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    重庆时时彩前三和值走势图: 一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法及应用.pdf

    关 键 词:
    一种 信号 放大 电化学 发光 生物 传感器 制备 方法 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410181452.4

    申请日:

    2014.04.30

    公开号:

    CN103940808A

    公开日:

    2014.07.23

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/76申请日:20140430|||公开
    IPC分类号: G01N21/76; G01N27/327 主分类号: G01N21/76
    申请人: 青岛大学
    发明人: 赵凯; 张菲菲; 夏建飞; 王宗花; 孙娜; 迟德玲; 夏临华; 李延辉; 夏延致
    地址: 266071 山东省青岛市市南区宁夏路308号
    优先权:
    专利代理机构: 济南舜源专利事务所有限公司 37205 代理人: 邵朋程
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410181452.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.12.02|||2014.08.20|||2014.07.23

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,步骤如下:将金纳米粒子与黄嘌呤氧化酶溶液混合反应,然后加入TCEP处理过的DNA,继续反应可得纳米信标;将处理好的金电极浸泡至含有肯普肽的磷酸缓冲溶液中反应,再用巯基已烷封闭空白位点,然后放置于含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液中反应,随后分别用锆离子和纳米信标进行处理,通过锆离子与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰电极上,得到双信号放大电化学发光生物电极;将该电极作为工作电极,和参比电极、辅助电极正确连接在电化学工作站上以组成双信号放大电化学发光生物传感器。该传感器可应用于蛋白激酶的活性检测。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
    (1)纳米信标的制备
    将金纳米粒子与黄嘌呤氧化酶溶液混合反应,然后加入TCEP处理过的DNA,继续反应可得纳米信标;
    (2)磷酸化的肯普肽修饰电极的制备
    先将金电极进行预处理,然后将处理好的金电极浸泡至含有肯普肽的磷酸缓冲溶液中反应,反应完成后冲洗干燥;再用巯基已烷封闭空白位点,然后放置于含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液中,反应得到磷酸化的肯普肽修饰电极;
    (3)双信号放大电化学发光生物电极的制备
    将步骤(2)得到的磷酸化的肯普肽修饰电极清洗干净,随后将该电极置于50μL0.5mmol/L锆离子溶液中处理1h,得到锆离子修饰的电极,再置于30μL步骤(1)制备的纳米信标中,控制作用时间为10-100min,通过锆离子与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰电极上,得到双信号放大电化学发光生物电极;
    (4)双信号放大电化学发光生物传感器的制备
    将步骤(3)得到的双信号放大电化学发光生物电极作为工作电极,和参比电极、辅助电极正确连接在电化学工作站上以组成双信号放大电化学发光生物传感器。

    2.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述金纳米粒子采用如下步骤制得:将100mL浓度为0.01%g/ml的HAuCl4水溶液加热至回流,然后加入2.5mL浓度为1%g/ml的柠檬酸钠水溶液,在保持溶液沸腾条件下反应15min,溶液由无色逐渐变成酒红色为止,制得金纳米粒子,将制备的金纳米粒子置于冰箱中保存,备用。

    3.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中:所述黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为1mg/ml,按1mL金纳米粒子与20μL的黄嘌呤氧化酶溶液的比例混合,反应时间为2h;所述TCEP处理过的DNA的加入量为12μL,添加后于室温反应40min后,再在4℃过夜反应即可得金纳米粒子混合液,然后向金纳米粒子混合液中逐滴加入100μL1mol/L NaCl后,溶液颜色没有明显变化,离心分离多余的DNA和黄嘌呤氧化酶,最终得到纳米信标。

    4.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述金电极的预处理步骤如下:先将金电极分别用0.3和0.05μm的α-Al2O3粉末在麂皮上抛光打磨,然后依次在乙醇和去离子水中超声清洗,再在0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电化学清洗和活化。

    5.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中:所述含有肯普肽的磷酸缓冲溶液的pH值为7.4,缓冲溶液中磷酸的含量为0.05mol/L,肯普肽的含量为500μmol/L;将处理好的金电极浸泡至含有肯普肽的磷酸缓冲溶液中,反应温度为室温,反应时间为12h;所述巯基乙烷的浓度为1mmol/L;所述含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液的pH值为7.4,缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷的含量为50mmol/L,蛋白激酶的含量为0-100U/mL,腺嘌呤核苷三磷酸的含量为100μmol/L,电极置于含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液中,反应温度为37℃,反应时间为1h。

    6.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中:锆离子的浓度为0.5mmol/L,纳米信标的用量为30μL。

