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    重庆时时彩开到几点: 一种黄金甲组织培养的培养基及方法.pdf

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    一种 黄金 组织培养 培养基 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610984860.2

    申请日:

    20161109

    公开号:

    CN106508680A

    公开日:

    20170322

    当前法律状态:

    有效性:

    有效

    法律详情:
    IPC分类号: A01H4/00 主分类号: A01H4/00
    申请人: 河南红枫种苗股份有限公司
    发明人: 张丹,张茂,何甜甜,郭冠男,孟伟芳
    地址: 450000 河南省郑州市金水区杨金路中段牛顿国际A座13层
    优先权: CN201610984860A
    专利代理机构: 北京集佳知识产权代理有限公司 代理人: 赵青朵
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610984860.2

    授权公告号:

    法律状态公告日:

    法律状态类型:

    摘要

    本发明涉及组织培养技术领域,特别涉及一种黄金甲组织培养的培养基及方法。该培养基包括初代培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基。采用本发明提供的培养基配方可显著提高黄金甲的繁殖系数,缩短繁殖周期,提高成活率,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径。

    权利要求书

    1.一种黄金甲组织培养的培养基,其特征在于,包括初代培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基;所述初代培养基为:含有0.05~0.2mg/LKT、0.06~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、12~18mL/L大蒜汁和8~11mL/L椰汁的WPM培养基,pH值为5.9;所述第一继代培养基为:含有0.5~2mg/LKT、0.01~0.1mg/LTDZ、0.02~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL~150mL/L番茄汁和15mL~25mL/L香蕉汁的WPM培养基,pH值为5.9;所述第二继代培养基为:含有0.1~0.7mg/LKT、0.05~0.2mg/LGA、0.04~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基,pH值为5.9;所述生根培养基为:含有5~7g/L琼脂和15~25g/L蔗糖的WPM培养基,pH值为5.9。2.根据权利要求1所述的培养基,其特征在于,所述初代培养基为:含有0.1mg/LKT、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、15mL/L大蒜汁和10mL/L椰汁的WPM培养基;所述第一继代培养基为:含有0.5mg/LKT、0.01mg/LTDZ、0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mL/L番茄汁和20mL/L香蕉汁的WPM培养基;所述第二继代培养基为:含有0.3mg/LKT、0.05mg/LGA、0.04mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基;所述生根培养基为:含有7g/L琼脂和20g/L蔗糖的WPM培养基。3.一种黄金甲的组织培养方法,其特征在于,包括如下步骤:将黄金甲外植体接种到初代培养基进行初代培养,得到芽眼开始萌动的外植体;将芽眼开始萌动的外植体转接到第一继代培养基进行第一次继代培养,得到芽眼分化完成的外植体;将芽眼分化完成的外植体转接到第二继代培养基进行第二次继代培养,得到丛生芽;将丛生芽转接到生根培养基进行生根培养,得到组培苗;所述初代培养基为:含有0.05~0.2mg/LKT、0.06~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、12~18mL/L大蒜汁和8~11mL/L椰汁的WPM培养基,pH值为5.9;所述第一继代培养基为:含有0.5~2mg/LKT、0.01~0.1mg/LTDZ、0.02~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL~150mL/L番茄汁和15mL~25mL/L香蕉汁的WPM培养基,pH值为5.9;所述第二继代培养基为:含有0.1~0.7mg/LKT、0.05~0.2mg/LGA、0.04~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基,pH值为5.9;所述生根培养基为:含有5~7g/L琼脂和15~25g/L蔗糖的WPM培养基,pH值为5.9。4.根据权利要求3所述的组织培养方法,其特征在于,所述将黄金甲外植体接种到初代培养基进行初代培养之前还包括:采取黄金甲的带芽一年生健康枝条,去掉叶片保留叶柄,进行消毒处理,然后切成有一对芽或一个顶芽的长0.5~1.0cm小段。5.根据权利要求3或4所述的组织培养方法,其特征在于,所述黄金甲的带芽一年生健康枝条的采取时间为每年5~6月。6.根据权利要求4或5所述的组织培养方法,其特征在于,所述消毒处理具体为:将去掉叶片的黄金甲枝条用水和NaClO溶液清洗,然后用酒精和氯化汞溶液消毒,再用水清洗。7.根据权利要求6所述的组织培养方法,其特征在于,所述NaClO溶液的质量百分浓度0.1%;所述酒精的体积百分浓度为75%,酒精消毒的时间为20s;所述氯化汞溶液的质量百分浓度为0.1%,氯化汞溶液的消毒时间为5min。8.根据权利要求3至7中任一项所述的组织培养方法,其特征在于,所述黄金甲组织培养的光照周期为12h/d,光照强度为3500lx,培养温度为25℃,相对湿度为48%。9.根据权利要求3至8中任一项所述的组织培养方法,其特征在于,所述得到组培苗后还包括炼苗的步骤。10.根据权利要求9所述的组织培养方法,其特征在于,所述炼苗为:将组培苗打开瓶盖通风2d,洗掉根部附着的培养基,晾干水分后栽植至培养土中,喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液,放置背光处,覆膜保湿,保持温度在15~20℃之间;待长出新叶后将苗挪至向阳处,并逐渐去掉覆膜,30~50d后转入正常养护。

