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    重庆时时彩开奖直播87: 发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用.pdf

    关 键 词:
    发色团 修饰 脱氧 核苷 亚磷酰胺 单体 化合物 及其 制备 方法 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510836634.5

    申请日:

    2015.11.25

    公开号:

    CN105348343A

    公开日:

    2016.02.24

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07H 19/10申请日:20151125|||公开
    IPC分类号: C07H19/10; C07H1/00; C07H21/04; C07F9/22; C07F9/576; C09K11/06; C12Q1/68; C12N15/11 主分类号: C07H19/10
    申请人: 北京大学
    发明人: 汤新景; 李鹏飞; 王志轩
    地址: 100871北京市海淀区颐和园路5号
    优先权:
    专利代理机构: 北京康思博达知识产权代理事务所(普通合伙)11426 代理人: 余光军; 李霞
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510836634.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.01.04|||2016.03.23|||2016.02.24

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用。本发明将芘、苝或萘酰胺等发色团与双二异丙基氨基氯化磷相连接得到亚磷中间体,再与DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。通过DNA的固相合成,将其定点插入到寡聚核苷酸中得到发色团修饰的双链结构稳定的荧光寡聚核苷酸探针。该荧光寡聚核苷酸探针本身没有荧光发射,只有和完全配对的靶链结合后,荧光增强可达23.5倍且响应速度快;对于错配碱基识别明显,几乎没有荧光发射,可以明显区分出单碱基错配,能应用于基因单碱基突变分析和PCR反应过程检测等,在单碱基多态性检测和生化样品中核酸检测等方面中应用前景广泛。

    权利要求书

    1.发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物,其特征在于,其为
    式Ⅰ所示结构的化合物:

    其中,所述Base(碱基)选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤;
    R1选自芘,苝或萘酰胺;R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基
    或异丙基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为1-8的任意整数,优选为
    1-6的任意整数,更优选为1-4的任意整数。
    2.按照权利要求1所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合
    物,其特征在于:
    当R1为芘时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基或异丙
    基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为1或4;
    当R1为苝时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基或异丙
    基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为3;
    当R1为萘酰胺时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基或
    异丙基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为2。
    3.权利要求2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的
    中间体,其特征在于,其为式Ⅵ-式Ⅸ所示:

    4.一种制备权利要求2所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化
    合物的制备方法,其特征在于,包括:
    (1)将芘丁酸还原得到芘丁醇;(2)在无水、无氧环境和氮气?;?br />下,将芘丁醇与双二异丙基氨基氯化磷反应,得到芘修饰的亚磷中间体;
    (3)在无水、无氧环境、氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将芘修饰的
    亚磷中间体和DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到芘修饰的脱氧核苷亚磷酰
    胺单体化合物;
    或者:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将芘甲醇与双二异丙
    基氨基氯化磷反应,得到芘修饰的亚磷中间体;(2)在无水、无氧环境、
    氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将芘修饰的亚磷中间体和DMT?;さ?br />脱氧核苷反应,得到芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物;
    或者:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将苝丙醇与双二异丙
    基氨基氯化磷反应,得到苝修饰的亚磷中间体;(2)在无水、无氧环境、
    氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将苝修饰的亚磷中间体和DMT?;さ?br />脱氧核苷反应,得到苝修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物;
    或者:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将N,N-二甲胺基萘
    酰胺基乙醇与双二异丙基氨基氯化磷反应,得到萘酰胺修饰的亚磷中间
    体;(2)在无水、无氧环境、氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将萘酰
    胺修饰的亚磷中间体和DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到萘酰胺修饰的脱
    氧核苷亚磷酰胺单体化合物。
    5.按照权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述催化剂为四
    氮唑;
    所述脱氧核苷选自胸腺嘧啶脱氧核苷、胞嘧啶脱氧核苷、腺嘌呤脱
    氧核苷或鸟嘌呤脱氧核苷中的任意一种。
    6.权利要求1或2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合
    物在制备寡聚核苷酸探针中的应用。
    7.一种荧光寡聚核苷酸探针,其特征在于:含有权利要求1或2所
    述的发色团修饰的亚磷酰胺单体化合物。
    8.按照权利要求7所述的荧光寡聚核苷酸探针,其特征在于:含有
    1个或1个以上权利要求1或2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单
    体化合物。
    9.按照权利要求7或8所述的荧光寡聚核苷酸探针,其特征在于:
    权利要求1或2所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物位于寡
    聚核苷酸链的任意位置,优选为位于寡聚核苷酸链的中部。
    10.权利要求7或8所述的发色团修饰的脱氧核苷寡聚核苷酸探针
    在制备单碱基多态性检测试剂、目标基因或RNA检测以及PCR过程中的
    单碱基错配检测中的应用。

    说明书

    发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用

    技术领域

    本发明涉及亚磷酰胺单体化合物,尤其涉及磷酸位置发色团修饰的脱
    氧核苷亚磷酰胺单体化合物,本发明还涉及所述发色团修饰的脱氧核苷亚
    磷酰胺单体化合物的制备方法及其制备的寡聚核苷酸探针及其在单碱基
    多态性检测以及目标基因或RNA检测中的应用,属于功能化寡聚核苷酸领
    域。

    背景技术

    核酸探针可以与DNA、RNA或蛋白质特异性结合,在化学、生物学
    和医学研究领域有着广泛的应用,例如核酸纳米粒、生物芯片、mRNA成
    像、基因筛查和单碱基多态性(SNP)检测等。其中,分子信标(MB)
    在这些领域应用最为广泛。传统意义上的分子信标是在核酸序列两端分别
    标记荧光基团和淬灭基团,形成“发卡”状结构,荧光基团与淬灭基团在空
    间上相互接近,无荧光发射;当和待检测的靶链特异性结合后,“发卡”
    结构打开,荧光基团与淬灭基团相互远离,发射荧光。碱基组成、碱基错
    配位置和待分析靶链的长度等都会影响分子信标的选择性和灵敏性。为了
    进一步优化核酸探针的检测性能,研究者设计了更多结构复杂的分子信
    标,例如,基于核酸三联体的分子信标,哑铃结构的分子信标,基于核酸
    四链体结构的分子信标和二元结构的分子信标。这些探针在很大程度上仍
    然依赖于和靶链整体的碱基互补配对。