    7.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中:所述作用时间为60min。

    8.  根据权利要求1所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中:将双信号放大电化学发光生物电极置于磷酸缓冲溶液中,磷酸缓冲溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L,pH值为6.5-9.0,缓冲液中包含有5mmol/L的次黄嘌呤和100μmol/L的鲁米诺,采用三电极系统,饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极,铂丝为辅助电极。

    9.  根据权利要求8所述的一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,其特征于,所述磷酸缓冲溶液的pH值为7.8。

    10.  如权利要求1-9任一权利要求所制得的双信号放大电化学发光生物传感器应用于蛋白激酶的活性检测。

    说明书

    说明书一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法及应用
    技术领域
    本发明涉及一种新型的电化学发光生物传感器,具体地说是涉及一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法及应用。
    背景技术
    通过激酶调节的蛋白磷酸化是生物新陈代谢的一个重要的过程,它在信号传导和管理细胞活动方面起到重要的作用。蛋白激酶调节异?;岽蚵业鞍琢姿峄奶逑?,导致各种疾病的发生。因此,识别蛋白激酶活性及其抑制剂不仅有利于对生物代谢过程清晰的了解,而且也有利于疾病的早期发现和及时治疗。
    电化学发光(ECL)是电化学技术和发光技术的结合体。与传统电化学和发光技术相比,电化学发光不仅具有可控性和宽的动力学浓度检测范围,同时还可实现检测过程中电位和空间的可控性。因此运用该技术可实现对生物分子超灵敏的定性定量分析。随着纳米技术和信号放大技术的发展,具有生物相容性和大的比表面积的纳米材料结合信号放大技术也被融入到电化学生物传感器中,大大提高了传感性能,为发展新型的电化学生物传感器提供了很大的发展空间。
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,以及该方法所制备的电化学发光生物传感器的具体应用。
    本发明所采用的技术解决方案是:
    一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
    (1)纳米信标的制备
    将金纳米粒子与黄嘌呤氧化酶溶液混合反应,然后加入TCEP(三(2-氯乙基)磷酸酯)处理过的DNA,继续反应可得纳米信标;
    (2)磷酸化的肯普肽修饰电极的制备
    先将金电极进行预处理,然后将处理好的金电极浸泡至含有肯普肽的磷酸缓冲溶液中反应,反应完成后冲洗干燥;再用巯基已烷封闭空白位点,然后放置于含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-Hcl))缓冲液中,反应得到磷酸化的肯普肽修饰电极;
    (3)双信号放大电化学发光生物电极的制备
    将步骤(2)得到的磷酸化的肯普肽修饰电极清洗干净,随后该电极用50μL0.5mmol/L 锆离子处理1h,得到锆离子修饰的电极,再用30μL步骤(1)制备的纳米信标进行处理,作用时间为10-100min,通过锆离子与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰电极上,得到双信号放大电化学发光生物电极;
    (4)双信号放大电化学发光生物传感器的制备
    将步骤(3)得到的双信号放大电化学发光生物电极作为工作电极,和参比电极、辅助电极正确连接在电化学工作站上以组成双信号放大电化学发光生物传感器。
    优选的,步骤(1)中,所述金纳米粒子采用如下步骤制得:将100mL浓度为0.01%g/ml的HAuCl4水溶液加热至回流,然后加入2.5mL浓度为1%g/ml的柠檬酸钠水溶液,在保持溶液沸腾条件下反应15min,溶液由无色逐渐变成酒红色为止,制得金纳米粒子,将制备的金纳米粒子置于冰箱中保存,备用。
    优选的,步骤(1)中:所述黄嘌呤氧化酶溶液的浓度为1mg/ml,按1mL金纳米粒子与20μL的黄嘌呤氧化酶溶液的比例混合,反应时间为2h;所述TCEP处理过的DNA的加入量为12μL,添加后于室温反应40min后,再在4℃过夜反应即可得金纳米粒子混合液,然后向金纳米粒子混合液中逐滴加入100μL1mol/L NaCl后,溶液颜色没有明显变化,离心分离多余的DNA和黄嘌呤氧化酶,最终得到纳米信标。
    优选的,步骤(2)中,所述金电极的预处理步骤如下:先将金电极分别用0.3和0.05μm的α-Al2O3粉末在麂皮上抛光打磨,然后依次在乙醇和去离子水中超声清洗,再在0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电化学清洗和活化。
