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    一种 布氏菌病 治疗 制剂
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510124743.4

    申请日:

    2015.03.20

    公开号:

    CN104771753A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 39/10申请日:20150320|||公开
    IPC分类号: A61K39/10; A61K9/19; A61P31/04 主分类号: A61K39/10
    申请人: 中国食品药品检定研究院
    发明人: 魏东; 陈成; 李恪梅; 王国治
    地址: 100050北京市东城区天坛西里2号
    优先权:
    专利代理机构: 北京庆峰财智知识产权代理事务所(普通合伙)11417 代理人: 刘元霞
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510124743.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.11.17|||2015.08.12|||2015.07.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种治疗布氏菌病的治疗制剂,其含有布氏菌104M菌株。本发明还公开了布氏菌104M菌株在制备治疗布氏菌病的治疗制剂中的用途。本发明的治疗制剂可用于布氏菌感染的哺乳动物的免疫治疗。

    权利要求书

    1.  一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂,其特征在于,该制剂中含有 布氏菌104M菌株。

    2.
      如权利要求1所述的治疗制剂,其特征在于,所述治疗制剂为冻干制剂,在 冻干前每升中含有1×1011-5×1014个布氏菌,优选每升中含有约5×1011个布氏 菌。

    3.
      如权利要求2所述的治疗制剂,其特征在于,所述冻干制剂在冻干前每升 中还含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g,余量为 灭菌注射用水;优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖 约50g,余量为灭菌注射用水。

    4.
      布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂中的 应用。

    5.
      如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述治疗制剂通过皮内接种、鼻 腔接种、皮下接种或皮上划痕接种。

    6.
      如权利要求4或5所述的应用,其特征在于,所述哺乳动物为人、牛、羊、 犬或猪。

    7.
      如权利要求4-6所述的应用,其特征在于,所述治疗制剂为冻干制剂,在冻 干前每升中含有1×1011-5×1014个布氏菌,优选每升中含有约5×1011个布氏菌。

    8.
      如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述冻干制剂在冻干前每升中还 含有海藻糖40-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g,余量为灭菌 注射用水;优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g, 余量为灭菌注射用水。