    为了识别核酸链中碱基配对的局部变化,可以将具有碱基识别作用的
    核苷定点插入到核酸链的特点位置,从而设计出识别碱基的寡聚核苷酸荧
    光探针。根据已有的报道,研究者通过以下方式设计了具有荧光效应的核
    酸碱基:(1)用荧光基团替换掉核苷上的碱基,(2)通过柔性链或刚性
    链将荧光基团连接在嘧啶碱基的5’位置或嘌呤碱基的7’或8’位置,(3)
    将荧光基团连接在糖环的不同位置。以上设计在不同程度上可以实现对局
    部碱基错配的识别,但是除了个别设计识别效果非常明显(对于配对碱基
    和错配碱基,荧光强度差别可以达到20倍以上),大多数设计对于错配
    碱基识别并不明显(荧光强度差别在几倍到十倍的变化)。因此,有必要
    发展新的修饰策略。

    芘是一种重要的稠环芳烃类有机化合物,具有芳香性,有很强的荧光,
    可以作为染料,在工农业生产和自然科学研究中应用广泛。将芘这一荧光
    团应用于核酸的化学修饰,引起了众多研究者的兴趣。目前已经报道的芘
    对寡聚核苷酸的修饰位点主要集中这些地方,具体讲,芘可以通过以下方
    式连接在寡聚核苷酸上:(1)直接替换掉核苷的碱基;(2)将芘通过柔
    性链或者刚性链连接在碱基上;(3)连接在糖环骨架上。不同的连接位
    置和连接位置,对芘修饰的寡聚核苷酸的性质有着不同的影响。

    芘功能化的寡聚核苷酸探针在过去的十几年内获得了长足发展,目前
    在核酸序列检测、碱基多态性识别和核酸高级结构,如G-四连体结构分
    析等方面获得了一定的应用。目前已有的芘修饰寡聚核苷酸除了个别修饰
    策略在检测靶标核酸序列和区分单碱基多态性上展现出了优异的性质外,
    绝大多数修饰策略是不能令人满意的,问题主要集中在以下几个方面:

    首先,对靶标核酸序列的检测不够灵敏。例如,糖环骨架的2’位置进
    行芘修饰,在和完全配对的RNA序列结合前后,荧光强度有20倍以上的
    增强。但是其他修饰策略,比如碱基上芘荧光团的链接,使得在检测前后
    只有十倍或者更低的荧光强度变化。这样,在试剂检测中,很容易造成假
    阳性的检测结果。

    其次,对单碱基多态性区分不够灵敏。很多疾病的发生和发展都是由
    于单碱基突变造成的,例如人类恶性黑色素瘤的发生与V600E的T→A的
    单碱基突变密切相关,因此有效检测单碱基突变的发生具有重要的意义。
    对于目前已有的芘修饰核酸探针,多数并不能有效区分单碱基突变。例如,
    在糖环2’位置借助click反应,使用三氮唑作为连接臂连接芘荧光团时,
    含有待检测的位点M(A)和突变位点MM(T)、MM(G)和MM(C)的序列和
    探针结合后,几乎无明显区别。

    还有多数芘修饰寡聚核苷酸化学合成繁琐。在碱基上进行芘的荧光
    团连接时,往往需要考虑碱基上氨基的?;ず屯殉?,同时,在嘌呤碱基和
    嘧啶碱基上连接芘荧光团的策略往往不具有通用性;在糖环上修饰时,糖
    环本身不含有可以进一步连接荧光团的基团,往往需要特殊设计合成策
    略。

    因此,有必要对芘等荧光发色团修饰的寡聚核苷酸进行进一步的研
    究,以期找到化学合成经济简易、具有通用性、对靶标核酸序列检测灵敏,
    同时又能有效区分单碱基多态性的新的修饰策略。

    发明内容

    本发明的目的之一是提供一种发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体
    化合物,该脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的合成经济简易,用其制备的寡
    聚核苷酸探针具有通用性,对靶标核酸序列检测灵敏,同时又能有效区分
    单碱基多态性;

    本发明的目的之二是提供所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体
    化合物的制备方法;

    本发明的目的之三是将所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化
    合物应用于制备荧光寡聚核苷酸探针,并进一步将该荧光寡聚核苷酸探针
    应用于单碱基多态性检测、目标基因或目标RNA检测等方面。

    为达到上述目的,本发明所采取的技术方案是:

    本发明首先公开了一种发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物,
    其为式Ⅰ所示结构的化合物:


    其中,R1为芘,苝或萘酰胺等发色团;

    所述Base选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤;

    R2选自甲基,乙基或异丙基;

    R3选自甲基,乙基或异丙基;

    DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为1-8的任意整数,优选为1-6的
    任意整数,更优选为1-4的任意整数。

    优选的,当R1为芘时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙
    基或异丙基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为1或4;

    当R1为苝时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基或异丙
    基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为3;

    当R1为萘酰胺时,R2为甲基,乙基或异丙基;R3为甲基,乙基或
    异丙基;DMTr为对二甲氧基三苯甲基;n为2。

    进一步优选的,本发明所述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物,
    其为式Ⅱ或式Ⅲ、式Ⅳ或式Ⅴ所示结构的化合物:



    本发明进一步公开了式Ⅲ-式Ⅴ化合物的中间体,其结构式分别为式
    Ⅵ-式Ⅸ所示:



    本发明还公开了一种制备上述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合
    物的制备方法,包括以下步骤:(1)将芘丁酸还原得到芘丁醇;(2)在
    无水、无氧环境和氮气?;は?,将芘丁醇与双二异丙基氨基氯化磷反应,
    得到芘修饰的亚磷中间体;(3)在无水、无氧环境、氮气?;ず痛呋?br />存在的条件下,将芘修饰的亚磷中间体和DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得
    到式Ⅲ所示结构的芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。