    优选的,步骤(2)中:所述含有肯普肽的磷酸缓冲溶液的pH值为7.4,缓冲溶液中磷酸的含量为0.05mol/L,肯普肽的含量为500μmol/L;将处理好的金电极浸泡至含有肯普肽的磷酸缓冲溶液中,反应温度为室温,反应时间为12h;所述巯基乙烷的浓度为1mmol/L;所述含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液的pH值为7.4,缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷的含量为50mmol/L,蛋白激酶的含量为0-100U/mL,腺嘌呤核苷三磷酸的含量为100μmol/L,电极置于含有蛋白激酶和腺嘌呤核苷三磷酸的TBS缓冲液中,反应温度为37℃,反应时间为1h。
    步骤(3)中:锆离子的浓度为0.5mmol/L,纳米信标的用量为30μL。
    步骤(3)中:所述作用时间优选为60min。
    优选的,步骤(4)中:将双信号放大电化学发光生物电极置于磷酸缓冲溶液中,磷酸缓冲溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L,pH值为6.5-9.0,缓冲液中包含有5mmol/L的次黄嘌呤和100μmol/L的鲁米诺,黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤产生双氧水,双氧水催化放大鲁米诺的发光,采用三电极系统,饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极,铂丝为辅助电 极。
    更为优选的,所述磷酸缓冲溶液的pH值为7.8。
    上述制备的双信号放大电化学发光生物传感器可应用于蛋白激酶的活性检测。
    本发明的有益技术效果是:
    (1)本发明构建了一种基于无机锆离子对磷酸化的蛋白的识别作用以及结合金纳米粒子和酶的催化的双重信号放大的电化学发光生物传感器,可实现蛋白激酶活性的灵敏、快速、简单检测。
    (2)本发明利用锆离子做连接剂,将信号放大部分与磷酸化部分连接,具有以下优势:1.价格实惠。锆离子属于无机金属材料,比抗原抗体或亲和素等生物类药品要便宜很多。2.选择性好,简单可行。根据磷酸化前后有无磷酸根,通过锆离子与磷酸根的强配位作用可选择性识别磷酸化的蛋白。3.药品易于保存,可多次使用。生物类的样品很容易被污染,而且一般存放条件严格,而无机金属离子只要室温保存即可。
    附图说明
    图1是双信号放大电化学生物传感器的构建及其在蛋白激酶活性检测的应用的示意图;
    图2为纳米信标的表征图;
    图3为电极层层组装的电化学阻抗表征图;
    图4为纳米信标温育之前(a)和温育之后(b)的ECL响应图;
    图5为ECL响应与不同浓度的PKA的关系图,浓度从a-g分别为:a-g:0.01,0.03,0.1,1,10,50,100U/mL。
    具体实施方式
    一种双信号放大电化学发光生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
    (1)纳米信标的制备
    将100mL浓度为0.01%g/ml的HAuCl4水溶液加入三颈烧瓶中,加热至回流,然后向三颈烧瓶中迅速倒入2.5mL浓度为1%g/ml的柠檬酸钠水溶液,在保持溶液沸腾条件下反应15min,溶液由无色逐渐变成酒红色为止,制得金纳米粒子,将制备的金纳米粒子(AuNPs)置于冰箱中保存,备用。
    取1mL金纳米粒子(AuNPs)与20μL浓度为1mg/ml的黄嘌呤氧化酶(XOD)溶液混合反应2h,然后加入TCEP处理过的DNA,室温反应40min后,在4℃过夜反应即可得[email protected]混合液。然后向混合液中逐滴加入100μL1mol/L的NaCl后,溶液颜色没有明显变化,离心分离多余的DNA和XOD,最终得到纳米信标 [email protected]。
    (2)磷酸化的肯普肽修饰电极的制备
    先将金电极分别用0.3和0.05μm的α-Al2O3粉末在麂皮上抛光打磨,然后依次在乙醇和去离子水中超声清洗,再在0.5mol/L的H2SO4溶液中进行电化学清洗和活化。将处理好的金电极浸泡至含有500μM肯普肽的磷酸缓冲溶液(0.05mol/L,pH7.4)中,并置于室温下反应12个小时,电极经过大量的磷酸缓冲溶液(PBS)和二次水冲洗,干燥。再用1mmol/L的巯基乙烷封闭空白位点,准备磷酸化实验。然后将处理好的肯普肽和巯基己烷修饰的电极放置于含有一定量的蛋白激酶(PKA)和100μmol/L腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的TBS(50mM pH=7.4)缓冲液中,在37℃反应一个小时,得到磷酸化的肯普肽修饰电极。
    (3)双信号放大电化学发光生物电极的制备
    将步骤(2)得到的磷酸化的肯普肽修饰电极清洗干净,随后将该电极置于50μL0.5mmol/L锆离子溶液中处理1h,得到锆离子修饰的电极,再置于30μL步骤(1)制备的纳米信标中,控制作用时间为60min,通过锆离子与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰电极上,得到双信号放大电化学发光生物电极。最后,该修饰电极用大量的PBS润洗。
    (4)双信号放大电化学发光生物传感器的制备