    说明书

    技术领域

    本发明涉及组织培养技术领域,特别涉及一种黄金甲组织培养的培养基及方法。

    背景技术

    黄金甲为卫矛科卫矛属北海道黄杨(Euonymus japonicus cv."Cu Zhi")的变异品种,其叶片两边金黄,中间翠绿,因此得名?;平鸺字晷徒舸?,色泽鲜艳,并继承了北海道黄杨的耐寒抗性好的特点,是北方缺乏的彩色不落叶植物?;平鸺字绷⑿郧?、萌蘖能力强、移栽成活率高,容易养护,可培养为绿篱、圆球、绿墙等各种造型使用,是具有很大市场潜力的园林树种。目前,黄金甲主要靠嫁接进行繁殖,费时费力,而且繁殖系数较低,成活率较低,远不能满足国内对种苗的需求。

    组织培养技术是在无菌的条件下将活器官、组织或细胞置于培养基内,并放在适宜的环境中,进行连续培养而成的细胞、组织或个体。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。近年来,组织培养技术逐渐应用到园林树种的繁殖方面,并开始代替传统的叶插、分株等繁殖方法。但针对黄金甲的组织培养技术还未有报道,目前只有关于北海道黄杨的组织培养技术的报道。

    周鑫于2004年在《北海道黄杨组织培养育苗的研究》一文中报道了一种适合北海道黄杨的组培技术,具体为:外殖体灭菌采用0.1%升汞加吐温-80灭菌8~10min,无菌水冲洗6~8次;促进休眠芽萌发的培养基以MS为基本培养基,细胞分裂素可以用BA或KT,浓度为1.0mg/L,生长素可以用NAA或IBA,浓度为0.1mg/L;扩大繁殖培养基以MS为基本培养基,细胞分裂素用BA或KT,浓度0.1mg/L,生物素NAA或IBA,浓度在0.5~1.0mg/L。

    专利号为CN102293150A的专利公开了一种金叶黄杨的组织培养方法,包括:将小芽基部切成1cm长接种于小芽诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L上,培养1个月后切下带芽愈伤组织放入增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L进行培养,将丛生芽放入壮苗培养基MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.1mg/L上进行培养,待长至2~3cm转接入生根培养基。

    但上述两种组织培养方法并不适合黄金甲的培养,采用上述两种方法进行黄金甲的组织培养,其繁殖系数和成活率较低。因此需要研发一种适合黄金甲的组培快繁技术。

    发明内容

    有鉴于此,本发明提供了一种黄金甲组织培养的培养基及方法。采用本发明提供的培养基配方可显著提高黄金甲的繁殖系数,缩短繁殖周期,提高成活率,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径。

    为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:

