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    怎么看重庆时时彩走势图: 利用铜离子特异性DNA和SYBRGREENI荧光法检测铜的方法.pdf

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    利用 离子 特异性 DNA SYBRGREENI 荧光 检测 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410183078.1

    申请日:

    2014.05.02

    公开号:

    CN103940797A

    公开日:

    2014.07.23

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20140502|||公开
    IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
    申请人: 上海交通大学
    发明人: 周培; 詹深山; 徐涵楚; 詹学佳; 张暐霖; 吕晶
    地址: 200240 上海市闵行区东川路800号
    优先权:
    专利代理机构: 上海交达专利事务所 31201 代理人: 王毓理;王锡麟
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410183078.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.07.06|||2014.08.20|||2014.07.23

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种水质检测技术领域的利用铜离子特异性DNA和SYBR?Green?I荧光法检测铜的方法,通过含有铜离子特异性DNA的检测液制备得到标准铜离子检测体系,通过与空白对照液共同检测荧光强度后制成浓度‐相对荧光强度标准曲线;最终在检测时通过将待测水样置于含有铜离子特异性DNA的检测液中,经检测荧光强度并对照标准曲线实现铜离子浓度的检测。本发明通过比较荧光信号的变化,即可实现对铜离子的检测。本方法提供的检测方法灵敏度高选择性好,最低检测限为5.57ppb,操作简便快捷且不依赖大型仪器设备,可用于水体铜的实时原位检测。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法,其特征在于,通过含有铜离子特异性DNA的检测液制备得到标准铜离子检测体系,通过与空白对照液共同检测荧光强度后制成浓度‐相对荧光强度标准曲线;最终在检测时通过将待测水样置于含有铜离子特异性DNA的检测液中,经检测荧光强度并对照标准曲线实现铜离子浓度的检测;
    所述的铜离子特异性DNA,即Cu100序列为:(5'‐GATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGCT GGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC‐3')。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的标准铜离子检测体系是指:在若干支所述检测液中加入已知且不同浓度铜标准液后,进一步加入DNA嵌入剂SYBR Green I。

    3.  根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的空白对照液是指:在所述检测液中仅加入DNA嵌入剂SYBR Green I。

    4.  根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的检测荧光强度是指:采用石英荧光用比色皿,用荧光光度计进行扫描测定信号,并记录标准铜离子检测体系中的浓度铜CCu与其对应的相对荧光强度Q=[F0‐F]/F0,其中:F和F0分别为标准铜离子检测体系和空白对照液的荧光光谱信号。

    5.  根据权利要求1或4所述的方法,其特征是,所述的检测荧光强度的方式具体为:以激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱。

    6.  根据权利要求2所述的方法,其特征是,所述的不同浓度是指6~600ppb。

    7.  根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述的标准铜离子检测体系在25℃条件下避光孵育。

