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    重庆时时彩不定胆: 一种马尾松原生质体制备方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201910014852

    申请日:

    20190108

    公开号:

    CN109554330A

    公开日:

    20190402

    当前法律状态:

    实质审查的生效

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效
    IPC分类号: C12N5/04 主分类号: C12N5/04
    申请人: 广西壮族自治区林业科学研究院
    发明人: 姚瑞玲;王胤
    地址: 530002 广西壮族自治区南宁市邕武路23号
    优先权:
    专利代理机构: 45123 代理人: 卢颖
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201910014852

    授权公告号:

    法律状态公告日:

    20190426

    法律状态类型:

    实质审查的生效

    摘要

    本发明公开了一种马尾松原生质体制备方法,选用组培继代培养良好的马尾松悬浮胚性细胞为材料,经过离心沉降进行细胞分离,以纤维素酶、果胶酶、离析酶为分解酶进行细胞酶解,再经过清洗、纯化过程,获得了产量高、活力强的马尾松纯净原生质体。本发明操作方法简单,并提供了一套完整的马尾松原生质体制备的方法,为今后开展马尾松原生质体培养、细胞融合、细胞膜结构功能分析和转基因技术方面的研究提供了有力的保障,具有较好的经济效益和社会效益。

    权利要求书

    1.一种马尾松原生质体制备方法,其特征在于:其操作步骤如下: (1)分离:将组培继代4个月的马尾松胚性悬浮细胞在离心力为20×g的条件下离心5~8 min,弃上清液,取出离心沉淀细胞备用; (2)酶解:将步骤(1)中得到的离心沉淀细胞置于三角瓶中,加入等体积的酶解液, 然后置于转速为55~60 rpm的摇床上,在温度21.5~22.5℃、暗光的条件下酶解5~8 h,即可得到含有原生质体的混合液; (3)清洗:收集步骤(2)中所得到的混合液置于离心管中,离心后弃上清液,再加入等体积的清洗液进行离心后弃上清液,然后重复加入等体积的清洗液并离心操作2次后,即可得到浓缩细胞; (4)纯化:收集步骤(3)中得到的浓缩细胞,然后加入等体积的缓冲液即得到纯净的马尾松原生质体。 2.根据权利要求1所述的马尾松原生质体制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的酶解液由以下质量体积浓度的组分组成:纤维素酶RS 25~35 g/L、纤维素酶R-10 4~8 g/L、果胶酶Y-23 6~8 g/L、离析酶R-10 2~4 g/L、硝酸钾1 g/L、磷酸二氢钠0.35 g/L、硫酸镁0.25 g/L、氯化钙0.95 g/L、氯化钾0.12 g/L、山梨醇135 g/L。 3.根据权利要求1所述的马尾松原生质体制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的清洗液由以下质量体积浓度的组分组成:氯化钙1.12 g/L、氯化钾0.04 g/L、氯化钠7 g/L、2-吗啉乙磺酸 150 g/L、葡萄糖1 g/L。 4.根据权利要求1所述的马尾松原生质体制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的离心是在离心力为15×g的条件下离心3~4 min。 5.根据权利要求1所述的马尾松原生质体制备方法,其特征在于:步骤(4)中所述的缓冲液由以下质量体积浓度的组分组成:山梨醇135 g/L、2-吗啉乙磺酸 150 g/L、氯化镁1.2 g/L。 6.一种如权利要求1~5中任意一项所述的马尾松原生质体制备方法制备得到的马尾松原生质体的应用,其特征在于:所述的马尾松原生质体可以在马尾松原生质体培养、荧光标记、膜细胞结构功能分析和转基因技术中应用。

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