    本发明还公开了一种上述芘修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的
    制备方法,包括以下步骤:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将芘
    甲醇与双二异丙基氨基氯化磷反应,得到芘修饰的亚磷中间体;(2)在
    无水、无氧环境、氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将芘修饰的亚磷中间
    体和DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到式Ⅱ所示结构的芘修饰的脱氧核苷
    亚磷酰胺单体化合物。

    本发明公开了一种苝修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方
    法,包括以下步骤:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将苝丙醇与
    双二异丙基氨基氯化磷反应,得到苝修饰的亚磷中间体;(2)在无水、
    无氧环境、氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?,将苝修饰的亚磷中间体和
    DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到式Ⅳ所示结构的苝修饰的脱氧核苷亚磷
    酰胺单体化合物。

    本发明还公开了一种萘酰胺修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的
    制备方法,包括以下步骤:(1)在无水、无氧环境和氮气?;は?,将N,
    N-二甲胺基萘酰胺基乙醇与双二异丙基氨基氯化磷反应,得到萘酰胺修饰
    的亚磷中间体;(2)在无水、无氧环境、氮气?;ず痛呋链嬖诘奶跫?br />下,将萘酰胺修饰的亚磷中间体和DMT?;さ耐蜒鹾塑辗从?,得到式Ⅴ
    所示结构的萘酰胺修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。

    本发明上述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法
    中,所述催化剂为四氮唑;所制备得到的活泼的芘修饰的亚磷中间体不经
    进一步纯化,可以直接和5’位置DMT?;さ耐蜒鹾塑账岱从?,之后快速
    柱层析分离。其中,所述脱氧核苷酸选自胸腺嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱
    氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸或鸟嘌呤脱氧核苷酸中的任意一种。

    本发明所述的发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物能够应用
    于制备寡聚核苷酸探针。

    将本发明所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物定点插入
    到寡聚核苷酸的相应位置,可以通过DNA合成仪直接应用于寡聚核苷酸
    的固相合成,在进行偶合时,延长偶合时间至300s,偶合效率与天然的
    DNA亚磷酰胺单体一致,之后经过新鲜氨水的切割脱?;ず透咝б合嗟?br />分离纯化,最终得到磷酸位置芘修饰的荧光寡聚核苷酸探针。

    本发明进一步公开了一种荧光寡聚核苷酸探针,含有发色团修饰的
    脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物;所述荧光寡聚核苷酸探针中,发色团修饰
    的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物为1个或1个以上;所述的脱氧核苷亚磷
    酰胺单体化合物位于寡聚核苷酸链的任意位置,优选为位于寡聚核苷酸链
    的中部。

    本发明得到的寡聚核苷酸荧光探针本身没有荧光发射,当与完全配
    对的靶链结合后,发射荧光,强度增强非常显著,最高达到23.5倍。本
    发明将芘等发色团定点修饰在寡聚核苷酸的磷酸位置,不影响寡聚核苷酸
    的稳定性和二级结构,可以应用于基因的单碱基多态性检测。

    本发明结合计算机模拟,对磷酸位置芘修饰核酸探针在和完全互补
    DNA配对前后巨大的荧光差别进行了分析。当磷酸位置芘修饰的核酸探
    针以单链形式存在时,由于柔性连接臂的存在,芘可以与邻近的碱基充分
    发生π-π的相互堆积作用,使得芘自身的荧光被邻近碱基通过光致荧光转
    移(PET)效应淬灭掉;当与完全互补的DNA序列配对后,芘被挤出碱基堆
    积区域,完全暴露在水相的极性环境中,荧光不能被有效淬灭。

    本发明技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:

    本发明将芘等荧光基团通过烷基链柔性连接在5’-DMT?;さ耐蜒?br />核苷上,制得磷酸位置发色图案定点修饰的亚磷酰胺单体化合物,之后将
    该单体使用固相合成法修饰到寡聚核苷酸序列上得到相应的寡聚核苷酸
    荧光探针。本发明提出的在寡聚核苷酸的磷酸位置进行芘等发色团修饰的
    新策略,不会对核酸的双链稳定性和二级结构产生不利影响。据此得到的
    磷酸位置发色团修饰寡聚核苷酸探针本身没有荧光发射,和完全配对的靶
    链结合后,荧光增强显著,最高可达23.5倍,响应速度快,不超过20秒;
    同时该探针对于错配碱基识别明显,几乎没有荧光发射;此外,磷酸位置
    发色团修饰的核酸探针对于RNA有着比DNA更强的识别能力。

    本发明磷酸位置发色团修饰的寡聚核苷酸探针各项性质优异,可以应
    用于基因单碱基突变分析和PCR反应过程检测,有望在单碱基多态性检
    测和生化样品中核酸检测方面获得更广泛的应用。

    附图说明

    图1为磷酸位置芘修饰脱氧胸苷亚磷酰胺单体的合成;a)磷酸位置
    柔性丁基链连接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成;b)磷酸位置刚性亚甲基连
    接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成。

    图2a)磷酸位置芘修饰脱氧胸苷亚磷酰胺单体;b)磷酸位置芘修饰
    的寡聚核苷酸。

    图3芘修饰核酸探针S0和完全配对序列S2形成双链以及天然双链
    的圆二色谱。

    图4a)单链探针S0和对应完全配对链及单碱基错配链的荧光谱图;
    b)单链探针S0和完全配对链S2形成双链的动力学过程。

    图5为单链探针S0和完全互补链及含错配碱基链结合后在波长
    378nm下的相对荧光强度。

    图6为单链探针S0和对应完全配对RNA形成双链的荧光谱图。

    图7为磷酸位置芘修饰探针S0对完全配对底物的浓度效应:a)不同
    浓度底物的荧光图谱;b)378nm下荧光发射强度与底物浓度的线性关系。

    图8为PCR过程中的荧光谱图:a)以模板1进行PCR反应在不同
    循环数下的荧光谱图;内插图为分别使用模板1和模板2在378nm下的
    荧光强度与循环次数的关系图;b)以模板2进行PCR反应在不同循环次
    数下的荧光光谱图。