    本发明提供了一种黄金甲组织培养的培养基,包括初代培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基;

    初代培养基为:含有0.05~0.2mg/L KT、0.06~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、12~18mL/L大蒜汁和8~11mL/L椰汁的WPM培养基,pH值为5.9;

    第一继代培养基为:含有0.5~2mg/L KT、0.01~0.1mg/L TDZ、0.02~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL~150mL/L番茄汁和15mL~25mL/L香蕉汁的WPM培养基,pH值为5.9;

    第二继代培养基为:含有0.1~0.7mg/L KT、0.05~0.2mg/L GA3、0.04~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基,pH值为5.9;

    生根培养基为:含有5~7g/L琼脂和15~25g/L蔗糖的WPM培养基,pH值为5.9。

    采用本发明提供的培养基配方可显著提高黄金甲的繁殖系数,缩短繁殖周期,提高成活率,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径。

    优选地,初代培养基为:含有0.1mg/L KT、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、15mL/L大蒜汁和10mL/L椰汁的WPM培养基;

    第一继代培养基为:含有0.5mg/L KT、0.01mg/L TDZ、0.02mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mL/L番茄汁和20mL/L香蕉汁的WPM培养基;

    第二继代培养基为:含有0.3mg/L KT、0.05mg/L GA3、0.04mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基;

    生根培养基为:含有7g/L琼脂和20g/L蔗糖的WPM培养基。

    本发明中采用的大蒜汁、椰汁、番茄汁和香蕉汁采用过滤除菌的方式进行除菌,既保持了天然添加物的生物活性,又能够有效除菌。

    本发明还提供了一种黄金甲的组织培养方法,包括如下步骤:

    将黄金甲外植体接种到初代培养基进行初代培养,得到芽眼开始萌动的外植体;

    将芽眼开始萌动的外植体转接到第一继代培养基进行第一次继代培养,得到芽眼分化完成的外植体;

    将芽眼分化完成的外植体转接到第二继代培养基进行第二次继代培养,得到丛生芽;

    将丛生芽转接到生根培养基进行生根培养,得到组培苗;

    初代培养基为:含有0.05~0.2mg/L KT、0.06~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、12~18mL/L大蒜汁和8~11mL/L椰汁的WPM培养基,pH值为5.9;

    第一继代培养基为:含有0.5~2mg/L KT、0.01~0.1mg/L TDZ、0.02~0.2mg/LNAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL~150mL/L番茄汁和15mL~25mL/L香蕉汁的WPM培养基,pH值为5.9;

    第二继代培养基为:含有0.1~0.7mg/L KT、0.05~0.2mg/L GA3、0.04~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基,pH值为5.9;

    生根培养基为:含有5~7g/L琼脂和15~25g/L蔗糖的WPM培养基,pH值为5.9。

    本发明解决了传统的繁殖方法中存在的繁殖系数低、成活率低的问题,利用组培技术进行黄金甲的快繁,既保持黄金甲的优良性状,又大大提高其繁殖系数,缩短繁殖周期,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径。

    同时,本发明首次对黄金甲的取材及消毒方法进行了改进,降低了初代接种的污染率。

    在本发明提供的实施例中,将黄金甲外植体接种到初代培养基进行初代培养之前还包括:采取黄金甲的带芽一年生健康枝条,去掉叶片保留叶柄,进行消毒处理,然后切成有一对芽或一个顶芽的长0.5~1.0cm小段。

    作为优选,黄金甲的带芽一年生健康枝条的采取时间为每年5~6月。

    在本发明提供的实施例中,消毒处理具体为:将去掉叶片的黄金甲枝条用水和NaClO溶液清洗,然后用酒精和氯化汞溶液消毒,再用水清洗。

    作为优选,NaClO溶液的质量百分浓度0.1%;酒精的体积百分浓度为75%,酒精消毒的时间为20s;氯化汞溶液的质量百分浓度为0.1%,氯化汞溶液的消毒时间为5min。