    8.  根据权利要求1或4所述的方法,其特征是,所述的浓度‐相对荧光强度标准曲线为:Q=0.307CCu+5.595。

    说明书

    说明书利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法
    技术领域
    本发明涉及的是一种水质监测技术领域的方法,具体是一种利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法。
    背景技术
    铜离子在环境监测及生物学领域是一种重要的金属离子。人体曝露于高浓度的铜离子会引发各种不利的健康效应,如胃病、肠病、肝脏或者肾脏损伤、老年痴呆症、个体Menkes、Wilson疾病以及朊病毒病等。鉴于此,美国环保署(EPA)将饮用水中铜离子的最高允许值定为1.25ppm(约20μM)。因此,建立高灵敏度、高选择性的铜离子检测方法具有重要的现实意义。
    传统的铜离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法,这些方法虽早已成熟并准确可靠,但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员,费力费时,难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的铜离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术,其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。最常见的用于铜检测的功能核酸是铜离子特异性核酸酶(DNAzyme),此类核酸酶检测铜的原理是其底物链中包含一个铜离子特异性酶切位点,铜离子可以特异性地从该位置将该底物链切断,通过将底物链的断裂过程转化成比色、化学发光和荧光等信号而达到检测目的。但核酸酶的一个缺点是其合成成本高,并且不稳定,容易失去活性。而单链寡核苷酸类的功能核酸具有合成成本低、稳定性好,易于转化为信号表达等优点,因此开发单链寡核苷酸类的铜离子特异性DNA来检测铜离子具有重大的研究价值和应用前景。
    荧光法是一种简便、快速、灵敏的检测方法,已结合功能核酸(尤其是单链寡核苷酸类的功能核酸)被用来检测多种物质,关于铜离子的检测也有报道,但这些方法或需要用荧光基团标记功能核酸,或用到核酸酶,涉及复杂的催化反应。而利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法较少见报道。
    经过对现有技术的检索发现,中国专利文献号CN103160504A,公开(公告)日2013.06.19,公开了一种食品安全技术领域的用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法,通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm处的荧光强度,得到所述探针对于铅离子的特异性结果,并通过荧光强度变化实现Pb22的定性检测;通过对探针中加入已知浓度的Pb2+,并且在260nm处扫描荧光强度,从而构建出Pb2+浓 度与荧光强度之间检测体系及其线性关系曲线;随后将待测样品在260nm处扫描出的荧光强度值代入线性关系曲线,从而得到Pb2+的浓度并实现定量检测。但该技术所用的核酸需要标记三个荧光基团,合成成本高;其核酸酶底物链中包含的腺嘌呤核糖核苷酸(rA)容易降解;特异性验证只涉及其他五种金属离子,存在一定的局限等。
    发明内容
    本发明针对现有技术存在的诸如:需要对核酸进行荧光标记、DNAzyme的合成成本高并且不稳定、涉及复杂的催化反应等缺陷,提出一种利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法,通过比较荧光信号的变化,即可实现对铜离子的检测。本方法提供的检测方法灵敏度高选择性好,最低检测限为5.57ppb,操作简便快捷且不依赖大型仪器设备,可用于水体铜的实时原位检测。
    本发明是通过以下技术方案实现的,本发明通过含有铜离子特异性DNA的检测液制备得到标准铜离子检测体系,通过与空白对照液共同检测荧光强度后制成浓度‐相对荧光强度标准曲线;最终在检测时通过将待测水样置于含有铜离子特异性DNA的检测液中,经检测荧光强度并对照标准曲线实现铜离子浓度的检测。
    所述的铜离子特异性DNA,即Cu100序列,如Seq ID No.1所示,具体为:
    (5'‐AGATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGC TGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC‐3')。
    所述的标准铜离子检测体系是指:在若干支所述检测液中加入已知且不同浓度铜标准液后,进一步加入DNA嵌入剂SYBR Green I。
    所述的空白对照液是指:在所述检测液中仅加入DNA嵌入剂SYBR Green I。
    所述的检测荧光强度是指:采用石英荧光用比色皿,用荧光光度计进行扫描测定信号,并记录标准铜离子检测体系中的浓度铜CCu与其对应的相对荧光强度Q=[F0‐F]/F0,其中:F和F0分别为标准铜离子检测体系和空白对照液的荧光光谱信号。
    所述的检测的方式具体为:以激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱。
    所述的不同浓度是指6~600ppb。
    所述的标准铜离子检测体系优选为在25℃条件下避光孵育。
    技术效果
    与现有技术相比,本发明不需要大型仪器设备,检测灵敏度高,选择性好,操作简单,可用于检测饮用水中的铜含量是否超标。
    附图说明
    图1为利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜示意图。
    图2为不同浓度铜加入到Cu100与SG形成的检测体系后的荧光信号示意图。
    图3为相对荧光强度与不同浓度铜的关系示意图。
    图4为不同金属离子加入到Cu100与SG形成的检测体系后的相对荧光强度示意图。
    具体实施方式
    下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的?;し段Р幌抻谙率龅氖凳├?。
    实施例1
    本实施例包括以下步骤:1)制备由铜离子特异性DNA(Cu100)形成的检测体系:在2mL刻度离心管中,分别加入10μL浓度为1μM的Cu100(序列为5'‐AGATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGC TGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC‐3')母液,补加去离子水至446.5μL,充分混匀后再将离心管置于25℃条件下备用。
    2)制备已知铜浓度的检测体系:取15支包含按步骤1)方法制备的由铜离子特异性DNA(Cu100)形成检测体系混合液的离心管,分别加入50μL不同浓度铜标准液,使得整个检测体系中的铜含量维持在6~600ppb,充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育30min后,加入50×SG母液3.5μL,25℃条件下避光孵育10min后,留作以下测定用。
    3)另取1支包含按步骤1)方法制备的由铜离子特异性DNA(Cu100)形成检测体系混合液离心管,加入50μL超纯水,按步骤2)方法处理后作为空白对照体系溶液。
    4)分别取500μL步骤2)和步骤3)制备的标准溶液和空白对照液,置于石英荧光用比色皿(内径为0.5cm×0.5cm,外径为1.0cm×1.0cm)中,用荧光光度计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为:激发光狭缝为10nm,发射光狭缝为10nm,激发光波长为490nm条件下扫描,获得其荧光信号光谱。铜和空白对照液的荧光光谱信号分别为F和F0,计算相对荧光强度Q=[F0‐F]/F0。
    5)以不同浓度铜(CCu)与对应的相对荧光强度Q作图,绘制标准曲线,其回归方程为Q=0.307CCu+5.595。
    6)制备样品检测体系:取50μL待测水样,加入到按步骤1)方法制备的由铜离子特异性DNA(Cu100)形成检测体系混合液离心管中,充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育30min后,加入50×SG母液3.5μL,25℃条件下避光孵育10min后按步骤4)方法测定其Q。
    7)根据样品测得的Q,查标准曲线,可以求得样品中铜含量。
    8)验证:用本方法测定3份含铜浓度分别为50ppb、100ppb和200ppb的多离子混合液各一份,得到的回收率为99.2%‐104.8%,证明了本方法的可靠性。
    9)本方法测定水体铜的浓度范围为5.57~600ppb,最低检测限为5.57ppb。

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