• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 13
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩技巧公式软件: 一种产Β胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201811650420

    申请日:

    20181231

    公开号:

    CN109609579A

    公开日:

    20190412

    当前法律状态:

    公开

    有效性:

    审中

    法律详情: 公开
    IPC分类号: C12P23/00;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645 主分类号: C12P23/00;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/645
    申请人: 陕西师范大学
    发明人: 王静;孟永宏;刘梁;钱亚丹;杨凡
    地址: 710062 陕西省西安市长安南路199号
    优先权:
    专利代理机构: 61201 代理人: 高雪霞
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201811650420

    授权公告号:

    法律状态公告日:

    20190412

    法律状态类型:

    公开

    摘要

    本发明公开了一种产β?胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法,首先在解脂亚罗酵母中敲除β?胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的3?磷酸甘油脱氢酶gut2基因,然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的β?羟?β?甲戊二酸合成酶erg13基因,在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因;再游离表达解脂亚罗酵母内源的己糖激酶Hxk基因,筛选阳性转化子,得到产β?胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株,该菌株经发酵培养,并提取分离,纯化β?胡萝卜素,β?胡萝卜素含量可以达到26.6mg/g细胞干重。

    权利要求书

    1.一种产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:首先在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因,然后游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因,得到产β-胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。 2.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因的方法为: 以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物gut2-up-F和gut2-up-R,用保真酶Pfu PCR扩增gut2基因的上游同源臂,利用引物gut2-down-F和gut2-down-R,用保真酶Pfu PCR扩增gut2基因的下游同源臂;将gut2基因的上游同源臂插入到质粒pUra3的ApaI/SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up;将gut2基因的下游同源臂插入到质粒pUra3-gut2-up的NdeI/SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;down;将质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;down用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组中,得到敲除gut2基因的解脂亚罗酵母,即菌株Po1f(△gut2); 上述的质粒pUra3的碱基序列如SEQ ID No.1所示; 上述各引物序列如下: gut2-up-F:AGCTAGGGCCCGGGTTGGACAATATACAAATG gut2-up-R:ATGCAGCATGCTTGTTTGGGGTGGTGGGT gut2-down-F:ATGCGACTAGTCTGTATAGTAAAAGCGTATAGCC gut2-down-R:AGCGACATATGTCGTATAACTTGTAAGTATACAGTAACT。 3.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为: 以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-erg13; 以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13基因插入到质粒pJN44-erg13的单酶切位点SpeI,得到质粒pJN44-erg13-erg13; 上述各引物序列如下: erg13-assembly-smaI-F:CAGGTCGACTCTCCCATGTCGCAACCCCAGAACG erg13-assembly-smaI-R:ACTATCTGTTAACCCCTACTGCTTGATCTCGTACTTTCGTCG。 4.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为: 以质粒pJN44-erg13-erg13为模板,利用引物erg13-assembly-EcorI-F和erg13-assembly-spHI-R,用高保真酶KD plus PCR扩增两个拷贝数的erg13基因,并将两个拷贝数的erg13基因插入到pUra3-gut2-up\u0026amp;down的双酶切位点EcoRI和spHI,得到质粒pUra3-erg13-erg13;将质粒pUra3-erg13-erg13用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵母转化试剂盒转入菌株Po1f(△gut2)的基因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到菌株YL2; 上述各引物序列如下: erg13-assembly-spHI-F:CACCACCCCAAACAAGGAATTCGAGCTCGGTACCCG erg13-assembly-EcorI-R:GACCGCGATCGAATTTCAGGCGGCCGCGAATTC。 5.根据权利要求1所述的产β-胡萝卜素的基因工程菌的构建方法,其特征在于:所述游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因的方法为: 以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物Hxk-assembly-smaI-F和Hxk-assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增Hxk基因,将Hxk基因插入到含启动子PTEF和终止子Pxpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-Hxk;将质粒pJN44-Hxk用酵母转化试剂盒转入菌株YL2的基因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到产β-胡萝卜素的基因工程菌株; 上述各引物序列如下: Hxk-assembly-smaI-F:CAGGTCGACTCTCCCATGGTTCATCTTGGTCCCCGA Hxk-assembly-smaI-R:ACTATCTGTTAACCCCTAAATATCGTACTTGACACCGGGCT。 6.权利要求1的构建方法得到的产β-胡萝卜素的基因工程菌株。