    作为优选,黄金甲组织培养的光照周期为8~12h/d,光照强度为2500~3500lx,培养温度为24~26℃,相对湿度为45%~50%。

    在本发明提供的实施例中,黄金甲组织培养的光照时间12h/d,光照强度3500lx,培养温度为25℃,相对湿度48%,每3d用紫外灯灭菌30min。

    在本发明提供的实施例中,得到组培苗后还包括炼苗的步骤。

    在本发明提供的实施例中,炼苗为:将组培苗打开瓶盖通风2d,洗掉根部附着的培养基,晾干水分后栽植至培养土中,喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液,放置背光处,覆膜保湿,保持温度在15~20℃之间;待长出新叶后将苗挪至向阳处,并逐渐去掉覆膜,30~50d后转入正常养护。

    在本发明提供的实施例中,炼苗过程中培养土为泥炭、珍珠岩与蛭石的质量比为1:1:1的培养土。

    本发明提供了一种黄金甲组织培养的培养基及方法。该培养基包括初代培养基、第一继代培养基、第二继代培养基和生根培养基;初代培养基为:含有0.05~0.2mg/L KT、0.06~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、12~18mL/L大蒜汁和8~11mL/L椰汁的WPM培养基,pH值为5.9;第一继代培养基为:含有0.5~2mg/L KT、0.01~0.1mg/L TDZ、0.02~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、50mL~150mL/L番茄汁和15mL~25mL/L香蕉汁的WPM培养基,pH值为5.9;第二继代培养基为:含有0.1~0.7mg/L KT、0.05~0.2mg/L GA3、0.04~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、7g/L琼脂的WPM培养基,pH值为5.9;生根培养基为:含有5~7g/L琼脂和15~25g/L蔗糖的WPM培养基,pH值为5.9。本发明至少具有如下优势之一:

    采用本发明提供的培养基配方可显著提高黄金甲的繁殖系数,缩短繁殖周期,提高成活率,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径;

    本发明首次对黄金甲的取材及消毒方法进行了改进,降低了初代接种的污染率。

    具体实施方式

    本发明公开了一种黄金甲组织培养的培养基及方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。

    本发明提供的黄金甲组织培养的培养基及方法中所用培养基组分均可由市场购得。其中,大蒜汁、椰汁、番茄汁、香蕉汁均为榨汁原液。

    下面结合实施例,进一步阐述本发明:

    实施例1黄金甲的组织培养

    1.生长环境

    (1)采用固体WPM培养基,所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌,126℃下5min。

    (2)组培室,光照时间12h/d,光照强度3500lx,培养温度为25℃,相对湿度48%,每3d用紫外灯灭菌30min。

    2.外植体的处理

    (1)每年5~6月期间采取生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段作为外植体。

    (2)采集完成后,先去掉叶片保留叶柄,然后用纱布包好放自来水下流水冲洗2h。

    (3)用软毛刷蘸取含有0.1%NaClO的溶液清洗外植体。

    (4)在超净工作台内依次用75%酒精消毒20s、0.1%HgCl消毒5min,注:消毒液的使用次数不超过10次,达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存,以免失效。

    (5)消毒完成后用无菌水清洗6遍,每次不少于3min。

    (6)清洗完成后,在超净工作台内,用手术刀和镊子将外植体切成有一对芽或一个顶芽的长0.5-1.0cm小段待用。

    3.初代培养

    (1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

    (2)接种前用75%的酒精喷洒消毒。

    (3)在超净工作台内,将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

    (4)将清洗好的外植体用手术刀切掉底部1-2mm,接种到分装好的初代培养基中:WPM+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH 5.9。

    (5)培养10d后芽眼开始萌动,成活率达到95%。

    4.第一次继代培养

    (1)选取芽眼已萌动的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的继代培养基:WPM+0.5mg/L KT+0.01mg/L TDZ+0.02mg/L NAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)30d芽眼分化完成。

    5.第二次继代培养

    (1)选取第一次继代培养中芽眼分化完成的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的培养基:WPM+0.3mg/L KT+0.05mg/L GA3+0.04mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)15d丛生芽显著长大,节间伸长1.5~2cm,繁殖系数6.07。