    将步骤(3)得到的双信号放大电化学发光生物电极作为工作电极,置于磷酸缓冲溶液中,磷酸缓冲溶液中磷酸的浓度为0.1mol/L,pH值为7.8,缓冲液中包含有5mmol/L的次黄嘌呤和100μmol/L的鲁米诺,黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤产生双氧水,双氧水催化放大鲁米诺的发光,采用三电极系统,饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极,铂丝为辅助电极,组成双信号放大电化学发光生物传感器。ECL测试采用循环伏安法,扫速为100mVs-1,扫描范围为0~0.6V。
    上述步骤制备的双信号放大电化学发光生物传感器可用于蛋白激酶活性分析检测。
    下面结合附图对上述传感器的构建机理、纳米信标的表征以及电化学表征等进行相关说明。
    1、传感器构建的机理
    图1是双信号放大电化学生物传感器的构建及其在蛋白激酶活性检测的应用的示意图。首先通过Au-S键作用将半胱氨酸功能化的肯普肽直接固定到金电极表面形成一层致密的组装层,巯基己烷被用来封闭电极表面的空白位点,以消除非特异性结合。在以ATP为共反应剂PKA催化磷酸化反应之后,分别用Zr4+和已制备的纳米信标处理该电极。通过Zr4+与磷酸根的配位作用将纳米信标组装于磷酸化的肯普肽修饰的电 极上。因为AuNPs可催化放大鲁米诺(Luminol)的ECL信号,并且纳米粒子大的比表面积和良好的生物相容性又可作为好的载体负载丰富的酶,酶催化反应产生双氧水,而双氧水又可催化鲁米诺Luminol产生ECL信号。所以,与未组装纳米信标的电极相比,组装了纳米信标之后的ECL信号会显著提高。
    2、纳米信标的表征
    上述步骤合成的AuNPs直径大约有18nm左右。而且,在合成纳米信标的过程中,逐滴加入1mol/L的NaCl的过程中,溶液的颜色基本不变,也可说明合成了稳定的纳米信标。
    为了进一步验证纳米信标的合成,利用H2O2在辣根过氧化氢酶(HRP)存在下可使2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)氧化生成绿色的自由基的机理,通过XOD催化产生H2O2,用比色和Uv-vis光谱来表征XOD及DNA是否修饰到AuNPs上。如图2在HRP和H2O2同时存在下ABTS有明显的蓝绿色,并且分别在645nm、734nm和815nm处出现很强的特征吸收峰(e)。当只有XOD加入HRP和ABTS的混合液中时(a),溶液颜色没有变化仍为无色。当AuNPs和酶的底物次嘌呤同时加入HRP和ABTS的混合液中时(b),溶液由无色变成微红,并只在520nm处出现AuNPs的特征峰,但是仍旧没有使ABTS变色及特征峰的出现。而在HRP和ABTS的混合液中同时加入纳米信标和酶的底物(c),或是同时加入酶和酶的底物(d),都能使溶液颜色变成蓝绿色,且出现相应的特征峰。说明该纳米信标上负载了酶,验证了纳米信标的合成。
    3、电化学表征
    生物传感器的组装过程可以通过电极界面修饰层对电子传递的阻碍或促进作用来表征。图3是用[Fe(CN)6]3-/4-作为电活性探针,用EIS来表征传感电极的组装过程。图3a为裸金电极的电极的电化学阻抗曲线图,半圆形的直径非常的小,说明了金电极的电子传递能力很强。随着肯普肽和封闭剂修饰到电极上之后(3b),半弧形逐渐变大,这是因为肯普肽和封闭剂属于惰性物质,在某种程度上阻碍了电子的传递。随着磷酸化过程的发生(3c),由于带负电的磷酸根的引入,对带负电的电活性探针存在一定的排斥作用。纳米信标结合到电极上后(3d),半圆圈直径继续变大,这是因为DNA、酶和金纳米粒子均带负电,排斥电子的传递。
    4、生物传感器的电化学响应
    图4是在0.1mol/L PBS(pH7.8)缓冲液中包含有5mmol/L的次黄嘌呤和100μmol/L鲁米诺。传感电极在进行磷酸化反应之后,经过锆离子的作用,与纳米信标温育前(a) 和温育之后(b)的信号对比,可以看出,两者虽然都有ECL信号,但是前者的响应非常的小,主要是溶液的背景响应。曲线b的响应显著增强,说明纳米信标的引入,可以极大地放大ECL信号。由此可以看出,蛋白激酶的活性越高,结合到电极表面的纳米信标就越丰富,进而对鲁米诺的电催化活性越大,ECL响应信号越强。
    5、检测限与线性范围
    利用此传感器检测了不同浓度的PKA的活性。从图5中可知,随着PKA浓度的增加,ECL信号不断增加最后达到稳定。而在PKA不存在的条件下,ECL信号响应较弱,这主要是由纳米信标非特异性吸附引起的。该ECL的传感器的检测限达到0.0095U/mL。这样的结果还比之前报道的一些电化学方法和荧光方法要低一到两个数量级。内插图显示了ECL的强度和PKA的浓度之间的线性关系。线性范围是0.01-50U/mL,相关系数,R=0.997(n=3)。该ECL传感器高的灵敏度和宽的线性范围主要归功于以下方面的原因。第一,ECL结合了电化学和化学发光两者的优势,具有产生高灵敏度的强大潜质。第二,AuNPs负载酶制备纳米信标极大的催化放大了ECL信号(酶催化产生的双氧水可催化Luminol的发光,金纳米粒子在偏碱性条件下也可很好的放大Luminol的发光信号),因此可提高检测灵敏性。第三,该酶的催化活性在pH为8左右时最大,也正好符合Luminol在碱性条件下发强光的优势。
    6、实际样品的检测
    用该生物传感器检测实际样品胎牛血清中不同浓度PKA的活性。胎牛血清(0.1mL)和50mmol/L pH=7.4TBS缓冲液以1:10的比例配置,取45μL胎牛血清的TBS缓冲液,加入5μL不同浓度的蛋白激酶得到蛋白激酶的最终浓度分别为1U/mL、10U/mL和50U/mL(50μL),检测其活性。每一个样品平行测定三次,取平均值,结果如下表1。
    表1

