01.10

    公开号:

    CN104771763A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61K 48/00申请公布日:20150715|||公开
    IPC分类号: A61K48/00; C12N15/85; C12N15/66; A61P25/28; A61P25/16; A61P9/10; A61P25/00 主分类号: A61K48/00
    申请人: 毛力真
    发明人: 毛力真
    地址: 213164江苏省常州市武进区常武中路801号常州科教城天润科技大厦D座8楼
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410014598.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.08.25|||2015.07.15

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||公开

    摘要

    本发明公开了一种针对中枢神经系统的DNA疫苗的制备方法,及其对中枢神经系统疾病如帕金森综合症的应用。

    权利要求书

    1.  DNA疫苗,所述疫苗包含编码大鼠MAG的1-5Ig区域的DNA片段、编 码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白的DNA片段、编码人Nogo-A N端的 DNA片段和编码人Nogo-A胞外端的66个氨基酸的DNA片段。

    2.
      如权利要求1所述的DNA疫苗,其特征在于,所述大鼠MAG的1-5Ig 区域由SEQ IDN0.1所示的序列编码。

    3.
      如权利要求1所述的DNA疫苗,其特征在于,所述小鼠OMgp胞外8 个脂质体受体样蛋白由SEQ ID N0.2所示的序列编码。

    4.
      如权利要求1所述的DNA疫苗,其特征在于,所述人Nogo-A N端由 SEQ ID N0.3所示的序列编码。

    5.
      如权利要求1所述的DNA疫苗,其特征在于,所述人Nogo-A胞外端 的66个氨基酸由SEQ ID N0.4所示的序列编码。

    6.
      制备如权利要求1-5中任一项所述的DNA疫苗的方法,所述方法包括 如下步骤:构建重组质粒,将所述疫苗各自的基因片段顺序连接并亚克隆到载体 质粒,由限制性内切酶进行双酶切,丙氨酸连接子位于两个相邻结构域之间便 于多肽折叠,通过PCR和测序检查合成产物,确认所得产物为所需DNA疫苗。