    6.生根培养

    (1)选取继代培养2中丛生芽长大至3-4cm,包含2对以上侧芽的小苗。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心夹出将其放在接种盘上,用手术刀切下带芽的茎段,接入生根培养基:WPM+7g/L琼脂+20g/L蔗糖,pH 5.9。

    (3)30d后无根枝条茎段下部长出4~7条须根。

    7.炼苗

    (1)选取生长健壮,根系发达的组培苗,先打开瓶盖通风2d,使小苗逐渐适应外界环境。

    (2)小心取出,不要伤到根系,清水冲洗干净根部附着的培养基。

    (3)晾干水分后,栽植至灭菌过的培养土内。培养土按泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的比例进行配置。

    (4)栽植后喷施适量浓度多菌灵和代锌蒙森混合液,放置背光处,覆膜保湿,保持温度在15-20℃之间,约20d后,新根长出。

    (5)芽眼开始抽出新叶,说明炼苗已经成活,可将苗挪至向阳处,并逐渐去掉覆膜,使苗适应外界环境。

    (6)35d即可转入正常养护。如果发生烂苗或者真菌蔓延,则要及时挖掉死苗及周围土壤,然后喷施高浓度多菌灵进行防治,以免影响其它幼苗成活。

    实验结果显示:在初代培养中加入15ml的大蒜汁所接种材料的成活率达到95%,10d芽眼开始萌动,第一次继代培养基中加入0.5mg/L KT、0.01mg/L TDZ、0.02mg/L NAA、100mL/L番茄汁、20mL/L香蕉汁,30d芽眼完成分化,第二次继代培养基中加入0.3mg/L KT、0.05mg/L GA3、0.04mg/L NAA,15d丛生芽显著长大,节间伸长,生根培养不添加激素只添加7g/L琼脂、20g/L蔗糖,30d后无根枝条茎段下部长出4~7条须根。

    实施例2黄金甲的组织培养

    1.生长环境

    (1)采用固体WPM培养基,所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌,126℃下5min。

    (2)组培室,光照时间12h/d,光照强度3500lx,培养温度为25℃,相对湿度48%,每3d用紫外灯灭菌30min。

    2.外植体的处理

    (1)每年5~6月期间采取生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段作为外植体。

    (2)采集完成后,先去掉叶片保留叶柄,然后用纱布包好放自来水下流水冲洗2h。

    (3)用软毛刷蘸取含有0.1%NaClO的溶液清洗外植体。

    (4)在超净工作台内依次用75%酒精消毒20s、0.1%HgCl消毒5min,注:消毒液的使用次数不超过10次,达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存,以免失效。

    (5)消毒完成后用无菌水清洗6遍,每次不少于3min。

    (6)清洗完成后,在超净工作台内,用手术刀和镊子将外植体切成有一对芽或一个顶芽的长0.5-1.0cm小段待用。

    3.初代培养

    (1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

    (2)接种前用75%的酒精喷洒消毒。

    (3)在超净工作台内,将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

    (4)将清洗好的外植体用手术刀切掉底部1-2mm,接种到分装好的培养基中。初代培养基为:WPM+0.2mg/L KT+0.06mg/L NAA+12mL/L大蒜汁+8mL/L椰汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (5)培养20d后芽眼开始萌动,成活率为75.8%。

    4.第一次继代培养

    (1)选取芽眼已萌动的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的培养基中。第一次继代培养的培养基为WPM+2mg/L KT+0.1mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+15mL/L香蕉汁+50ml/L番茄汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)50d芽眼分化完成。

    5.第二次继代培养

    (1)选取第一次继代培养中芽眼分化完成的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的培养基中。第二次继代培养的培养基为:WPM+0.1mg/L KT+0.1mg/L GA3+0.15mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)30d丛生芽显著长大,节间伸长3~4cm,繁殖系数0.51。