    说明书


    一种产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法
    技术领域


    本发明属于代谢工程和组合生物学技术领域,具体涉及一种生产β-胡萝卜素的基
    因工程菌及其构建方法。


    背景技术


    β-胡萝卜素是存在于胡萝卜、枸杞等绿色蔬菜和黄色、橙色水果中的一种天然类
    胡萝卜素。在自然界有着广泛分布的β-胡萝卜素主要以全反式结构存在,包含着多个不饱
    和的共轭多烯双键,可以与自由基发生不可逆的氧化还原反应,得以具达到淬灭自由基、抗
    氧化、抑制单线态氧等的效果,并具有防癌、抗癌、延缓衰老等功能。从结构上看,一个β-胡
    萝卜素分子相当于两个分子的维生素A,作为已通过GRAS(美国FDA评价食品添加剂的安全
    性指标)的营养色素,β-胡萝卜素是安全的维生素A的来源,在人体内大量堆积不会影响健
    康,我国也作为营养增补剂和营养色素被列入《食品添加剂使用卫生标准GB-2760-96》。


    β-胡萝卜素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。相比于前
    两种生产方式,微生物发酵生产β-胡萝卜素具有不受光照、气候,场地等环境条件的限制,
    生产周期短,原料低廉易获取,加之产品具有安全性高、易纯化和着色力强等特点。β-胡萝
    卜素是一种脂溶性色素,它存储于脂质体中,而酿酒酵母是一种非产油酵母,积累的油脂量
    小于细胞干重的3%,这也限制了酿酒酵母作为表达宿主的应用;因此,寻找一种更具有优
    势的微生物势在必行。


    CN108359616A公开了一种β-胡萝卜素高产菌种及其应用,借助基因组装改造方
    法,将外源crtE、crtI和crtYB三个基因整合到酿酒酵母基因组中,构建了异源β-胡萝卜素
    合成途径,并敲除酵母基因组中YEL013W基因和YER042W基因,然后进行发酵,收集发酵培养
    物,提取β-胡萝卜素,结果显示该酿酒酵母中和β-胡萝卜素的生产能力显著提高。


    CN108118007A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌,通过基因工程
    方法向耶罗维解脂酵母引入来源于三孢布拉霉carRA基因和carB基因,进一步增强双香儿
    基焦磷酸合酶(GGS)和3-羟基-3-甲基乙酰辅酶A还原酶(HMG-CoAcata reductase)的表达,
    敲除3-磷酸甘油脱氢酶(gut2)与过氧化物酶(Pox2),获得了异源表达β-胡萝卜素的耶罗维
    解脂酵母菌株,发酵结果显示,该菌株发酵条件简单,β-胡萝卜素产量较高。


    CN105087408A公开了一种生产β-胡萝卜素的酵母菌株,该发明酵母菌株基因组上
    的GAL1、GAL7、GAL10基因被ERG12、tHMG1、ERG8基因替换掉;GAL80基因被MVD1、ERG10、IDI1
    基因替换;ERG9基因的启动子被替换;表达来源于三孢布拉霉的carG、carB和carRA基因,经
    过密码子优化,并优化酵母发酵培养基的碳源(葡萄糖、甘油和乙醇),结果显示乙醇作为碳
    源时可以明显促进β-胡萝卜素的合成,经发酵培养,最高可以产生64mg/Lβ-胡萝卜素。


    CN105779319A公开了一种重组酵母菌株及其构建方法和应用,通过选择特定的组
    成型启动子组合,搭配红发夫酵母来源的八氢番茄红素合成酶和番茄红素环化酶双功能酶
    基因CrtYB、GGPP合酶CrtE、八氢番茄红素去饱和酶CrtI,以及特定的酵母内源基因,经???br>化设计整合至酵母菌株基因组上并同源重组敲除ypl062w基因,获得一株全新的无需诱导
    剂的重组菌株,经发酵培养后,β-胡萝卜素产量为157.7mg/L(21mg/g DCW)。