    图9人类黑色素瘤braf基因突变检测的荧光谱图。

    图10为磷酸位置芘修饰的寡聚核苷酸探针通过不对称PCR反应检测
    Braf基因V600的单碱基突变。

    图11苝修饰的i-motif核酸序列在不同pH值下的荧光光谱图。

    图12苝修饰的i-motif核酸序列的荧光强度与pH值的线性对应关系。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会
    随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的,不对本发明
    的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的
    精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这
    些修改或替换均落入本发明的?;し段?。

    实施例1磷酸位置芘丁醇修饰亚磷酰胺单体的合成

    1、化合物PB-0的制备

    2M浓度的硼烷二甲硫醚的四氢呋喃溶液3mL,冰浴冷却至零度;芘
    丁酸(560mg,1.94mmoL,购买于百灵威公司)溶解于新蒸的无水四氢呋喃
    溶液5mL。冰浴搅拌下,将芘丁酸的四氢呋喃溶液逐滴加入到硼烷溶液中,
    室温搅拌过夜。将反应混合物至于冰浴搅拌下,逐滴加入甲醇淬灭反应至
    无气泡产生,继续搅拌2小时。对反应体系减压浓缩至少量,加入乙酸乙
    酯30mL;混合溶液用饱和碳酸钠溶液洗涤(30mL×3)。收集有机相,无水
    硫酸钠干燥,减压旋去乙酸乙酯。残余物使用柱层析法快速分离,洗脱剂
    为石油醚/乙酸乙酯1:1,最终得到浅黄色固体480mg(1.74mmoL,产率
    90.2%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.27(d,J=9.2Hz,1H),8.15-8.17
    (dd,J=2.2Hz,7.8Hz,2H),8.11(d,J=1.8Hz,1H),8.09(d,J=3.4Hz,1H),
    7.97-8.02(m,3H),7.86(d,J=7.8Hz,1H),3.71(t,J=6.5Hz,2H),3.38(t,J
    =7.6Hz,2H),1.90-1.98(m,2H),1.71-1.78(m,2H).13C-NMR(100MHz,
    CDCl3)δ=136.7,131.5,130.9,129.8,128.6,127.5,127.2,126.6,125.8,
    125.1,124.9,124.8,124.7,123.4,62.9,33.3,32.8,28.0.MS(ESI-TOF+)测
    量值M+274.33,C20H18O,理论值M+274.36.

    2、化合物PB-1的制备

    在氮气?;は?,双二异丙基氨基氯化磷(293mg,1.1mmoL)溶解于5mL
    无水四氢呋喃中,并加入1mL三乙胺,冰浴冷却至0℃?;衔?br />PB-0(275mg,1.1mmoL)溶解于1mL无水四氢呋喃,并逐滴加入到前者溶
    液中,室温搅拌过夜。反应完毕后,快速过滤掉不溶物;滤液快速旋干得
    到浅黄色固体PM-1。不做进一步纯化,直接用于下步反应。31PNMR(162
    MHz,CDCl3)δ=121.8.

    3、化合物PB-2的制备

    在氮气?;は?,DMT?;さ耐蜒跣剀?350mg,0.64mmoL)和四氮唑
    (70mg,1.0mmoL)溶于1.5mL无水二氯甲烷中。上步反应得到的PB-1在氮
    气?;は氯咳芙庥?.5mL无水二氯甲烷中,加入到前者溶液中?;旌衔锏?br />气?;は率椅路从?小时,直接上柱,快速分离。洗脱剂石油醚/乙酸乙酯/
    三乙胺1:1:0.03,得到浅黄色泡沫状固体330mg(0.36mmoL,两步产率36.4)。
    1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ=8.13-8.26(m,9H),7.49(s,1H),7.30-7.35(m,2
    H),7.13-7.25(m,7H),6.73-6.82(m,4H),6.20-6.25(m,J=6.8,7.3Hz,1H),
    4.58-4.68(m,1H),4.12-4.17(dd,J=20.4Hz,1H),3.71-3.75(dd,J=18.6Hz,
    8.0Hz,6H),3.47-3.65(m,4H),3.41-3.46(m,J=8.2Hz,1H),3.35-3.39(t,J=
    8.4Hz,1H),3.17-3.21(t,J=8.2Hz,2H),2.42-2.53(m,1H),2.21-2.31(m,1
    H),1.76-1.96(m,3H),1.63-1.70(m,1H),1.38(s,3H),1.10-1.14(q,J=8.0Hz,
    6.6Hz,9H),1.00-1.02(d,J=8.0Hz,3H).31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ=
    146.7,147.4.MS(ESI-TOF+),理论值948.43,C57H62N3O8P;测量值[M+H]+
    949.21,[M+Na]+971.13.

    磷酸位置柔性丁基链链接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成见图1(a)。对于
    芘修饰的其他A,G和C亚磷酰胺单体,通过该方法也能快速合成。

    实施例2磷酸位置芘甲醇修饰亚磷酰胺单体的合成

    1、化合物PM-1的制备

    在氮气?;は?,双二异丙基氨基氯化磷(293mg,1.1mmoL)溶解于5mL
    无水四氢呋喃中,并加入1mL三乙胺,冰浴冷却至0℃。芘甲醇(230mg,
    1.0mmoL)氮气?;は氯芙庥?mL无水四氢呋喃,逐滴加入前者溶液中,
    室温搅拌过夜。反应完毕后,快速过滤掉不溶物,滤液迅速旋干得到浅黄
    色固体。不做进一步处理,直接用于下步反应。31PNMR(162MHz,CDCl3)
    δ=121.8.

    2、化合物PM-2的制备

    在氮气?;は?,DMT?;さ耐蜒跣剀?350mg,0.64mmoL)和四氮唑
    (80mg,1.1mmoL)溶解于1.5mL无水二氯甲烷中。上部反应得到的PM-1全
    部在氮气?;は氯芙庥?.5mL无水二氯甲烷,加入到前者溶液中。室温反应
    2小时,混合溶液直接上柱分离,洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯/三乙胺1:1:0.03,
    得到浅黄色泡沫状固体300mg(0.33mmoL,两步产率33.3%)。1H-NMR(400
    MHz,CDCl3)δ=7.82-8.22(m,9H),7.59(dd,J=24Hz,1H),7.36-7.38(dd,J=
    8Hz,2H),7.20-7.30(m,7H),6.75-6.80(m,4H),5.30-5.40(m,2H),4.56-4.63
    (m,1H),4.01-4.06(dd,J=3.2,12.6Hz,2H),3.69(s,6H),3.62(m,2H),
    3.17-3.18(m,1H),3.07-3.08(m,1H),2.26-2.42(m,2H),1.40-1.45(dd,J=25
    Hz,3H),1.07-1.12(q,J=8.0Hz,6.4Hz,9H),0.98-1.00(d,J=8.0Hz,3H).
    31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.9,148.7.MS(ESI-TOF+),理论值906.10,
    C54H56N3O8P;测量值[M+Na]+929.74.