    6.生根培养

    (1)选取继代培养2中丛生芽长大至3-4cm,包含2对以上侧芽的小苗。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心夹出将其放在接种盘上,用手术刀切下带芽的茎段,接入生根培养基中。生根培养基为:WPM+5g/L琼脂+15g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)45d后无根枝条茎段下部长出1~2条须根。

    7.炼苗

    (1)选取生长健壮,根系发达的组培苗,先打开瓶盖通风2d,使小苗逐渐适应外界环境。

    (2)小心取出,不要伤到根系,清水冲洗干净根部附着的培养基。

    (3)晾干水分后,栽植至灭菌过的培养土内。培养土按泥炭:珍珠岩:蛭石=1:1:1的比例进行配置。

    (4)栽植后喷施适量浓度多菌灵和代锌蒙森混合液,放置背光处,覆膜保湿,保持温度在15-20℃之间,约20d后,新根长出。

    (5)芽眼开始抽出新叶,说明炼苗已经成活,可将苗挪至向阳处,并逐渐去掉覆膜,使苗适应外界环境。

    (6)40d即可转入正常养护。如果发生烂苗或者真菌蔓延,则要及时挖掉死苗及周围土壤,然后喷施高浓度多菌灵进行防治,以免影响其它幼苗成活。

    实验结果显示:在初代培养中加入12ml的大蒜汁所接种材料的成活率是75.8%,20d芽眼开始萌动,第一次继代培养基中加入2mg/L KT、0.1mg/L TDZ、0.2mg/L NAA、15mL/L香蕉汁、50mL/L番茄汁,50d芽眼完成分化,第二次继代培养基中加入0.1mg/L KT、0.1mg/L GA3、0.15mg/L NAA,30d丛生芽显著长大,节间伸长,生根培养不添加激素只添加5g/L琼脂、15g/L蔗糖,45d后无根枝条茎段下部长出1~2条须根。

    实施例3黄金甲的组织培养

    1.生长环境

    (1)采用固体WPM培养基,所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌,126℃下5min。

    (2)组培室,光照时间12h/d,光照强度3500lx,培养温度为25℃,相对湿度48%,每3d用紫外灯灭菌30min。

    2.外植体的处理

    (1)每年5~6月期间采取生长健康无病虫害幼嫩带芽的茎段作为外植体。

    (2)采集完成后,先去掉叶片保留叶柄,然后用纱布包好放自来水下流水冲洗2h。

    (3)用软毛刷蘸取含有0.1%NaClO的溶液清洗外植体。

    (4)在超净工作台内依次用75%酒精消毒20s、0.1%HgCl消毒5min,注:消毒液的使用次数不超过10次,达到后倒掉重新配置。氯化汞要求避光保存,以免失效。

    (5)消毒完成后用无菌水清洗6遍,每次不少于3min。

    (6)清洗完成后,在超净工作台内,用手术刀和镊子将外植体切成有一对芽或一个顶芽的长0.5-1.0cm小段待用。

    3.初代培养

    (1)打开超净工作台紫外灯杀菌15min。

    (2)接种前用75%的酒精喷洒消毒。

    (3)在超净工作台内,将手术刀、镊子、接种盘用酒精灯充分消毒。

    (4)将清洗好的外植体用手术刀切掉底部1-2mm,接种到分装好的培养基中。初代培养基为:WPM+0.05mg/L KT+0.2mg/L NAA+18mL/L大蒜汁+11mL/L椰汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (5)培养20d后芽眼开始萌动,成活率为86.2%。

    4.第一次继代培养

    (1)选取芽眼已萌动的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的培养基中。第一次继代培养的培养基为WPM+1mg/L KT+0.1mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+25mL/L香蕉汁+150ml/L番茄汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)50d芽眼分化完成。

    5.第二次继代培养

    (1)选取第一次继代培养中芽眼分化完成的外植体。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心将外植体夹出,转接到分装好的培养基中。第二次继代培养的培养基为:WPM+0.7mg/L KT+0.2mg/L GA3+0.2mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)26d丛生芽显著长大,节间伸长4—5cm,繁殖系数为1.18。