    CN103865817A公开了一种产β-胡萝卜素基因工程菌的构建方法,主要步骤如下:
    利用来自红发夫酵母中β-胡萝卜素生产相关基因crtE、crtYB、crtI构建基因表达???,通
    过重叠PCR扩增获得基因表达???,所述的表达??榘ɑ蛏嫌蔚钠舳雍拖掠蔚闹罩?br>子。将外源基因片段同时转入酵母细胞内,通过同源整合到酵母基因组中,筛选获得阳性转
    化子,经发酵培养,β-胡萝卜素产量约6mg/g DCW。


    尽管目前已经有很多利用大肠杆菌和酿酒酵母合成β-胡萝卜素的报道,但是仍然
    没有相关的菌株被应用于工业化生产,究其原因,可能有以下几点:(1)β-胡萝卜素合成关
    键酶(八氢番茄红素脱氢酶,八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶)自身活性较低,异源表
    达后胡萝卜素合成量不高;(2)大肠杆菌会产生细胞毒素,用它做表达宿主生产胡萝卜素时
    存在食品安全风险;(3)β-胡萝卜素是一种脂溶性色素,它存储于脂质体中,而酿酒酵母是
    一种非产油酵母,积累的油脂量小于细胞干重的3%,这也限制了酿酒酵母作为表达宿主的
    应用;因此,增加脂质体的产生有助于β-胡萝卜素提高,寻找一种更具有优势的微生物势在
    必行。


    发明内容


    本发明所要解决的技术问题在于提供一种产β-胡萝卜素的基因工程菌株及其构
    建方法。


    解决上述技术问题所采用的产β-胡萝卜素的基因工程菌株由下述方法构建得到:
    首先在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因,然后游离表
    达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚
    罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因,再游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因,得到产
    β-胡萝卜素解脂亚罗酵母工程菌株。


    上述在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因的
    方法为:以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物gut2-up-F和gut2-up-R,用保
    真酶Pfu PCR扩增gut2基因的上游同源臂,利用引物gut2-down-F和gut2-down-R,用保真酶
    Pfu PCR扩增gut2基因的下游同源臂;将gut2基因的上游同源臂插入到质粒pUra3的ApaI/
    SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up;将gut2基因的下游同源臂插入到质粒pUra3-
    gut2-up的NdeI/SpeI双酶切位点,得到质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;down;将质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;
    down用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵母转化试剂盒转入解脂亚罗酵母Po1f基因组
    中,得到敲除gut2基因的解脂亚罗酵母,即菌株Po1f(△gut2)。


    上述游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因的方法为:以解脂亚
    罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-assembly-
    smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13基因插入到
    含启动子P
    TEF和终止子P
    xpr2的表达载体pJN44的单酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-erg13;以
    解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-smaI-F和erg13-
    assembly-smaI-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因,将扩增的erg13
    基因插入到质粒pJN44-erg13的单酶切位点SpeI,得到质粒pJN44-erg13-erg13。


    上述在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基
    因的方法为:以质粒pJN44-erg13-erg13为模板,利用引物erg13-assembly-EcorI-F和
    erg13-assembly-spHI-R,用高保真酶KD plus PCR扩增两个拷贝数的erg13基因,并将两个
    拷贝数的erg13基因插入到pUra3-gut2-up\u0026amp;down的双酶切位点EcoRI和spHI,得到质粒
    pUra3-erg13-erg13;将质粒pUra3-erg13-erg13用限制性内切酶ApaI进行线性化后,用酵
    母转化试剂盒转入菌株Po1f(△gut2)的基因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到
    菌株YL2。


    上述游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因的方法为:以解脂亚罗酵母Po1f的基
    因组DNA为模板,利用引物Hxk-assembly-smaI-F和Hxk-assembly-smaI-R,用保真酶KD
    plus PCR扩增Hxk基因,将Hxk基因插入到含启动子P
    TEF和终止子P
    xpr2的表达载体pJN44的单
    酶切位点SmaI,得到质粒pJN44-Hxk;将质粒pJN44-Hxk用酵母转化试剂盒转入菌株YL2的基
    因组中,经营养缺陷型SD筛选平板筛选后,得到产β-胡萝卜素的基因工程菌株。