    7.
      如权利要求6所述的方法,其中所述载体质粒为pcDNA3.1。

    8.
      如权利要求6所述的方法,其中所述限制性内切酶为BamH I和Xba I。

    9.
      如权利要求1-5中任一项所述的DNA疫苗在预防中枢神经系统病变如 帕金森综合症中的应用。

    说明书

    一种针对中枢神经系统的DNA疫苗
    技术领域
    本发明一方面涉及髓鞘相关蛋白在帕金森综合症中的病理作用及作为药物 靶点的价值研究;另一方面涉及髓鞘相关蛋白在制备针对中枢神经系统的生物 工程DNA疫苗中的应用,并包含编码所述髓鞘相关蛋白的DNA片段的疫苗和 疫苗制备方法。
    背景技术
    帕金森综合症(Parkinsonism,PD)是发生于中年以上成人黑质和黑质纹状体 通路变性疾病。目前公认其病因是神经细胞的退行性变,主要病变部位在黑质 和纹状体。其中有一种被称为黑质细胞的神经细胞,黑质细胞数量的逐渐减少、 功能的逐步丧失,致使多巴胺减少,从而引起PD的发生。目前,只有通过预防、 外科治疗及康复治疗等手段对PD进行治疗,但是效果不尽如人意。因此,利用 一些有神经?;?、促进变性神经再生以及促进神经可塑性重建的治疗手段有可 能是目前治疗PD更有效的措施。
    髓鞘及其相关蛋白在神经再生中起着重要的作用。受损伤后,中枢神经系 统(Central Nervous System,CNS)神经轴索无法再生导致永久性的损伤。这种对神 经纤维再生的抑制很大程度上是由于髓鞘相关蛋白阻碍轴索再生引起的。髓鞘 相关蛋白-A型勿动蛋白(Nogo-A)、髓鞘磷脂相关糖蛋白(Myelin-associated  glycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(Oligodendrocyte-myelin  glycoprotein,OMgp),位于有髓纤维的节旁区,是抑制神经再生的髓鞘的主要组 成蛋白。它们通过共同的受体NgR,通过统一信号通路对神经再生起着抑制作 用。Tenasin-C(TNC),Tenasin-R(TNR),位于有髓纤维的朗飞氏节上,它们在调 节神经再生及神经可塑性中发挥着重要的作用。
    近年来发现,髓鞘有可能直接参与帕金森综合症的病理发生发展。在帕金 森综合症早期的病人脑内,甚至还没有出现明显临床症状的时候,已经能够检 测到髓鞘的异常变化了。而且,髓鞘出现异常的区域恰恰是帕金森综合症病人 最容易受影响的脑区。另外,研究发现,髓鞘在经验依赖性的神经突触可塑性 调节中发挥着重要作用。这说明髓鞘及其相关蛋白有可能亦是治疗帕金森综合 症或其他中枢神经系统退行性病变的药物靶点。
    DNA疫苗是一种新型疫苗。它利用载体表达编码目的蛋白的DNA序列。 DNA疫苗具有安全性好、稳定性高、易设计、易大规模生产、并能诱导T细胞 和B细胞介导的细胞和体液免疫等优势。Nogo-A、MAG、OMgp、TNC和TNR 抑制神经再生。阻断以上分子不仅可以促进神经再生,并对神经元有?;ぷ饔?。 目前,在试图消除分子的抑制性作用方面已经取得了不同程度的成功。已有文 献报道利用编码MAG、TN-R和Nogo-A重组DNA疫苗治疗脊髓损伤的模型大 鼠,发现该疫苗对脊髓损伤后大鼠的行为及神经再生都有很强的改善作用。疫 苗接种后8周将脊髓背侧半横断损伤,与对照组相比,接种疫苗组产生了健康 的皮质脊髓束轴索的再生(CST)。接种该DNA疫苗对神经再生的促进作用,在 创伤性脑损伤的动物模型上也得到了验证。部分机制研究发现,编码髓鞘相关 蛋白的这种DNA疫苗可以调控棘突神经生长因子的表达,并通过其神经?;ぷ?用实现。我们研究结果显示Nogo-A、MAG、OMgp、TNC和TNR可能对PD 病理起重要作用。
    中枢神经系统退行性病变如中风、帕金森综合症在病理机制及治疗机理上 存在着很多相似之处。本发明发现,Nogo-A、MAG、OMgp、TNC和TNR可 能是治疗PD的靶点?;诖?,本发明构建了编码Nogo-A、MAG、OMgp相关 抗原片段的基因疫苗,并在APP/PS1双转基因模型小鼠上对该疫苗的安全性和 有效性进行了综合的评价。结果显示,该疫苗在APP/PS1双转基因模型小鼠模 型上,延缓了PD的病理进展。
    发明内容
    本发明提供的数据明确地阐述了髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC 和TNR在帕金森综合症中的病理机制。并在研究基础上,开发出编码Nogo-A、 MAG和OMgp相关抗原表位片段的新型DNA疫苗。这种疫苗在PD模型小鼠 APP/PS1上可以预防和治疗PD的病理发展。
    本发明的目的在于提供髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC和TNR 在PD病理机制的实验数据;编码髓鞘源性蛋白的DNA疫苗及其制备方法和用 途。
    本发明的一方面在于发现髓鞘相关蛋白Nogo-A、MAG、Omgp、TNC和 TNR参与PD的病理发展,并发现它们是治疗PD的新的药物靶点。