    说明书

    一种布氏菌病治疗制剂
    技术领域
    本发明涉及一种布氏菌病治疗制剂,该制剂可用于哺乳动物布氏菌感染的 免疫治疗,属于治疗类生物制品生产技术领域。
    背景技术
    布鲁氏菌病(简称布氏菌病、布病)是由布鲁氏菌属引起的一类人畜共患 疾病??赏ü谇徽衬?、鼻腔、眼结膜、生殖道、甚至未损伤的皮肤而感染。 家畜感染后可引发母畜流产和不育,人感染则主要引起波浪热和转化为慢性感 染。据调查,全球已有170多个国家和地区有布病发生和流行。
    我国50~60年代在我国人畜中有较重流行,自70年代布病疫情逐年下降, 至90年代初人间感染率仅为0.3%,发病率只有0.02/10万。但自1993年布病 疫情出现了反弹,1996年全国发病率为0.09人/10万人,2013年发病率升为3.36 人/10万人。十几年间,发病率已经增加近40倍,2013年卫计委报告新发病人 数多达46,289人。这个现象与世界上部分地区的布病疫情遥相呼应。该状态 已引起世界和我国有关部门的关注。
    本病所累及的组织器官很广泛,但以单核—巨噬细胞系统、骨关节系统、 神经系统等常见。初期为炎性细胞渗出,组织细胞变性、坏死。亚急性和慢性 期为组织细胞增生,肝、脾、淋巴结等处能见增殖性结节和肉芽肿。慢性期部 分病人肉芽组织发生纤维硬化性变,临床则出现后遗症。
    目前,布病感染急性期要以抗菌治疗为主。常用抗生素有链霉素、四环素 族药物、磺胺类及TMP,另外氯霉素、利福平、氨苄青霉素也可使用。有些药 物治疗有复发情况,如果治疗不规范,如治疗剂量不足或疗程不够会出现慢性 感染。对慢性布病无特效药物治疗,只能以对症治疗为主。
    发明内容
    本发明人发现布氏菌104M菌株对患有布氏菌病的哺乳动物有良好的免疫 治疗效果。将小鼠用羊种M5弱毒菌株感染,感染1个月后给予布氏菌104M菌 株进行免疫治疗,治疗1个月后进行解剖分离脾脏活菌数,治疗组小鼠脾脏荷 菌数(log10)为2.98,未治疗对照组脾脏荷菌数(log10)为5.17,差异显著(P <0.05);治疗3个月后治疗组小鼠脾脏荷菌数均为0,未治疗对照组脾脏荷菌 数(log10)为1.94,差异明显。
    本发明提供了一种用于治疗哺乳动物布氏菌病的治疗制剂,该制剂中含有 布氏菌104M菌株。本发明还涉及布氏菌104M菌株在制备用于免疫治疗哺乳 动物布氏菌病的治疗制剂中的应用。
    本发明的治疗制剂为活疫苗,是冻干制剂,在冻干前,每升中含有 1×1011-5×1014个布氏菌,优选含有约5×1011个布氏菌。进一步,本发明的治 疗制剂中还含有冻干?;ぜ?,例如,在冻干前,每升中还含有海藻糖40-60g、 谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖40-60g,余量为灭菌注射用水;优选每升 疫苗中含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g,余量为 灭菌注射用水。
    本发明的治疗制剂优选通过皮内接种、鼻腔接种、皮下接种或皮上划痕接 种。优选哺乳动物为人、牛、羊、犬或猪。
    本发明的治疗制剂可以按照本领域已知的各种方法制备。例如,本发明的 冻干制剂的制备方法可以包括如下步骤:将布氏菌104M种子批传代培养,收 获时用冻干?;ぜ料聪戮蚬稳【τ诙掣杀;ぜ聊?,得原液;用冻干?;?剂将原液稀释至所需浓度,例如,1×1011-5×1014个/L,优选约5×1011个/L;分 装,例如,每安瓿含0.5ml(5次人用剂量);冻干,得成品。其中所使用的冻 干?;ぜ量梢悦可泻T逄?0-60g、谷氨酸钠4-6g、硫脲4-6g和蔗糖 40-60g,优选含有海藻糖约50g、谷氨酸钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g, 余量为灭菌注射用水。当然,也可以使用本领域已知的其他的冻干?;ぜ?。
    具体实施方式
    实施例1、菌种检定
    1.1菌体培养:取一支保存的104M菌株(CMCC55010),接种于TSA中 管斜面培养基,35~37℃培养44~48小时;
    1.2变异检查检查:
    1.2.1热凝集试验:用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为2.5×109个/ml 的菌悬液,置90℃水浴中30分钟,观察有无凝集现象。
    1.2.2三胜黄素试管凝集试验:取浓度为2.5×109个/ml的菌悬液,与1∶1000 三胜黄素水溶液等量混合,于37℃放24小时,观察有无凝集现象。
    1.2.3结晶紫染色检查:用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为1×103个 /ml的菌悬液,接种TSA平皿,每平皿0.1ml,共接种2个平皿,35~37℃培养 5天,然后用结晶紫菌落染色法检查,计算阳性率。
    1.3培养特性:用无菌生理盐水将新鲜培养物制成浓度为1×109个/ml的菌 悬液,分别接种在含有1∶50000碱性复红TSA中管斜面培养基及1∶50000硫 堇TSA中管斜面培养基上观察生长情况;另外,取菌液接种于TS A中管斜面 培养基,加入醋酸铅试纸条,观察有无硫化氢产生。
    1.4分子生物学检查:取菌液提取基因组,进行16sRNA基因序列测定。
    1.5结果:
    粗造型特性检查结果见下表1,培养特性检查结果见下表2,16sRNA基因 序列比对表明104M菌株与布氏标准菌株序列完全一致。因此,所使用的104M 菌株具有典型布氏菌的培养特性及分子生物学特征。
    表1