    6.生根培养

    (1)选取继代培养2中丛生芽长大至3-4cm,包含2对以上侧芽的小苗。

    (2)在超净工作台内,用镊子小心夹出将其放在接种盘上,用手术刀切下带芽的茎段,接入生根培养基中。生根培养基为:WPM+7g/L琼脂+25g/L蔗糖,pH5.9。

    (3)30d后无根枝条茎段下部长出2~3条须根。

    7.炼苗

    (1)选取生长健壮,根系发达的组培苗,先打开瓶盖通风2d,使小苗逐渐适应外界环境。

    (2)小心取出,不要伤到根系,清水冲洗干净根部附着的培养基。

    (3)晾干水分后,栽植至灭菌过的培养土内。培养土按泥炭:珍珠岩:蛭石=1∶1∶1的比例进行配置。

    (4)栽植后喷施适量浓度多菌灵和代锌蒙森混合液,放置背光处,覆膜保湿,保持温度在15-20℃之间,约20d后,新根长出。

    (5)芽眼开始抽出新叶,说明炼苗已经成活,可将苗挪至向阳处,并逐渐去掉覆膜,使苗适应外界环境。

    (6)50d即可转入正常养护。如果发生烂苗或者真菌蔓延,则要及时挖掉死苗及周围土壤,然后喷施高浓度多菌灵进行防治,以免影响其它幼苗成活。

    实验结果显示:在初代培养中加入18ml的大蒜汁所接种材料的成活率是86.2%,20d芽眼开始萌动,第一次继代培养基中加入1mg/L KT、0.1mg/L TDZ、0.1mg/L NAA、25mL/L香蕉汁、150ml/L番茄汁,50d芽眼分化完成,第二次继代培养基中加入0.7mg/L KT、0.2mg/L GA3、0.2mg/L NAA,26d丛生芽显著长大,节间伸长,生根培养不添加激素只添加7g/L琼脂、25g/L蔗糖,30d无根枝条茎段下部长出2~3条须根。

    试验例1

    外植体采集时间的确认,从3月1日开始到7月31日进行连续接种试验,以下是黄金甲接种后第10天的染菌情况:

    表1黄金甲接种后第10天的染菌情况

    时间 染菌率 时间 染菌率 时间 染菌率 3/1—3/10 20% 4/21—4/30 23% 6/11—6/20 5% 3/11—3/20 25% 5/1—5/10 8% 6/21—6/30 8% 3/21—3/31 20% 5/11—5/20 6% 7/1—7/10 25% 4/1—4/10 29% 5/21—5/31 8% 7/11—7/20 30% 4/11—4/20 21% 6/1—6/10 9% 7/21—7/30 35%

    从表1中可以看出,在5月1日到6月30日这期间的黄金甲带腋芽的径段接种后,染菌率在10%以下,且通过观察,接种后材料生长快,且后期生长良好。

    本发明是通过以下培养基配方筛选出最适合初代培养的激素组合,具体操作如表2:

    表2初代培养基筛选的处理

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 KT(mg/L) 0 0.2 0.05 0.1 NAA(mg/L) 0 0.06 0.2 0.1 大蒜汁(mL/L) 0 12 18 15 椰汁(mL/L) 0 8 11 10

    说明:其中,对照CK和3个处理的基本培养基为WPM培养基;对照CK为不添加激素KT和NAA,以及天然添加物大蒜汁和椰汁。

    试验结果见表3:

    表3初代培养基的成活率

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 成活率(%) 36.7 75.8 86.2 95

    可见,处理3中材料成活率达95%。处理3WPM+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9,为黄金甲最适合的初代培养基。

    本发明是通过以下培养基配方筛选出最适合第一次继代培养的激素组合,具体操作如表4:

    表4第一次继代培养的培养基筛选的处理

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 KT(mg/L) 0 2 1 0.5 TDZ(mg/L) 0 0.1 0.1 0.01 NAA(mg/L) 0 0.2 0.1 0.02 香蕉汁(mL/L) 0 15 25 20 番茄汁(mL/L) 0 50 150 100