    本发明的一方面在于提供一DNA疫苗,所述疫苗主要由编码大鼠MAG的 1-5Ig区域、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白(8LRP)、编码人bNogo-A 的N端、编码人Nogo-A胞外端的66个氨基酸的DNA片段构成。
    本发明的又一方面还在于提供制备这些疫苗的方法,所述方法包括如下步 骤:
    1.构建重组质粒,将所述疫苗各自的基因片段顺序连接并亚克隆到载体质 粒。
    2.由限制性内切酶进行双酶切。
    3.丙氨酸连接子位于两个相邻结构域之间便于多肽折叠。
    4.通过PCR和测序检查合成产物,确认所得产物为所需DNA疫苗。
    5.利用电转染的方法,对疫苗进行免疫。
    进一步地,本发明的载体质粒为pcDNA3.1,所述限制性内切酶为BamH I 和Xba I。
    本发明的再一方面在于提供所述DNA疫苗在预防中枢神经系统病变中的应 用,所述中枢神经系统包括但不限于以下疾?。号两鹕酆现?、多发性硬化、 脊髓损伤、创伤性脑损伤、中风以及脑肿瘤等。
    具体实施方式
    实验方法
    一、免疫共沉淀
    I:准备脑组织裂解物
    取一只成年大鼠脑,放入组织匀浆器,加入6mL裂解液(10mM Tris-盐酸, pH=9,150mM氯化钠溶液,0.5%Triton x-100,1%脱氧胆酸钠,0.5%十二烷基 硫酸钠(SDS),2mM乙二胺四乙酸(EDTA)和蛋白酶抑制剂)后在冰上均匀研磨; 然后将组织匀浆转到1.5mL EP管中,4℃下缓慢晃动20分钟(EP管置于冰上的 水平摇床上);然后再在4℃下以16000rcf离心15分钟;收集上清至新1.5mL EP 管中。收集的样品用BCA蛋白含量测定试剂盒检测蛋白浓度为6mg/mL。
    II:清洗
    用10mL平衡盐溶液PBS稀释20mg脑蛋白;将稀释后的脑蛋白加入150μL 蛋白A琼脂糖珠后在4℃孵育1小时;
    III:免疫沉淀
    准备如下溶液:1,琼脂糖珠:向各试管加蛋白A/G plus(santa cruz:sc-2003)50 μL;2,脑蛋白:0.5mL体积中含脑蛋白1mg;3,同时按如下比例准备待加入的 抗体:a)抗-APP(A8717from Sigma):1μL;b)抗-MAG(chemicon,MAB1567):1μL; c)抗-Nogo A(Abeam:ab62024):2μL。d)模拟对照:只含脑蛋白和琼脂糖珠。
    随后将相应量的脑蛋白和琼脂糖珠在4℃下震荡孵育过夜。
    IV:清洗
    用RIPA裂解液(150mM Nacl溶液,1%NP-40,0.5%DOC(脱氧胆酸), 0.1%SDS和50mM Tris,pH=8.0)清洗琼脂糖珠五次,每次10分钟之后, 3000rpm/分钟,离心5分钟,收集琼脂糖珠。
    V:洗脱
    将琼脂糖珠用50μL含β-巯基乙醇的2×SDS蛋白缓冲液重悬后在72℃加热 10分钟。
    VI:蛋白印迹
    在蛋白胶上以如下顺序加样:
    1,脑蛋白:22.5μg;2,APP:30μL;3,Nogo A:30μL;4,模拟对照:30μL; 5,脑蛋白:45μg;6,APP:30μL;7,Nogo A:30μL;8,模拟对照:30μL;9,蛋 白标准样:10μL;10,高分子蛋白标准样:10μL。
    在电泳之后以恒流350mA转膜90分钟。然后用5%的脱脂奶粉常温封闭1 小时。
    随后分别用以下浓度的抗体进行免疫印迹检测:抗NogoA(1:500,ab62024, Abcam);抗MAG(1:1000,MAB1567,Chemicon);抗App(1:1000,MAB348, Chemicon)。
    二、酶联免疫吸附实验
    I.分离培养皮层神经元
    1.铺板:PDL解冻后,用DMEM按1∶50的比例稀释后铺板,4℃过夜。
    2.第二天准备以下溶液和培养基:
    HBS=HBSS+350mg/L NaHCO3(用1mM HEPES调节pH值)
    贴壁培养基=DMEM+10%FBS+1×L-Glu+P/S(100×储备液,1∶1000稀释)
    生长培养基=Neurobasal medium+2%B27+1×L-Glu+P/S
    消化用HBS缓冲液(每只胎鼠5mL)=2.5ml HBSS+2.5mL胰酶(0.25%)
    3.剥离脑组织:用70%酒精消毒器械,将出生后0-3天的幼鼠断头并在放于 冰上盛有HBS的培养皿中将小鼠的大脑皮层分离,切碎成长0.5-1mm的小片。
    4.a.将组织移至15mL锥形试管中并用HBS清洗两次;b.加入3mL已预热的 消化用HBS,37℃孵育20分钟;c.孵育后用已预热的贴壁用培养基清洗两次; d.用1000μL移液器上下吹打15次;e.用70μm滤器过滤细胞悬液后计数。