    磷酸位置刚性亚甲基链接芘的胸苷亚磷酰胺单体合成见图1(b)。对于
    芘修饰的其它A,G和C亚磷酰胺单体,通过该方法可以快速合成。

    实施例3磷酸位置苝丙醇修饰亚磷酰胺单体的合成

    化合物Perylene-1的合成

    在氮气?;は?,双二异丙基氨基氯化磷(293mg,1.1mmoL)溶解于5mL
    无水四氢呋喃中,并加入1mL三乙胺,冰浴冷却至0℃。苝丙醇(310mg,
    1.0mmoL)氮气?;は氯芙庥?mL无水四氢呋喃,逐滴加入前者溶液中,
    室温搅拌过夜。反应完毕后,快速过滤掉不溶物,滤液迅速旋干得到黄色
    固体。不做进一步处理,直接用于下步反应。

    化合物Perylene-dC的合成

    在氮气?;は?,DMT?;さ耐蜒醢?412mg,0.65mmoL)和四氮唑(80mg,
    1.1mmoL)溶解于1.5mL无水二氯甲烷中。上部反应得到的Perylene-1全部在氮
    气?;は氯芙庥?.5mL无水二氯甲烷,加入到前者溶液中。室温反应2小时,
    混合溶液直接上柱分离,洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯/三乙胺1:1:0.03,得到黄
    色泡沫状固体380mg(0.35mmoL,两步产率35.4%)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)
    δ=8.40(s,1H),8.14(m,4H),7.86(m,2H),7.71–7.40(m,10H),7.36–7.20(m,
    9H),6.83(m,4H),6.39–6.26(m,1H),4.74(m,1H),4.25(m,1H),3.91–3.42(m,
    11H),3.10(m,2H),2.00(m,2H),1.29(m,4H),1.26–1.09(m,12H).31P-NMR
    (162MHz,CDCl3)δ=148.0,148.5.MS(ESI-TOF+),理论值1072.45,
    C66H65N4O8P;测量值[M+H]+1073.61,[M+Na]+1095.67.

    化合物Perylene-dT的合成

    在氮气?;は?,DMT?;さ耐蜒跣剀?354mg,0.65mmoL)和四氮唑(80mg,
    1.1mmoL)溶解于1.5mL无水二氯甲烷中。上部反应得到的Perylene-1全部在氮
    气?;は氯芙庥?.5mL无水二氯甲烷,加入到前者溶液中。室温反应2小时,
    混合溶液直接上柱分离,洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯/三乙胺1:1:0.03,得到黄
    色泡沫状固体336mg(0.37mmoL,两步产率37.2%。1H-NMR(400MHz,CDCl3)
    δ=8.26-8.05(m,5H),7.96-7.73(m,2H),7.72-7.35(m,10H),7.27–7.17(m,2H),
    6.84-6.76(m,3H),6.48–6.40(dd,1H),4.71(m,1H),4.26-4.08(m,2H),3.80–
    3.70(m,6H),3.59(t,1H),3.52-3.32(dd,2H),3.17-3.00(m,2H),2.61-2.48(m,
    1H),2.38-2.28(m,1H),2.19-1.93(m,4H),1.44-1.38(m,3H),1.38–1.24(m,
    12H).31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ=146.9,147.6.MS(ESI-TOF+),理论值
    983.43,C60H62N3O8P;测量值[M+Na]+1006.66.

    化合物Perylene-dG的合成

    在氮气?;は?,DMT?;さ耐蜒跄褴?416mg,0.65mmoL)和四氮唑
    (80mg,1.1mmoL)溶解于1.5mL无水二氯甲烷中。上部反应得到的Perylene-1
    全部在氮气?;は氯芙庥?.5mL无水二氯甲烷,加入到前者溶液中。室温反应
    2小时,混合溶液直接上柱分离,洗脱剂为二氯甲烷/乙酸乙酯/三乙胺1:1:0.03,
    得到黄色泡沫状固体346mg(0.32mmoL,两步产率32.0%)。1H-NMR(400MHz,
    CDCl3)δ=8.22-8.07(m,4H),7.88(dd,1H),7.78(d,1H),7.72–7.65(m,2H),
    7.56–7.44(m,5H),7.40–7.30(m,5H),7.27–7.16(m,3H),7.27–7.16(m,3H),
    6.84–6.68(m,4H),6.24-6.10(m,1H),4.83–4.74(m,1H),4.31(d,1H),
    3.81-3.58(m,9H),3.37–3.26(m,2H),3.20–2.90(m,4H),2.53–2.45(m,1H),
    2.13–2.08(m,1H),1.89–1.62(m,1H),1.35–1.23(m,12H),1.17–1.08(m,
    6H).31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ=147.3,147.8.MS(ESI-TOF+),理论值
    1078.48,C64H67N6O8P;测量值[M+H]+1080.08,[M+Na]+1102.11.

    对于苝修饰的A亚磷酰胺单体,通过该方法也可以快速合成。

    实施例4磷酸位置萘酰胺基乙醇修饰亚磷酰胺单体的合成

    2g(4-二甲氨基-1,8-萘二甲酸酐)溶解在30ml乙醇中,溶液通氮气10
    分钟,加热至80℃后用注射器加入0.55ml乙醇胺,数分钟后溶液澄清并回
    流12小时。反应液浓缩后过柱,洗脱极性P:E3:1→1:1(加1%三乙胺)得
    到N,N-二甲胺基萘酰胺基乙醇,产率约为70%~90%。1H-NMR(400MHz,
    CDCl3):δ(ppm)8.54(d,J=8Hz,1H),8.42(dd,J1=J2=J3=4Hz,2H),7.64(t,
    J1=J2=8Hz,1H),7.08(d,J=8Hz,1H),4.44(t,J1=8Hz,J2=4Hz,2H),3.97(t,
    J1=4Hz,J2=8Hz,2H),3.12(s,6H).13C-NMR(100MHz,CDCl3):δ(ppm)
    165.42,164.94,156.95,133.05,131.67,131.17,130.22,125.08,124.61,122.71,
    114.54,113.11,62.22,44.80,42.78.