    上述的质粒pUra3的碱基序列如SEQ ID No.1所示。


    上述各引物序列如下:


    gut2-up-For:AGCTAGGGCCCGGGTTGGACAATATACAAATG


    gut2-up-Rev:ATGCAGCATGCTTGTTTGGGGTGGTGGGT


    gut2-down-For:ATGCGACTAGTCTGTATAGTAAAAGCGTATAGCC


    gut2-down-Rev:AGCGACATATGTCGTATAACTTGTAAGTATACAGTAAC T


    erg13-assembly-smaI-For:CAGGTCGACTCTCCCATGTCGCAACCCCAGAA CG


    erg13-assembly-smaI-Rev:ACTATCTGTTAACCCCTACTGCTTGATCTCGT ACTTTCGTCG


    erg13-assembly-spHI-For:CACCACCCCAAACAAGGAATTCGAGCTCGGTA CCCG


    erg13-assembly-EcorI-Rev:GACCGCGATCGAATTTCAGGCGGCCGCGAAT TC


    Hxk-assembly-smaI-For:CAGGTCGACTCTCCCATGGTTCATCTTGGTCCCC GA


    Hxk-assembly-smaI-Rev:ACTATCTGTTAACCCCTAAATATCGTACTTGAC ACCGGGCT


    与现有技术相比,本发明的有益效果如下:


    本发明将糖酵解EMP途径中3-磷酸甘油醛向磷酸二羟丙酮转化所需的3-磷酸甘油
    脱氢酶gut2基因敲除,此基因的敲除大大提高了酵母菌体内油脂的储存量;将酵母自身的
    β-羟-β-甲戊二酸合成酶(HMG-CoA合成酶)erg13基因进行两个拷贝的过表达提高了目的基
    因的转录,从而提高β-胡萝卜素的产量;向糖酵解EMP途径中的第一步即葡萄糖向6-磷酸葡
    萄糖转化所需的己糖激酶Hxk基因转入解脂亚罗酵母,过表达提高了酵母对于葡萄糖的利
    用率,强化其自身β-胡萝卜素的合成能力进一步提高β-胡萝卜素的产量,使构建的基因工
    程菌株产β-胡萝卜素的含量达到26.6mg/g DCW,且菌株稳定性强。


    附图说明


    图1是构建解脂亚罗酵母生物合成β-胡萝卜素工程菌株整体策略图。


    具体实施方式


    下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明,但本发明的?;し段Р唤鱿抻?br>这些实施例。


    实施例1


    根据图1所示的解脂亚罗酵母中β-胡萝卜素生物合成途径,构建产β-胡萝卜素基
    因工程菌,具体构建方法如下:


    1、在解脂亚罗酵母中敲除β-胡萝卜素合成通路中糖酵解途径中的gut2基因


    首先以解脂亚罗酵母Po1f(NCBI网址为:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
    assembly/GCA_000590845.2)的基因组DNA为模板,根据PCR引物设计原则设计引物,以引物
    gut2-up-F和gut2-up-R,用保真酶pfu PCR扩增gut2基因(NCBI网址为:https://
    www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2906777)的上游同源臂,以引物gut2-down-F和gut2-down-
    R,用保真酶pfu PCR扩增gut2基因的下游同源臂,PCR扩增体系为:2×Easy Taq PCR
    SuperMix(全式金公司,产品编号:AS111)25μL、上游引物:gut2-up-F(10μM)1μL、gut2-up-R
    (10μM)1μL或者下游引物:gut2-down-F(10μM)1μL、gut2-down-R(10μM)1μL、genome DNA 5μ
    L、ddH
    2O 10μL,反应程序为:98℃变性3min,然后94℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min
    共35个循环后,72℃延伸10min,16℃降温10min,对上、下游同源臂的PCR产物进行纯化胶回
    收(800bp)。对质粒pUra3和上游同源臂的胶回收产物用限制性内切酶ApaI和SpeI(Thermo
    Fisher公司,产品编号:FD1414/FD1254)在37℃下处理2h,双酶切反应体系为:10×M green
    buffer 5μL、ApaI 2μL、EcoRⅠ2μL、pUra3/上游同源臂8μL、ddH
    2O 42μL,纯化并胶回收质粒
    载体(5088bp)和上游同源臂的DNA片段(800bp);将回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶
    (NEB公司,产品编号:M0367S)作用下进行连接反应,得到质粒pUra3-gut2-up。将得到的
    pUra3-gut2-up和下游同源臂的胶回收产物用限制性内切酶NdeI和SpeI在37℃下处理2h,
    双酶切反应体系为:10×M green buffer 5μL、NdeI 2μL、SpeI 2μL、pUra3-gut2-up/下游
    同源臂8μL、ddH
    2O 42μL,纯化并胶回收质粒载体(5882bp)和下游同源臂的DNA片段
    (800bp),回收的两个DNA片段在NEB DNA连接酶的作用下进行连接反应,得到质粒pUra3-
    gut2-up\u0026amp;down。用限制性内切酶ApaI对质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;down进行线性化,并对酶切产
    物进行胶回收(6656bp)。


    将活化的解脂亚罗酵母单菌落接种于2mL YPD培养基中,于30℃、180rpm过夜培养
    至菌液OD
    600在1.8左右,按照酵母转化试剂盒说明书(Zymo Research corporation,USA)操
    作,具体为:取1mL菌液于1.5mL干净的离心管中,离心(4000×g,4min),弃培养基,加入500μ
    L solution 1,涡旋混匀,离心(4000×g,4min),弃上清液,加入50μL solution 2,涡旋混
    匀,加入5μL胶回收产物(6656bp),震荡混匀,再加入500μL solution 3,涡旋混匀,于30℃、
    180rpm复壮培养,复壮时间为4h,涂布于相应的营养缺陷型SD筛选平板上;待菌落长出后,
    筛选橘红色的单菌落,得到菌株Po1f(△gut2)。


    2、游离表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因


    以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-F和erg13-
    assembly-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的erg13基因(NCBI网址为:https://
    www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2907642),扩增反应体系为:genome DNA2μL、erg13-
    assembly-F(10μM)1μL、erg13-assembly-R(10μM)1μL、10×PCR buffer for KOD-Plus 10μ
    L、dNTPs(2mM)4μL、KD-Plus(1U/μL)1μL、ddH
    2O 31μL,反应程序为:94℃变性5min,然后94℃
    变性30s、66℃退火30s、68℃延伸1min50s共35个循环后,68℃延伸10min,16℃降温10min。
    纯化并胶回收PCR产物(1372bp)。将含启动子P
    TEF和终止子P
    xpr2的表达载体pJN44用限制性
    内切酶SmaI(Thermo Fisher公司,产品编号:FD0663)在37℃下处理2h,单酶切反应体系为:
    10×M green buffer 5μL、SmaI 2μL、pJN44 10μL、Fast AP 5μL(Thermo Fisher公司,产品
    编号:EF0651,用于去磷酸化,防止载体自连)、ddH
    2O 25μL,纯化并胶回收载体的DNA片段
    (7532bp);将回收的两个DNA片段在Assembly Mix连接酶(全式金公司,产品编号:M0367S)
    作用下进行连接反应,得到含一个拷贝erg13基因表达??榈闹柿JN44-erg13。


    以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-F和erg13-
    assembly-R,用保真酶KD plus PCR(全式金公司,产品编号:M0367S)解脂亚罗酵母的erg13
    基因,纯化并胶回收PCR产物(1372bp)。将质粒pJN44-erg13用制性内切酶SpeI在37℃下处
    理2h,单酶切反应体系为:10×M green buffer 5μL、SpeI 2μL、pJN44-erg13 10μL、FastAP
    5μL、ddH
    2O 25μL,化并胶回收载体的DNA片段(8873bp);将回收的两个DNA片段在Assembly
    Mix连接酶(全式金公司,产品编号:M0367S)作用下进行连接反应,得到含两个拷贝erg13基
    因表达??榈闹柿JN44-erg13-erg13。


