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    重庆时时彩开奖结果统计: DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法和表达纯化方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201910025199

    申请日:

    20190111

    公开号:

    CN109576254A

    公开日:

    20190405

    当前法律状态:

    公开

    有效性:

    审中

    法律详情: 公开
    IPC分类号: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12Q1/533 主分类号: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12Q1/533
    申请人: 吴江近岸蛋白质科技有限公司
    发明人: 邹媛华;朱梦洁;王笃强
    地址: 215200 江苏省苏州市吴江区吴江经济开发区科技创业园综合楼
    优先权:
    专利代理机构: 11350 代理人: 汤东凤
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201910025199

    授权公告号:

    法律状态公告日:

    20190405

    法律状态类型:

    公开

    摘要

    本发明提供了DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法,该DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法为构建DNA拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达纯化。本方采用重组蛋白制备技术,制备天花病毒的DNA拓扑异构酶Ⅰ,该蛋白具有识别特异性DNA序列5’?(T/C)CCTT?3’的特点,且制备过程简便,成本低,为DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究和应用奠定基础。本发明有以下特点:产量高:可达到1mg/g菌体的收率;制备简便:两步纯化即获得纯度高,核酸残留检测合格的样品,工艺简便易于重复;具有位点特异性:能够切割特定序列且样品活性稳定。本发发明还提供了DNA拓扑异构酶Ⅰ的纯化方法。

    权利要求书

    1.DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法,其特征在于,所述DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法为构建DNA拓扑异构酶Ⅰ的原核表达载体,转入工程菌中,经培养后,获得表达菌株,然后进行表达纯化。 2.根据权利要求1所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法,其特征在于,所述拓扑异构酶Ⅰ到原核表达载体使用pet30a,所述工程菌为BL21(DE3)。 3.根据权利要求1所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法,其特征在于,所述拓扑异构酶Ⅰ为重组DNA拓扑异构酶Ⅰ其氨基酸序列如SEQ ID No.3:MRALFYKDGKLFTDNNFLNPVSDNNPAYEVLQHVKIPTHLTDVVVYGQTWEEALTRLIFVGSDSKGRRQYFYGKMHVQNRNAKRDRIFVRVYNVMKRINCFINKNIKKSSTDSNYQLAVFMLMETMFFIRFGKMKYLKENETVGLLTLKNKHIEISPDKIVIKFVGKDKVSHEFVVHKSNRLYKPLLKLTDDSSPEEFLFNKLSERKVYECIKQFGIRIKDLRTYGVNYTFLYNFWTNVKSISPLPSPKKLIALTIKQTAEVVGHTPSISKRAYMATTILEMVKDKNFLDVVSKTTFDEFLSIVVDHVKSSTDGLEHHHHHH。 4.DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法,其特征在于,所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的制备方法中所述表达纯化步骤如下: 步骤1,将获得的菌种1:100接种到LB培养基中,37℃,250rmp震荡培养到OD600=0.6时,加入1mM IPTG诱导表达,同时低温诱导表达,转离心收菌; 步骤2破菌,菌体总量与破菌缓冲液1∶10混合,超声破菌,转离心收集上清。 5.根据权利要求4所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法,其特征在于,所述破菌缓冲液为50mM Tis-Hcl,500mM NaCl混合溶液pH8.0。 6.根据权利要求5所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法,其特征在于,所述纯化的方法为镍柱纯化。 7.根据权利要求6所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法,其特征在于,所述纯化步骤如下: 步骤3.1第一步平衡:用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,500mMNaCl,10mM咪唑)平衡柱子,缓冲液及样品中不可有EDTA,Arg等物质,直至pH达到8.0,紫外检测读数稳定,一般为5~10个柱体积,检测调零后可以上样; 步骤3.2第二步上样:样品应保持澄清,如发现沉淀浑浊则需要离心,收集流出; 步骤3.3第三步平衡:上样结束,用平衡缓冲液平衡层析柱,直到紫外检测读数回到基线或相对稳定; 步骤3.4第四步预洗:用预洗缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,500mMNaCl,50mM咪唑)预洗,收集洗脱组分; 步骤3.5第五步洗脱:用洗脱液(20mM Tris-HCl,pH8.0,500mMNaCl,200mM咪唑)洗脱目标蛋白,收集洗脱组分; 步骤3.6第六步洗柱:用洗柱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,500mMNaCl,500mM咪唑)冲洗层析柱,收集洗脱组分。 8.根据权利要求6所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的表达纯化方法,其特征在于,所述步骤3.6后再经过疏水柱纯化,所述再经过疏水柱纯化步骤如下: 4.1第一步平衡:用缓冲液(20mM Tris,1M(NH4)2SO4,pH8.0)平衡柱子,直至紫外检测读数稳定,一般为5~10个柱体积,检测调零后可以上样; 4.2第二步上样:样品应保持澄清,如发现沉淀浑浊则需要离心,样品中离子强度不宜超过5ms/cm,收集流出; 4.3第三步平衡:上样结束,用平衡液平衡层析柱,直到紫外检测读数回到基线或相对稳定; 4.4第四步洗脱:用不同盐浓度:1)20mM Tris,800mM(NH4)2SO4,pH8.0;2)20mM Tris,400mM(NH4)2SO4,pH8.0;3)20mM Tris,200mM(NH4)2SO4,pH8.0;4)20mM Tris,pH8.0;5)ddH2O; 收集低盐洗脱的蛋白质样品,得到所需的DNA拓扑异构酶Ⅰ。 9.DNA拓扑异构酶Ⅰ的活性检测方法,其特征在于,所述活性检测方法使用权利要求1~7任意一种方法获得的DNA拓扑异构酶Ⅰ作用底物A和B,能够连接成大片段则证明制备的重组DNA拓扑异构酶Ⅰ具有识别并切割5’-(T/C)CCTT-3’序列的活性。 10.根据权利要求9所述的DNA拓扑异构酶Ⅰ的活性检测方法,其特征在于,所述底物A和B的序列分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。

    关 键 词:
    DNA 拓扑 异构酶 制备 方法 表达 纯化
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