    表2

    实施例2、半数致死量(LD50)测定
    1.1菌体培养:取一支保存的104M菌株,接种于TSA中管斜面培养基,35~ 37℃培养44~48小时;
    1.2菌液制备:用无菌生理盐水将新鲜培养物制成菌悬液,并稀释至7.5×108个/ml、1.5×109个/ml、3.0×109个/ml、6.0×109个/ml、1.2×1010个/ml、2.4×1010个/ml、4.8×1010个/ml、9.6×1010个/ml等浓度。取体重18~20g小鼠,随机分组, 每组5只,各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射,每只0.5ml,观察7天,根 据存活数量计算LD50。
    1.3结果:本发明菌株注射小鼠,半数致死量为2.2×109个菌,符合2010年 版《中华人民共和国药典》三部规定。
    实施例3、治疗制剂制备
    1.1第一代菌体培养:取一支保存的104M菌株接种于TSA中管斜面培养 基,35~37℃培养44~48小时,为第一代;
    1.2第二代菌体培养:取第一代培养的104M菌株,转种于TSA中管斜面 培养基,35~37℃培养44~48小时,为第二代;
    1.3第三代菌体培养:取第二代培养的104M菌株,转种于TSA中管斜面 培养基,35~37℃培养44~48小时,为第三代;
    1.4收获:用冻干?;ぜ?每升冻干?;ぜ林泻校汉T逄窃?0g、谷氨酸 钠约5g、硫脲约5g和蔗糖约50g,余量为灭菌注射用水)收集第三代培养 物,进行纯菌检查,合格后用冻干?;ぜ料∈椭僚ǘ任?×108个/ml,得半成品; 将半成品分装成每安瓿含0.5ml(5次人用剂量),冻干封口为成品。
    实施例4、治疗效果研究
    1.1感染:取20只6-8周雌性BALB/C小鼠,体重18-22g,随机分成2组, 分别为本发明制剂治疗组及生理盐水对照组,所有动物均经皮下攻击羊种布氏 菌M5弱毒株,攻击剂量为5×108CFU/只。
    1.2治疗:感染后28天,治疗组经皮内接种本发明制剂(0.5×108个/只), 生理盐水对照组经皮内给予同等剂量的生理盐水。
    1.3解剖:分别在治疗后1个月及3个月,每组各取5只动物处死后无菌取 脾脏,通过脾脏细菌计数评价制剂的治疗效果。
    1.4结果:
    感染1个月后用本发明的制剂进行免疫治疗,治疗1个月后进行解剖分离 脾脏活菌数,治疗组小鼠脾脏荷菌数(log10)为2.98,未治疗对照组脾脏荷菌 数(log10)为5.17,差异显著(P<0.05);治疗3个月后治疗组小鼠脾脏荷菌 数均为0,未治疗对照组脾脏荷菌数(log10)为1.94,差异明显。具体结果见下 表3和表4。
    表3 治疗后1个月结果

      发明制剂治疗组 生理盐水对照组 1 1.70 5.18 2 3.14 5.32 3 3.62 5.41 4 2.30 5.11 5 4.12 4.80 均值 2.98 5.17 标准差 0.98 0.24

    表4 治疗后3个月结果
      发明制剂治疗组 生理盐水对照组 1 0 2.52 2 0 1.00 3 0 1.48 4 0 2.58 5 0 2.11 均值 0 1.94 标准差 / 0.68

    综合上述数据可以看出,本发明的治疗制剂对已感染布氏菌的动物的具有 较好的免疫治疗效果?!  ∧谌堇醋宰ɡ鴚ww.www.4mum.com.cn转载请标明出处

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