    以解脂亚罗酵母的基因组DNA为模板,利用引物erg13-assembly-F和erg13-
    assembly-R,用保真酶KD plus PCR(全式金公司,产品编号:M0367S)解脂亚罗酵母的erg13
    基因,纯化并胶回收PCR产物(1372bp)。将质粒pJN44-erg13-erg13用限制性内切酶SpeI在
    37℃下处理2h,单酶切反应体系为:10×M green buffer 5μL、SpeI 2μL、pJN44-erg13-
    erg13 10μL、FastAP 5μL、ddH
    2O 28μL,纯化并胶回收载体的DNA片段(11163bp);将回收的
    两个DNA片段在Assembly Mix连接酶(全式金公司,产品编号:M0367S)作用下进行连接反
    应,得到含三个拷贝erg13基因表达??榈闹柿JN44-erg13-erg13-erg13。


    分别将一个、两个和三个拷贝的erg13基因转化至解脂亚罗酵母(复壮时间为2h),
    得到三个不同的菌株,分别为YLe1、YLe2和YLe3,将这三个菌株分别进行发酵培养,首先将
    三个菌株的单克隆接种于含5mL种子培养液的试管中,在28℃、200rpm下培养24h,获得一级
    种子液;按1%的接种量转接至装液量为50mL的250mL摇瓶中,发酵培养基的组成为:10g/L
    酵母浸出物,20g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖,在28℃、200rpm下发酵培养144h,收集菌液,HPLC
    定量分析β-胡萝卜素的含量,结果显示当erg13基因为两个拷贝数时即菌株YLe2,β-胡萝卜
    素的含量最高。


    3、在敲除gut2基因的位置整合表达解脂亚罗酵母内源的两个拷贝数的erg13基因


    首先用限制性内切酶EcoRI和spHI将质粒pUra3-gut2-up\u0026amp;down在37℃下处理2h,
    双酶切反应体系为:10×M green buffer 5μL、EcoRI 2μL、SpeI 2μL、pUra3-gut2-up\u0026amp;down
    10μL、ddH
    2O 31μL,并对载体酶切产物进行胶回收(6630bp);以质粒pJN44-erg13-erg13为
    PCR模板,利用引物erg13-EcorI-F和erg13-spHI-R,用高保真酶KD plus PCR(全式金公司,
    产品编号:AP301)扩增两个拷贝数的erg13基因,扩增反应体系为:pJN44-erg13-erg13 2μ
    L、erg13-EcorI-F(10μM)1μL、erg13-spHI-R(10μM)1μL、10×PCR buffer for KOD-Plus 10
    μL、dNTPs(2mM)4μL、KD-Plus(1U/μL)1μL、ddH
    2O 31μL,反应程序为:94℃变性5min,然后94
    ℃变性30s、70℃退火30s、68℃延伸5min共35个循环后,68℃延伸10min,16℃降温10min。并
    胶回收PCR片段(4708bp)。将回收的两个DNA片段在Assembly Mix连接酶(全式金公司,产品
    编号:M0367S)作用下进行连接反应,得到在gut2基因位点表达两个拷贝erg13基因的整合
    质粒pUra3-erg13-erg13。按照步骤1的方法将质粒pUra3-erg13-erg13转化至菌株Po1f(△
    gut2)的基因组中,其中复壮时间为4h,涂布于相应的营养缺陷型SD筛选平板上;待菌落长
    出后,筛选橘红色的单菌落,得到菌株YL2。