    说明:其中,对照CK和3个处理的基本培养基为WPM培养基;对照CK为不添加激素KT、TDZ和NAA,以及天然添加物番茄汁和香蕉汁。

    试验结果见表5:

    表5第一次继代培养各处理的生长情况

    项目 CK 处理1 处理2 处理3 芽眼分化 少数分化 少数分化 少数分化 已分化 叶色 绿 玻璃化 玻璃化 嫩绿

    可见,处理3中的材料生长最好,芽眼分化最快,处理1和处理2中的NAA容易引起材料玻璃化,死亡。通过对比处理3WPM+0.5mg/L KT+0.01mg/L TDZ+0.02mg/L NAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9,为最适合培养基。

    本发明是通过以下培养基配方筛选出最适合第二次继代培养的激素组合,具体操作如表6:

    表6第二次继代培养的培养基筛选的处理

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 KT(mg/L) 0 0.1 0.7 0.3 GA3(mg/L) 0 0.1 0.2 0.05 NAA(mg/L) 0 0.15 0.2 0.04

    说明:其中,对照CK和3个处理的基本培养基为WPM培养基;对照CK为不添加激素KT、GA3和NAA。

    试验结果见表7:

    表7第二次继代培养的生长情况

    可见,处理3中材料的丛生芽生长显著,处理2中GA3导致节间过长,茎段变细。通过对比处理3WPM+0.3mg/L KT+0.05mg/L GA3+0.04mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖,pH5.9,为最适合培养基。

    生根培养基的3个筛选处理:WPM+5~7g/L琼脂+15~25g/L蔗糖。

    表8生根培养的培养基筛选的处理

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 琼脂 7 5 7 6 蔗糖 30 15 25 20

    说明:其中,对照CK和3个处理的基本培养基为WPM培养基。

    试验结果见表9:

    表9生根培养的生长情况

    组分 CK 处理1 处理2 处理3 生根情况(条) 1—2 1—2 2—3 4—7 叶片颜色 泛黄 泛黄 绿 绿

    可见,处理3中组培苗生根最快,最多。处理3:WPM+无激素+7g/L琼脂+20g/L蔗糖。

    利用本技术既保持黄金甲的优良性状,又大大提高其繁殖系数,缩短繁殖周期,为黄金甲的产业化生产提供了更加有效的途径。

    对比例1

    采用专利号为CN102293150A的专利中公开的金叶黄杨的培养基对黄金甲进行组织培养,除培养基不同外其它条件相同。对照培养基包括:诱导培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L、增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L、壮苗培养基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。

    1、初代培养

    试验组:WPM+0.1mg/L KT+0.1mg/L NAA+15mL/L大蒜汁+10mL/L椰汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖。

    对照组:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

    试验结果显示:

    表10初代培养成活率结果

    组别 成活率% 试验组 95 对照组 46.3

    2、第一次继代培养

    试验组:WPM+0.5mg/L KT+0.01mg/L TDZ+0.02mg/L NAA+100mL/L番茄汁+20mL/L香蕉汁+7g/L琼脂+30g/L蔗糖。

    对照组:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

    试验结果显示:

    表11继代培养生长情况

    组别 芽眼分化 叶色 试验组 已分化 嫩绿 对照组 未分化 无

    3、第二次继代培养

    试验组:WPM+0.1mg/L KT+0.1mg/L GA3+0.15mg/L NAA+7g/L琼脂+30g/L蔗糖

    对照组:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。

    试验结果显示:

    表12第二次继代培养增殖系数结果

    组别 增殖系数 试验组 6.07 对照组 0.86

    4、生根培养

    试验组:WPM+7g/L琼脂+20g/L蔗糖。

    对照组:MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。

    试验结果显示:

    表13生根培养结果

    组别 生根情况(条) 试验组 4~7 对照组 无

    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的?;し段?。

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