    在氮气?;さ幕肪诚?,将N,N‐二甲胺基萘酰胺基乙醇溶解在THF中,
    加入0.2mL三乙胺,并将上述溶液滴加到双(二甲基氨)氯膦的二氯甲烷溶
    液中。室温过夜反应后,将干燥的DMT?;さ男叵汆奏ず塑账嵊胨牡虻?br />THF溶液加入上述反应液,并继续反应2小时。柱分离(洗脱剂极性为DCM:
    EA=4:1→3:1,加3%三乙胺)得到白色固体。31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ=
    148.33和148.42,质谱(M++K)980.78。

    对于萘酰胺修饰的其他A,G和C亚磷酰胺单体,通过该方法也可快速
    合成。

    实施例3寡聚核苷酸的合成、纯化和性质研究

    寡聚核苷酸使用ABI394DNA合成仪以1μM规模进行合成。实施例2
    制备的PM-2和实施例1制备的PB-2在进行偶合时,延长偶合时间至300s,
    偶合效率与天然的DNA亚磷酰胺单体一致,不低于95%。合成完毕后,向
    固相CPG中加入新鲜浓氨水室温振摇24小时,浓缩后,以400μLTEAA缓
    冲液溶解,经0.22μM滤膜过滤后,使用Varian320HPLC进行分离。分离柱
    使用XDB-C18反相柱(5μM,9.4×250mm)。洗脱溶剂:A液,0.05MTEAA
    缓冲液;B液,乙腈。洗脱梯度:0–20min,B:0–40%;20-30min,B:40-80%;
    B:30–35min,80-90%;35–38min,B:90-90%;38-45min,B:90-0%B;
    流速:2mL/min。收集组分,真空浓缩后,加入80%冰醋酸溶液振摇30分钟;
    真空浓缩后,以400μLTEAA重新溶解,使用上述分离条件重新HPLC分离。
    磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸序列经ESI-Mass质谱确认,结果正确。

    本发明中使用的寡聚核苷酸序列如下:

    S0:5′–TCAACATCAGTCTGATAAGCTA–3′;

    S1:5′–TCAACATCAGTCTGATAAGCTA–3′;

    S2:3′–AGTTGTAGTCAGACTATTCGAT–5′;

    Mm1:3′–AGTTGTAGTCAN1ACTATTCGAT–5′;

    Mm2:3′–AGTTGTAGTCN2GACTATTCGAT–5′;

    N1=A,T,C;N2=C,G,T

    其中黑体T表示芘修饰位点;N1和N2分别表示错配碱基。磷酸位置芘
    修饰脱氧胸苷亚磷酰胺单体及磷酸位置芘修饰的寡聚核苷酸见图2(a)和(b)。

    1、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的热力学研究

    测量条件:寡聚核苷酸1μM溶解于10mMPBS缓冲液,氯化钠浓度为
    100mM?;旌先芤?0℃退火,缓慢降至室温。在波长260nm下,使用Beckman
    Series800UV光谱仪记录解链过程中的紫外吸收值;升温幅度1℃/min,读
    数间隔0.5℃。溶解度曲线经过一阶导分析后,由仪器给出溶解温度。

    2、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的二级结构研究

    圆二色谱的测量条件:寡聚核苷酸浓度5μM,10mMPBS缓冲液,
    100mMNaCl。使用JsscoJ-810spectropolarimeter光谱旋光仪在室温下测
    量,比色皿光程为0.1cm。

    波长扫描范围:220—360nm;扫描速度:200nm/min;数据位扫描三
    次的平均结果。

    本发明通过监测解链过程中260nm波长下的紫外吸收,得到相应DNA
    杂交双链的溶解曲线(表1)。从曲线图可以看到,磷酸位置芘修饰的核酸探针
    S0和完全配对序列S2可以形成稳定的双链结构,解链过程中观察到典型的
    S型溶解曲线。相应的溶解温度在表1中给出。芘修饰后双链溶解温度为
    66.8℃,相较于天然的DNA双链S1+S2,溶解温度下降1.9℃,而错配序列
    有4℃到10℃的下降,这表明,在磷酸位置进行芘的修饰对双链形成后的
    稳定性影响很小。

    同时,本发明使用圆二色谱对芘修饰DNA双链和天然DNA双链的二级
    结构进行了比较(图3)。从实验数据可以直观看到,芘修饰的DNA双链S0+S2
    在波长250nm处出现波谷,275nm处出现波峰,258nm处出现交界线,与天
    然DAN双链S1+S2的构型保持完全一致,即在磷酸位置进行芘修饰后完全
    不改变双链的二级结构,仍然维持典型的B型DNA结构。

    表1探针S0和完全配对序列及错配序列形成双链的溶解温度和荧光性质


    3、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的荧光性质考察

    荧光光谱的测量条件:寡聚核苷酸浓度1μM,10mMPBS缓冲液,
    100mMNaCl。使用CaryEclipse荧光光度计在常温下测量。激发波长:
    345nm;激发狭缝:5nm;发射狭缝:5nm;检测高压:600V;扫描速度:
    240nm/min。系统对谱线做平滑处理。

    从图4(a)可以看到,单链的探针S0荧光发射非常微弱,与缓冲溶液
    的荧光处于同一背景水平;当和完全配对的序列S2进行简单混合后,荧
    光强度显著增强,最大荧光发射位置位于波长378nm和398nm处。同时
    本发明记录在波长378nm处的荧光强度值(表1),可以发现,形成双链后,
    该波长下的荧光强度增强可达23.5倍;相比于芘的核苷酸常规修饰几倍
    到十几倍的荧光增强变化,该种修饰策略荧光增强的优势十分明显。