    5.接种细胞:细胞悬液1500rpm离心5分钟后弃掉上清,用贴壁培养基重悬 后接种到用PDL铺板的多孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中。
    6.培养:第二天,用生长培养基半量换液;此后,每2~3天半量换液;
    II.用髓鞘相关蛋白处理细胞
    1.用培养基稀释蛋白
    将以下蛋白用培养基稀释到相应浓度。
    髓鞘相关糖蛋白(MAG),Nogo-A氮端566-748片段(Nogo-N;3728_NG, R&D),Nogo-A片段(Nogo66)少突胶质细胞髓鞘糖蛋白OMgp,腱糖蛋白 -R(TNR),腱糖蛋白-C(TNC)。
    2.将原板孔中的培养基轻轻吸掉后每孔加入200μL已稀释蛋白。
    3.在37℃,5%CO2细胞培养箱中培养2小时或者24小时。
    III.酶联免疫吸附法(ELISA)检测Aβ1-42
    1.准备试剂(WAK0290-6601,用于Aβ1-42的ELISA试剂盒,用于Aβ1-42的 WAKO292-62301):
    在所有ELISA试剂升至常温后打开ELISA检测用多孔板;
    用稀释液将标准品稀释到以下系列浓度:2.5pmol/L、5pmol/L、10pmol/L、 25pmol/L、50pmol/L、100pmol/L。
    用双蒸水稀释20×的清洗液至1×备用。
    2.从用髓鞘相关蛋白处理的细胞所在板中收集培养基并标记。
    3.将收集的培养基各取100μL加到ELISA检测用多孔板,标准品也各加100 μL至板中后密封检测板,在4℃过夜。
    4.弃掉板中溶液后,清洗5次。
    5.每孔加入TMB溶液100μL后密封,在常温避光条件下孵育30分钟。
    6.每孔加入100μL终止液。
    7.30分钟内用酶标仪在450nm波长读板。
    三、闻尔基染色
    用FD Rapid Golgistain试剂盒,操作步骤照试剂盒内指示,具体如下:
    I.准备大脑切片将小鼠处死后,迅速小心取出大脑,在去离子水中清洗后 浸入装有A+B等量混合液(提前24小时配制,勿震荡)的试管中,室温避光保存 2周(注:次日换A+B等量混合液);
    1.将大脑从A+B混合液中取出后放入装有C液的试管中,4℃避光保存48 小时(注:次日换C液);
    2.将大脑在震动切片机中切片,片厚150μm,放在0.1M DPBS配制的6%蔗 糖溶液中4℃避光保存备用。
    II.染色步骤
    1.将脑片放在漂染皿中,用去离子水漂洗2次,每次2分钟;
    2.用负压吸引器将去离子水吸净,加入适量染色混合液(D液∶E液∶去离子水 =1∶1∶2)孵育10分钟。
    3.用负压吸引器将染色混合液吸净,加入去离子水清洗两次,每次4分钟;
    4.将脑片移至载玻片上,依次滴加新配制的50、75、95%酒精梯度脱水,每 个浓度4分钟;
    5.滴加100%酒精脱水,每次4分钟,共4次;
    6.滴加二甲苯,每次4分钟,共3次;
    7.滴加适量中性树胶,用盖玻片封片;用透明指甲油将盖玻片四周封闭,晾 干,避光保存。
    四、免疫荧光
    I.小鼠大脑切片
    1.将小鼠处死后,小心取出大脑,在4℃DPBS溶液中清洗后放入4%多聚 甲醛溶液中后固定48小时;
    2.把大脑从多聚甲醛中取出后放入40%蔗糖溶液中脱水过夜;
    3.将大脑在冰冻切片机中切片,片厚16μm,室温晾干后-20℃保存备用。
    II.免疫荧光步骤
    1.清洗:用0.1M DPBS/0.3%Triton-100清洗切片3次,每次10分钟后,将 残余清洗液用滤纸吸掉;
    2.封闭:用0.1M DPBS/0.5%Triton x-100/10%驴血清常温孵育1小时;
    3.孵育一级抗体:将切片孵育一级抗体(用0.1M DPBS/0.5%Triton x-100/5% 驴血清稀释),4℃过夜;
    4.清洗:用0.1M DPBS/0.3%triton-100清洗切片3次,每次10分钟;
    5.孵育二级抗体:将切片孵育相应荧光二级抗体(用0.1M DPBS/0.3%Triton  x-100/5%驴血清稀释),常温避光1小时;
    6.清洗:用0.1M DPBS/0.3%Triton x-100避光清洗切片3次,每次10分钟;
    7.封片:a.将残余清洗液吸掉后,滴适量含DAPI的封片剂后用盖玻片封片(避 免气泡产生);b.用透明指甲油将盖玻片四周封闭,晾干,避光4℃保存。
    实施例1:本发明DNA疫苗的制备
    经免疫学分析,在本发明中,选定了编码大鼠MAG的1-5Ig区域的DNA 片段(SEQ ID N0.1)、编码小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白的DNA片段 (SEQ ID N0.2)、编码人Nogo-A N端的DNA片段(SEQ ID N0.3)和编码Nogo-A 胞外端的66个氨基酸的DNA片段(SEQ ID N0.4)作为免疫原,来构建疫苗载体。 DNA疫苗包含鼠MAGIg1-5、鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白、人Nogo-A N端和Nogo-A胞外端的66个氨基酸,并将3-丙氨酸连接物插入于各亚克隆序 列间,以便于多肽链折叠。其具体制备方法如下:
    一、材料:pCDNA3.1质粒、DH5α感受态细胞、氨苄抗生素溶液及平板、 Accuprimepfx Polymerase高保真扩增酶、BamH I限制性内切酶、Sac II限制性 内切酶、Not I限制性内切酶、Pst I限制性内切酶、Xba I限制性内切酶、Ligase 连接酶。
    二、方法
    构建pCDNA3.1-MAGIg1-5+AAA+0Mgp8+AAA+Nogo-N+AAA+Nogo_66 载体。
    选定了编码大鼠MAG的1-5Ig区域的DNA片段、编码小鼠OMgp胞外8 个脂质体受体样蛋白的DNA片段、编码人Nogo-A N端的DNA片段,和编码 Nogo-A胞外端的66个氨基酸的DNA片段作为免疫原,来构建疫苗载体。DNA 疫苗包含大鼠MAG Ig1-5、小鼠OMgp胞外8个脂质体受体样蛋白、人Nogo-A N 端和Nogo-A胞外端的66个氨基酸,并将3-丙氨酸连接物插入于各亚克隆序列 间,以便于多肽链折叠。
    (一)要扩增目的序列如下:
    SEQ ID N0.1大鼠MAG(1524bp):
    atgatattccttaccaccctgcctctgttttggataatgatttcagcttctcgaggggggcactggggtgcctggatgccctcg tccatctcagccttcgagggcacgtgtgtctccatcccctgccgtttcgacttcccggatgagctcagaccggctgtggtac atggcgtctggtatttcaacagtccctaccccaagaactacccgccagtggtcttcaagtcccgcacacaagtggtccacg agagcttccagggccgtagccgcctgttgggagacctgggcctacgaaactgcaccctgcttctcagcacgctgagccct gagctgggagggaaatactatttccgaggtgacctgggcggctacaaccagtacaccttctcggagcacagcgtcctgg acatcatcaacacccccaacatcgtggtgcccccagaagtggtggcaggaacggaagtagaggtcagctgcatggtgcc ggacaactgcccagagctgcgccctgagetgagetggctgggccacgaggggctaggggagcccactgttctgggtcg gctgcgggaggatgaaggcacctgggtgcaggtgtcactgctacacttcgtgcctactagagaggccaacggccaccgt ctgggctgtcaggctgccttccccaacaccaccttgcagttcgagggttacgccagtctggacgtcaagtaccccccggtg attgtggagatgaattcctctgtggaggccattgagggctcccatgtcagcctgctctgtggggctgacagcaacccgcca ccgctgctgacttggatgcgggatgggatggtgttgagggaggcagttgctgagagcctgtacctggatctggaggaggt gaccccagcagaggacggcatctatgcttgcctggcagagaatgcctatggccaggacaaccgcacggtggagctgag cgtcatgtatgcaccttggaagcccacagtgaatgggacggtggtggcggtagagggggagacagtctccatcctgtgtt ccacacagagcaacccggaccctattctcaccatcttcaaggagaagcagatcctggccacggtcatctatgagagtcag ctgcagctggaactccctgcagtgacgcccgaggacgatggggagtactggtgtgtagctgagaaccagtatggccaga gagccaccgccttcaacctgtctgtggagtttgctcccataatccttctggaatcgcactgtgcagcggccagagacaccgt gcagtgcctgtgtgtggtaaaatccaacccggaaccctccgtggcctttgagctgccttcccgcaacgtgactgtgaacga gacagagagggagtttgtgtactcagagcgcagcggcctcctgctcaccagcatcctcacgctccggggtcaggcccaa gccccaccccgcgtcatttgtacctccaggaacctctacggcacccagagcctcgagctgcctttccagggagcacaccg a