    4、游离表达解脂亚罗酵母内源的Hxk基因


    以解脂亚罗酵母Po1f的基因组DNA为模板,利用引物Hxk-assembly-F和Kxk-
    assembly-R,用保真酶KD plus PCR扩增解脂亚罗酵母的己糖激酶Hxk基因(NCBI网址为:
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2906865),扩增反应体系为:genome DNA 2μL、Hxk-
    assembly-F(10μM)1μL、Hxk-assembly-R(10μM)1μL、10×PCR buffer for KOD-Plus 10μL、
    dNTPs(2mM)4μL、KD-Plus(1U/μL)1μL、ddH
    2O31μL,反应程序为:94℃变性5min,然后94℃变
    性30s、66℃退火30s、68℃延伸1min50s共35个循环后,68℃延伸10min,16℃降温10min。纯
    化并胶回收PCR产物(1636bp)。将含启动子P
    TEF和终止子P
    xpr2的表达载体pJN44用限制性内
    切酶SmaI在37℃下处理2h,单酶切反应体系为:10×M green buffer 5μL、SmaI 2μL、pJN44
    10μL、FastAP 5μL、ddH
    2O 28μL,纯化并胶回收载体的DNA片段(7532bp);将回收的两个DNA
    片段在Assembly Mix连接酶(全式金公司,产品编号:M0367S)作用下进行连接反应,得到含
    己糖激酶Hxk基因表达??榈闹柿JN44-Hxk。按照步骤1的方法将质粒pJN44-Hxk转化至菌
    株YL2的基因组中,其中复壮时间为2h,涂布于相应的营养缺陷型SD筛选平板上;待菌落长
    出后,筛选橘红色的单菌落,得到菌株YL3,即产β-胡萝卜素的基因工程菌株。


    实施例中各引物序列如下:


    gut2-up-For:AGCTAGGGCCCGGGTTGGACAATATACAAATG


    gut2-up-Rev:ATGCAGCATGCTTGTTTGGGGTGGTGGGT


    gut2-down-For:ATGCGACTAGTCTGTATAGTAAAAGCGTATAGCC


    gut2-down-Rev:AGCGACATATGTCGTATAACTTGTAAGTATACAGTAAC T


    erg13-assembly-smaI-For:CAGGTCGACTCTCCCATGTCGCAACCCCAGAA CG


    erg13-assembly-smaI-Rev:ACTATCTGTTAACCCCTACTGCTTGATCTCGT ACTTTCGTCG


    erg13-assembly-spHI-For:CACCACCCCAAACAAGGAATTCGAGCTCGGTA CCCG


    erg13-assembly-EcorI-Rev:GACCGCGATCGAATTTCAGGCGGCCGCGAAT TC


    Hxk-assembly-smaI-For:CAGGTCGACTCTCCCATGGTTCATCTTGGTCCCC GA


    Hxk-assembly-smaI-Rev:


    ACTATCTGTTAACCCCTAAATATCGTACTTGACACCGGGCT


    发明人采用实施例1得到的菌株YL3进行发酵培养,发酵培养基的组成为:首先将
    YL3的单克隆接种于含5mL种子培养液的试管中,在28℃、200rpm下培养24h,获得一级种子
    液;按1%的接种量转接至装液量为50mL的250mL摇瓶中,发酵培养基的组成为:10g/L酵母
    浸出物,20g/L蛋白胨,20g/L葡萄糖,在28℃、200rpm下发酵培养144h,收集菌液,HPLC定量
    分析β-胡萝卜素的含量,在发酵的时间为72h时,β-胡萝卜素的含量达到最高为26.6mg/g细
    胞干重。


    序列表


    \u0026lt;110\u0026gt; 陕西师范大学


    \u0026lt;120\u0026gt; 一种产β-胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法


    \u0026lt;160\u0026gt; 1


    \u0026lt;170\u0026gt; SIPOSequenceListing 1.0


    \u0026lt;210\u0026gt; 1


    \u0026lt;211\u0026gt; 5088


    \u0026lt;212\u0026gt; DNA


    \u0026lt;213\u0026gt; 大肠杆菌(Escherichia coli)