    另外,考虑到常规修饰策略对于错配碱基的识别并不明显。本发明
    将探针与修饰位点两侧含有单碱基错配的序列进行了混合,考察其荧光变
    化。从图4a、图5和表1可以看出,单链探针S0不管与Mm1(G→A,T,C)
    还是与Mm2(A→C,G,T)配对后,相较于完全配对链S0+S2,荧光发射十
    分微弱,与单链探针S0的荧光强度处于同一水平。于是,磷酸位置芘修
    饰的寡聚核苷酸荧光探针可以明显的区分出单碱基错配,有望在人类基因
    组单碱基多态性分析上获得应用。

    4、磷酸位置芘修饰的核酸探针的动力学研究

    除了选择性和特异性,杂交动力学也是评价核酸探针性能是否优异
    的重要指标。于是,本发明对磷酸位置芘修饰的核酸探针进行了动力学的
    研究。本发明在某一时间加入和探针S0互补的DNA序列,记录荧光发
    射增强到平台区需要的时间(图4b)。从40s加入靶序列开始,荧光强度快
    速增强,在不超过20s的时间内,荧光强度即达到平台,不再增加。相比
    于一般的分子信标,荧光强度达到饱和需要若干分钟,而更复杂的分子信
    标,如三联颈部的分子信标或哑铃状的分子信标,达到饱和则需要多达
    60分钟或更长。而磷酸位置芘修饰的核酸探针和底物的反应时间远远低
    于一般探针,这给检测带来了很大便利。

    5、磷酸位置修饰的核酸探针对于RNA的识别

    为了研究芘在磷酸位置修饰的核酸探针对于RNA的识别,本发明将
    探针S0与完全配对的RNA序列进行混合,记录其荧光发射情况(图6)。
    从荧光图谱上可以看到,当探针S0和RNA配对后,荧光增强同样十分显
    著,378nm处的荧光峰值增强可以达到36倍,甚至超过与DNA的识别。
    这表明,磷酸位置芘修饰的核酸探针有望应用于生物样品中RNA的直接
    测试。

    6、芘修饰探针形成双链前后的荧光量子产率测量

    本发明对芘修饰探针形成双链前后的荧光量子产率进行了测量。依据
    以下公式:

    Φu=Φs(Yu/Ys)(As/Au)(n2u/n2s)

    其中,ΦS为标准样品0.1M硫酸奎宁的荧光量子产率0.XX。Yu和Ys
    分别代表所测样品和标准样品在相同激发波长345nm下的紫外吸收值;
    As和Au分别表示所测样品和标准样品的荧光发射图谱积分面积;nu和ns
    分别表示所测样品和标准样品溶液的折射率。本发明配置345nm波长下
    吸收值相同且低于0.05的各样品溶液和硫酸奎宁标准溶液进行测量。经
    过计算,得到单链探针的荧光量子产率为0.02,和完全互补DNA序列结
    合后,荧光量子产率为0.31。

    7、磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸的计算机模拟

    本发明结合计算机模拟,对磷酸位置芘修饰核酸探针在和完全互补
    DNA配对前后巨大的荧光差别进行了分析。当磷酸位置芘修饰的核酸探
    针S0以单链形式存在时,由于柔性连接臂的存在,芘可以与邻近的碱基
    充分发生π-π的相互堆积作用,使得芘自身的荧光被邻近碱基通过光致荧
    光转移(PET)效应淬灭掉;当与完全互补的DNA序列配对后,芘被挤出碱
    基堆积区域,完全暴露在水相的极性环境中,荧光不能被有效淬灭。同时,
    在形成双链后,荧光发射谱图中398nm/378nm的较低比值,也暗示此时
    的芘处于较强的极性环境中。

    8、磷酸位置芘修饰探针S0对靶链的浓度效应的考察

    形成双链时,荧光强度的增强依赖于探针S0和靶链的特异性结合;
    于是,本发明对磷酸位置芘修饰探针S0对靶链的浓度效应进行了考察。
    本发明固定探针S0的浓度为1.0μM,从1.0μM逐渐降低靶链浓度,记录
    其荧光发射情况(图7)。从图上可以看出,随着底物浓度的降低,荧光强
    度也逐渐降低;随后,本发明记录在波长378nm下的荧光强度,对底物
    浓度进行线性拟合。结果显示为,F378nm=47.98×[Concentration]-0.06并且
    R2=0.99,这表明底物浓度0.1—1.0μM范围内线性关系良好。

    实验例2PCR过程的引物延长试验

    为进一步实现磷酸位置芘修饰核酸探针的实际应用,本发明将该探针
    应用于PCR过程中的单碱基错配检测。为此,本发明分别使用两条只有
    一个碱基不同的模板即模板1和模板2,将探针直接加入到PCR反应体系
    中,进行一个简易的PCR扩增反应。

    PCR的引物延长试验是在AppliedBiosystemsVeriti热力学循环变温
    仪上进行。反应液(10μM引物,0.1μM单链模板DNA,1μM芘修饰探针
    S0,250μMMg2+和1.25u的Taq酶,加入PCRbuffer,总体积50μL)94℃
    加热3min。之后设置不同的循环次数0,5,10,15,20,30,40和80。每组引物
    延长试验同时进行6组重复试验。试验完毕,收集6个反应管中所有的反
    应液合并进行荧光测量。

    探针S0:5′–TCAACATCAGTCTGATAAGCTA–3′;

    引物:5′–GATCACTAATACGACTCACTATAGGG–3′;

    模板1:5′–TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCCTATAG
    TGAGTCGTATTAGTGATC–3′;

    模板2:5′-TCAACATCAGTGTGATAAGCTACCCTATAG
    TGAGTCGTATTAGTGATC–3′;