    SEQ ID N0.2编码OMgp8胞外8个脂质体受体样蛋白的核苷酸(645bp):
    acatgcacagagaggcacaggcatgtggactgttcaggcagaaacttgactacattaccacctggactgcaggagaacat tatacatttaaacctgtcttataaccactttactgatctgcataaccagttaaccccatataccaatctgagaaccctggatattt caaacaacaggcttgaaagtctgcctgctcagttacctcggtctctctggaacatgtctgctgctaacaacaatattaaacttc ttgacaaatctgatactgcttatcagtggaaccttaaatacctggatgtttctaagaatatgctggaaaaggttgttctcattaaa aataccctaagaagtctcgaggttcttaacctcagcagtaacaagctttggacagttccaaccaacatgccttccaaactgc atatcgtggacctgtctaataactcactgacacaaatccttccagggacattaataaacctgacaaatctcacacatctttacc tgcacaacaataaattcacattcattccagaacagtcttttgaccaacttttgcagttgcaagagataactcttcataataacag gtggtcatgtgaccataaacaaaacattacttacttattgaagtgggtgatggaaacg
    SEQ ID N0.3Nogo-N(555bp):
    atggaagacctggaccagtctcctctggtctcgtcctcggacagcccaccccggccgcagcccgcgttcaagtaccagtt cgtgagggagcccgaggacgaggaggaagaagaggaggaggaagaggaggacgaggacgaagacctggaggag ctggaggtgctggagaggaagcccgccgccgggctgtccgcggccccagtgcccaccgcccctgccgccggcgcgc ccctgatggacttcggaaatgacttcgtgccgccggcgccccggggacccctgccggccgctccccccgtcgccccgg agcggcagccgtcttgggacccgagcccggtgtcgtcgaccgtgcccgcgccatccccgctgtctgctgccgcagtctc gccctccaagctccctgaggacgacgagcctccggcccggcctccccctcctcccccggccagcgtgagcccccagg cagagcccgtgtggaccccgccagccccggctcccgccgcgcccccctccaccccggccgcgcccaagcgcagggg ctcctcgggctcagtg
    SEQ ID N0.4Nogo-66(198bp):
    aggatatacaagggtgtgatccaagctatccagaaatcagatgaaggccacccattcagggcatatctggaatctgaagtt gctatatctgaggagttggttcagaagtacagtaattctgctcttggtcatgtgaactgcacgataaaggaactcaggcgcct cttcttagttgatgatttagttgattctctgaag
    (二)根据目的序列分别设计如下PCR引物:
    MAGIg1:
    5’-CGGGATCCATGATATTCCTTACCACCCT-3’BamHI(SEQ ID N0.5)
    5’-TCCCCGCGGCTCGGTGTGCTCCCTGGAA-3’Sac II(SEQ ID N0.6)
    OMgp8:
    5’-GCGCCCGCGGCAACATGCACAGAGAGGCACAG-3’Sac II(SEQ ID  N0.7)
    5’-GGCGGCGGCCGCCGTTTCCATCACCCACTTC-3’Not I(SEQ ID N0.8)
    Nogo-N
    5’-TTGCGGCCGCAATGGAAGACCTGGACCAGTCT-3’Not I(SEQ ID  N0.9)
    5’-AAACTGCAGCCACTGAGCCCGAGGAGCCCCT-3’Pst I(SEQ ID N0.10)
    Nogo-66
    5’-AAACTGCAGCAAGGATATACAAGGGTGT-3’Pst I(SEQ ID N0.11)
    5’-GCTCTAGATCACTTCAGAGAATCAACTA-3’Xba I(SEQ ID N0.12)
    三、第一步:以大鼠、小鼠及人的cDNA为模板,分别扩增目的序列,扩 增体系如下:
    1.MAG的目的片段
    扩增体系1:

    使用以下PCR程序进行扩增:

    电泳回收约1524bp条带;
    2.OMgp的目的片段
    扩增体系2:

    使用以下PCR程序进行扩增:


    电泳回收约645bp条带;
    3.Nogo-N的目的片段
    扩增体系3:

    使用以下PCR程序进行扩增:

    电泳回收约556bp条带;
    4.Nogo-66的目的片段
    扩增体系:

    使用以下PCR程序进行扩增:

    电泳回收约199bp条带;
    第二步:分别酶切上述相应的电泳回收片段以得到带粘性末端的目的片段。
    1.用BamH I酶切回收MAGIgl的目的片段,酶切体系如下:


    37℃酶切1小时后再用Sac II进行酶切,酶切体系如下:

    37℃酶切1小时后过柱回收;
    2.用Sac II酶切回收0Mgp8的目的片段,酶切体系如下:

    37℃酶切1小时后再用Not I进行酶切,酶切体系如下:


    37℃酶切1小时后过柱回收;
    3.用Not I和Pst I双酶切回收的NogoN目的片段,酶切体系如下:

    37℃酶切1时后过柱回收;
    4.用Pst I和Xba I双酶切回收的Nogo-66目的片段,酶切体系如下:

    37℃酶切1小时后过柱回收;
    5.用BamH I和Xba I双酶切回收的pCDNA3.1载体,酶切体系如下:

    37℃酶切1小时后过柱回收;
    第三步、连接酶切后的所有片段及载体。
    连接体系:

    16℃连接8h后转化到感受态细胞DH5α。
    测序验证重组克隆中各插入片段的序列信息,以证实得到了本发明的DNA 疫苗。
    MAG的PCR上游引物包括一个ATG起始密码子,Nogo-66下游引物包含 一个终止密码子,随后被BamH I和Xba I两种限制性内切酶双酶切反应。四个 序列被顺序连接,插入pcDNA3.1载体。合成的质粒经过测序鉴定。
    实施例2:本发明DNA疫苗表达的鉴定
    为鉴定构建的DNA疫苗能否正确表达,DNA疫苗经瞬时转染入HEK-293 细胞里,48h后收集HEK-293细胞,经裂解液裂解后提取蛋白进行Westernblot 试验。只转染空质粒(vector)和没有转染任何质粒的细胞(mock)作为阴性对照。 抗MAG抗体和抗OMgp抗体都能检测到正确大小(150KDa)的条带,而在只转 染空质粒和没有转任何质粒的细胞样品中则检测不到任何条带。这些结果说明 DNA疫苗能够在真核系统里正确表达,亦再次证明本发明的疫苗在在构建上的 正确性。
    实施例3:用本发明DNA疫苗进行免疫后的结果
    用DNA疫苗免疫3个月龄或5个月龄的APP/PS1小鼠,每2周通过肌肉注 射免疫1次,连续免疫4个月。每次50μg,并通过电脉冲进行导入以增加免疫 原性。另外两组同年龄的APP/PS1小鼠以同样的方法被给予PBS、空质粒、及 编码eGFP质粒组注射。每周通过尾静脉采集外周血,采集血清进行免疫学检 测。用ELISA方法检测血清中抗MAG、Nogo-A和OMgp抗体的含量。免疫小 鼠血清中自免疫6周开始存在高滴度的抗MAG、OMgp和Nogo-A抗体。在本 发明中,计算在所有免疫了DNA疫苗的小鼠中,血清中产生MAG抗体的小鼠 的量计算对DNA疫苗反映阳性的阳性率,结果发现几乎所有的小鼠都会产生 MAG抗体。
    因此,本发明的DNA疫苗可以预防和治疗帕金森综合症??悸堑脚两鹕?合症和其它的中枢神经系统退行性病变在一些治病机制及病理发展中有许多相 似之处,如神经再生抑制,神经?;さ鹊?。该疫苗亦可以用于其它中枢神经系 统退行性病变的预防和治疗,如创伤性脑损伤、中风、脊髓损伤、脑肿瘤等。






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