    \u0026lt;400\u0026gt; 1


    gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60


    cgcggtctag aataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatgactg gccaaactga 120


    tctcaagact ttattgaaat cagcaacacc gattctcaat gaaggcacat acttcttctg 180


    caacattcac ttgacgccta aagttggtga gaaatggacc gacaagacat attctgctat 240


    ccacggactg ttgcctgtgt cggtggctac aatacgtgag tcagaagggc tgacggtggt 300


    ggttcccaag gaaaaggtcg acgagtatct gtctgactcg tcattgccgc ctttggagta 360


    cgactccaac tatgagtgtg cttggatcac tttgacgata cattcttcgt tggaggctgt 420


    gggtctgaca gctgcgtttt cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct gcaacgtcat 480


    tgctggcttt catcatgatc acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga gagccattga 540


    cgttctttct aatttggacc gatagccgta tagtccagtc tatctataag ttcaactaac 600


    tcgtaactat taccataaca tatacttcac tgccccagat aaggttccga taaaaagttc 660


    tgcagactaa atttatttca gtctcctctt caccaccaaa atgccctcct acgaagctcg 720


    agctaacgtc cacaagtccg cctttgccgc tcgagtgctc aagctcgtgg cagccaagaa 780


    aaccaacctg tgtgcttctc tggatgttac caccaccaag gagctcattg agcttgccga 840


    taaggtcgga ccttatgtgt gcatgatcaa aacccatatc gacatcattg acgacttcac 900


    ctacgccggc actgtgctcc ccctcaagga acttgctctt aagcacggtt tcttcctgtt 960


    cgaggacaga aagttcgcag atattggcaa cactgtcaag caccagtacc ggtgtcaccg 1020


    aatcgccgag tggtccgata tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc 1080


    tggcctgcga gctggtgccg aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga 1140


    ctacgagaac tcccagtaca aggagttcct agtcccctct cccaacgaga agctggccag 1200


    aggtctgctc atgctggccg agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc 1260


    caagcagacc attgagcttg cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca 1320


    gaaccgacct aagggcgact ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga 1380


    cgacaaggga gacgctctcg gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg 1440


    aacggatatc ataattgtcg gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga 1500


    ggccaagcga taccagaagg ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt 1560


    agactatgga tatgtaattt aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt 1620


    tcagcttgta tgatggtcag acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct 1680


    gtgtatccgc atgatctgtc caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct 1740


    gggtacagtg ctaatacgtt gaactactta tacttatatg aggctcgaag aaagctgact 1800


    tgtgtatgac ttattctcaa ctacatcccc agtcacaata ccaccactgc actaccacta 1860


    caccaaaacc atgatcaaac cacccatgga cttcctggag gcagaagaac ttgttatgga 1920


    aaagctcaag agagagaagc caagatacta tcaagacatg tgtcgcaact tcaaggagga 1980


    ccaagctctg tacaccgaga aacaggcctt tgtcgacgaa gctctaaagc tgaaacggga 2040


    catcgaaaag ttggagaagt caatctggaa actacacgta gaaaacagac accatataac 2100


    ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg cgcatcacta gtgaattcgc ggccgcctgc 2160


    aggtcgacca tatgggagag ctcccaacgc gttggatgca tagcttgagt attctatagt 2220


    gtcacctaaa tagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 2280


    cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 2340


    aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 2400


    acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 2460


    ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 2520


    gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2580


    caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 2640


    tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 2700


    gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 2760


    ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 2820


    cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 2880


    tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 2940


    tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 3000


    cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 3060


    agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 3120


    agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 3180


    gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 3240


    aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 3300


    ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 3360


    gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 3420


    taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 3480


    tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 3540


    tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 3600


    gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 3660


    gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 3720


    ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 3780


    cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 3840


    tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 3900


    cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 3960


    agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 4020


    cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 4080


    aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 4140


    aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 4200


    gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4260


    gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4320


    tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 4380


    ttccccgaaa agtgccacct gatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4440


    taccgcatca ggaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 4500


    aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 4560


    aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 4620


    acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 4680


    aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 4740


    ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 4800


    aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 4860


    gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc attcgccatt 4920


    caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct 4980


    ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc 5040


    acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gtaatacgac tcactata 5088


    关 键 词:
    一种 胡萝卜素 基因工程 及其 构建 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:一种产Β胡萝卜素的基因工程菌及其构建方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6154681.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03