    探针S0中黑体T表示芘修饰位点(修饰策略同实施例3);模板链
    2中的错配碱基位置用下划线标出。

    相对应模板1的PCR产物是和探针完全互补的,因此在不同的循环
    次数下,体系的荧光发射强度随着循环次数的增加而增加(图8a);而对应
    模板2的产物是和探针有一个碱基错配,随循环次数的增加,荧光强度的
    增加不明显,并且荧光强度本身处于较低水平(图8b)。之后,本发明记录
    对应模板1和模板2,随着循环次数的增加,378nm处的荧光强度的变化
    (图8a)??梢钥吹?,对于PCR反应过程中的错配情况,探针可以有明显
    的识别;对于完全正确的PCR反应过程,在荧光强度达到饱和前,荧光
    强度与循环次数有明显线性关系。经过拟合为F378nm=1.33×[Cycle]+
    2.02且R2=0.99。以上表明,本发明提出的磷酸位置芘修饰核酸探针可
    以应用于PCR反应过程的实时监测。

    实验例3磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸探针的应用

    1、磷酸位置芘修饰核酸探针用于检测braf基因突变

    本发明提出的磷酸位置芘修饰寡聚核苷酸探针在和靶链配对前后,荧
    光增强显著,对错配碱基区分明显,有望应用于基因组的单碱基错配分析。
    于是,本发明首先进行了该探针对于人类黑色素瘤braf基因突变的检测。
    在braf基因中,发生于1860位点的T→A的突变,占据了黑色素瘤基因
    突变的很大一部分。于是,本发明采用与实施例3同样的修饰策略,针对
    该位点设计合成了一个新的20个碱基的核酸探针braf-S0,用于检测该突
    变,Braf-S0序列:5’-TCGAGATTTCTCTGTAGCTA-3’(黑体T表示
    芘修饰位点);Braf-wt序列:5'-TAGCTACAGTGAAATCTCGA-3’;
    braf-mut序列:5'-TAGCTACAGAGAAATCTCGA-3’。从图9中可以看
    出,braf-S0本身荧光发射极其微弱,当和完全配对的突变序列barf-mut
    结合后,荧光强度显著增强;而和野生型序列braf-wt结合后,荧光强度
    几乎没有增加。同时记录在378nm处的荧光强度,可以发现,相比于单
    链探针,荧光增强倍数高达38.6倍。针对野生型和突变型的显著差异,
    表明该探针有望应用于实体生物样本中的检测。

    2、磷酸位置芘修饰核酸探针用于区分braf基因V600突变型和野生型细

    本发明继续将核酸探针braf-S0应用于包含Braf基因V600突变型和
    野生型细胞的检测。

    分别从BRAF基因V600位点突变型及野生型的A375细胞和
    HEK-293A细胞中,利用trizol法提取总RNA,使用逆转录试剂盒
    (promega,CAS:A3500)获得cDNA文库。逆转录反应体系为:4μlMgCl2,
    2μl10×逆转录buffer,2μldNTP,0.5μlRNA酶抑制剂,15UAMV酶,1μl
    Oligo(dT)15,以及1μg总RNA。逆转录程序为:42℃15min,95℃5min,
    4℃5min。继而分别采用能够扩增突变型和野生型BRAF基因序列的引物
    对cDNA进行扩增。使用的引物如下:上游引物
    5’-TGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGT-3’;下游引物为
    5’-ATGGGACCCACTCCATCCAGATTTCT-3’(用于突变型)和
    5’-ATGGGACCCACTCCATCCAGATTTCA-3’(用于野生型),所有引物配
    置为10μM浓度的储备液。第一次PCR反应体系为20μL,包含10μlPCR
    反应预混液GoTaqPCRmastermix(2×),7μlddH2O,1μl上游引物,1μl
    下游引物,1μlcDNA。PCR程序为95℃,5min;95℃30s,60℃1min,
    72℃,1min,35个循环;反应结束后4℃冷却。该PCR产物稀释10倍
    至200μL作为模板母液,进行不对称PCR反应。反应体系为50μL,包含
    10μL上游引物,5μL下游引物,PCR反应预混液TakaraTaqVersion2.0
    (2×)25μL,模板溶液5μL和ddH2O5μL。PCR扩增反应在Veriti96孔热
    循环仪上完成,94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸1min,设定循
    环次数50,反应结束后4℃冷却。每组反应平行进行5次,反应结束合
    并反应液,加入10μM浓度的探针溶液30μL和ddH2O20μL,按照前文所
    述荧光测量方法进行测量。发射狭缝和激发狭缝宽度均为10mm。

    结果如图10所示。从图中可以看出,相比于单独荧光探针的荧光发
    射强度,野生型的PCR反应体系荧光强度只有很小幅度的增加,而突变
    型的PCR反应体系荧光强度增强十分明显,最大发射波长378nm处的强
    度增强可达10倍以上。由此可知,磷酸位置芘修饰的寡聚核苷酸探针可
    以通过不对称PCR对包含单碱基突变的细胞进行有效区分。

    实验例4苝修饰的i-motif核酸序列在不同pH值下的荧光性能实验

    一、在不同pH值下的荧光性能测定

    表2苝修饰的i-motif核酸序列


    荧光光谱的测量条件:寡聚核苷酸浓度1μM,10mMKH2PO4-K2HPO4
    缓冲液(pH分别为7.4、5.7),100mMNaCl。使用CaryEclipse荧光光度计
    在常温下测量。激发波长:425nm;激发狭缝:5nm;发射狭缝:5nm;
    检测高压:600V;扫描速度:240nm/min。系统对谱线做平滑处理。

    实验结果见图11,从结果可见,三条苝修饰的核酸序列在酸性条件
    下荧光较弱,在pH7.4条件下荧光增强。

    二、苝修饰的i-motif核酸的荧光强度与pH值的线性关系考察

    荧光光谱的测量条件:i-s-s-pery浓度1μM,10mMKH2PO4-K2HPO4
    缓冲液(pH分别为5.0、5.7、6.2、6.8、7.4、8),100mMNaCl。使用Cary
    Eclipse荧光光度计在常温下测量。激发波长:425nm;激发狭缝:5nm;
    发射狭缝:5nm;检测高压:600V;扫描速度:240nm/min。系统对谱线
    做平滑处理。实验结果见图12,从试验结果可见,pH值与苝修饰的核酸
    序列荧光强度存在线性对应关系。


    关于本文
    本文标题:发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6302279.html
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