    从表1中可看出,回收率在90.3-101.1%,标准偏差均小于5%。这些结果表明,所制备的传感器可用于评估复杂生物样品中蛋白激酶的活性。
    综上所述,本发明基于锆离子特异性识别磷酸根的性质和纳米信标的双信号放大,构建了一种新型的双信号放大电化学发光生物传感器以用于蛋白激酶活性分析,结合 金纳米粒子负载丰富的酶催化放大ECL信号和负载的DNA-P与锆离子的识别作用,以及ECL本身灵敏性的优势,使得本传感器具有较高的灵敏度和宽的线性范围。结合以上优势,该传感器在未来的临床诊断及药物分析方面具有很大的应用前景。
    上述实施方式中所采用主要试剂与仪器的来源如下:
    蛋白激酶A(PKA,催化亚单位)来自于New England Biolabs(美国)??掀针难∮冒腚装彼嵝奘蔚目掀针?Kemptide,CLRRASLG),购买自吉尔生化(上海)。鲁米诺(luminol)和次黄嘌呤(HA)均购买自Sigma公司(美国)。ATP Disodium Salt(ATP)由鼎国生物提供(北京)。巯基己烷(1-Hexanethiol)来源于百鸣威公司(北京)。HAuCl4·3H2O(48%w/w)购买自上?;约凉?。TCEP处理过的DNA(DNA-P)购买自上海生工?;凄堰恃趸?XOD)购于上海源叶生物科技有限公司。1.0×10-2mol/L luminol母液是将鲁米诺添加于0.1mol/L氢氧化钠溶液中配制而成。磷酸缓冲溶液(PBS)是由Na2HPO4·12H2O和NaH2PO4·2H2O配制并且用氢氧化钠和磷酸调节pH值。其它试剂均为分析级购买自北京化学试剂公司。
    紫外可见吸收光谱(UV-vis)测试使用UV-3900分光光度仪(日本)。透射电子显微镜分析(Transmission Electron Microscope,TEM)使用H-7650B透射电子显微镜(日本)。ECL实验使用MPI-B多功能电化学分析系统(西安),光电倍增管(PMT)高压为600V。电化学阻抗谱(EIS)的测量使用SP-150电化学系统(Bio-Logic,法国)。电化学的表征实验是在以5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为氧化还原探针,并含有0.5mol/L KCl的电解质溶液中进行。EIS的频率范围为100mHz到100kHz。

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