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    重庆时时彩前三基本走势图: 风干污泥菌剂提高高羊茅抗盐性的方法.pdf

    关 键 词:
    风干 污泥 提高 高羊茅抗盐性 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410190937.X

    申请日:

    2014.05.08

    公开号:

    CN103937729A

    公开日:

    2014.07.23

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 1/20申请公布日:20140723|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20140508|||公开
    IPC分类号: C12N1/20; C12N1/14; C09K17/00; A01G1/00; A01G7/06; C12R1/885(2006.01)N; C12R1/38(2006.01)N; C12R1/465(2006.01)N 主分类号: C12N1/20
    申请人: 天津师范大学
    发明人: 多立安; 赵树兰; 王志旭
    地址: 300387 天津市西青区宾水西道393号
    优先权:
    专利代理机构: 天津市杰盈专利代理有限公司 12207 代理人: 朱红星
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410190937.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2014.08.20|||2014.07.23

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种风干污泥菌剂提高高羊茅抗盐性的方法。菌剂包括:施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;实验结果表明:施加污泥复合微生物菌剂能够显著提高高羊茅株高、生物量以及叶绿素含量,降低其丙二醛和脯氨酸的含量,增强高羊茅?;っ富钚?。总体来看,微生物菌剂在低肥力和盐渍化土壤中表现出较好的效果,这充分显示了微生物菌剂在盐碱地改良上的应用潜力。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种风干污泥菌剂,其特征在于它是由下述成分组成:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592。

    2.  权利要求1所述的风干污泥菌剂,其中所述的原料为:施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。

    3.  一种采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法,其特征在于按如下的步骤进行:
    (1)研制材料
    选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料,供试基质盐碱土取自河北省黄骅市海边;
    (2)复合微生物菌剂制备 
         复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线,选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1
      3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml(之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592;
    (3)实验设计
     1)将取自河北省黄骅市海边的供试基质盐碱土,按照不同比例与正常土混合,配成含盐量分别为0.2%,0.4%,0.8%的基质土,分别用:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液或;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液;
    2)将高羊茅植物种子分别播于盛有1Kg基质土的花盆中,每盆1.5g,每天统一定量给水,以保持培养基质有较好的水分状况,经常调换各培养容器位置,以保证光照一致,待植物生长到分蘖期的时候,以浇灌的形式加入上述不同处理的污泥微生物菌剂个15ml,持续处理35天后测定植物的各个指标,养期间实验室的平均温度为22-35℃;平均湿度为54.5%,光照为自然光,进行指标测定。

    4.  风干污泥菌剂在改良盐碱地方面的应用。

    5.  风干污泥菌剂在提高植物生长缓解盐胁迫对高羊茅造成伤害方面的应用;其中风干污泥菌剂为100倍的菌液稀释液。

    6.  风干污泥菌剂在提高高羊茅株高、生物量、叶绿素含量、?;っ富钚砸约氨?、脯氨酸含量方面的应用。

    说明书

    说明书风干污泥菌剂提高高羊茅抗盐性的方法
      
    技术领域
    本发明属于环境?;ぜ际趿煊?,涉及风干污泥菌剂提高高羊茅抗盐性的方法。 
    背景技术
    草坪的数量和质量是城市绿化水平的重要标志。目前,国内草坪建植的方式多种多样,铺设草皮虽然建坪成本高,但见效快,易操作,适用于所有草坪草,被广大绿化工作者普遍接受。北京市园林绿化局曾在2007年的首届京津地区草皮卷产业论坛上表示,到2020年,北京城市绿地率将达到44%至48%。天津泰达生态园林有限公司也在此介绍,滨海新区要建成宜居生态城区,规划2010年绿化率达额到40%,绿地覆盖率达到35%。因此,草皮卷市场空间非常大。冷季型草最适宜的播种时间是夏末初秋和早春,暖季型草坪草在春末夏初。在播种后40~50d后,草皮上的草坪草的覆盖率达95%以上时即可移坪。所以一般在五、六月份第一批草皮卷才可上市。如果能够缩短草皮生产的年周期,提早草皮上市时间,可大幅提高草皮卷的市场竞争力,提高人们的经济收入。而低温是限制草皮生产周期的主要因素。冬季低温还影响草坪草的绿期应用范围,降低其观赏价值。因此,要提早草皮卷上市时间以及建植高质量的草坪就必须深入细致地研究其抗寒性以便更好地在园林绿化中发挥其作用。 
    针对以上问题,目前研究集中于选取抗逆性强的草坪植物、应用保水剂、施加化学改良剂、施肥等措施。而微生物菌剂作为一种高效、环保的生物肥料,其抗逆促生作用已得到认可,其抗逆作用方面也有一定研究。 
    复合微生物菌剂由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种按合适比例共同培养,充分发挥群体的联合作用优势,取得较佳应用效果的一种微生物制剂,此类菌剂一般具有有种类全、配伍合理、见效快、投资少、操作简单、不造成二次污染等优点,现已广泛应用于农业、工业、医药和环保等各个领域。 
        施肥是农业生产及草坪养护管理中很重要的措施之一。在目前大部分选用的是无机肥。无机肥虽然能够及时补充土壤养分,但是大量使用却能对地表水、地下水以及空气造成污染,对环境构成威胁。施加微生物肥料是在较低的生态影响条件下维持较高产量的更加和谐的一种施肥方式.比如最经典的菌根真菌、根瘤菌、根际促生细菌等。它的优点主要表现在:1.创造良好的根际生态环境。2.提高土壤以及空气造成污染的供肥能力3.对环境资源的有效利用。4.降低作物对化肥的依赖。5.抑制病虫害的发生。其原因一是有益细菌的大量繁殖大植物根隙区域形成优势种群,抑制了病原微生物生长繁殖,降低了植物酶、多酚氧化酶等,参与植物的防御反应,提高植物的抗病虫害能力。6.减少农药污染等具有重要作用。同时,以城乡有机废弃物为基质,采用现代化的工业技术,制造成具有多种功能(如固氮、解磷、活钾等)再生型复合生物肥料,将对资源的循环利用,实现生态经济、社会效益一体化同样具有重要意义。 
    自20世纪70年代以来,欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂,很多已经开始进行大规模的生产,并形成了系列化的产品,主要用于处理生活污水,工农业废水以及其他一些化合物污染的治理。我国国内微生物发展状况经历了从50年代到90年代,从理论到实践,从单一菌种的利用到多个的混合应用,产品也从根瘤菌剂发展到复合微生物菌剂,相继取得了一些成果。 
    目前多数研究已表明,微生物制剂应用于农业生产,能促进植物生长,且无毒、无公害、无污染,能持久均衡地供给农作物氮磷钾元素的,被广泛开发用作生物肥料。目前研发的生物菌肥的热点产品主要包括:有机物料腐熟菌剂(也称发酵菌剂)、土壤修复菌剂、根瘤菌剂和溶磷菌剂、烟草等经济作物专用的功能菌剂、生物有机肥、抗旱菌剂等。美国哥斯达黎加大学应用EM技术来种植香蕉,有效减小了香蕉叶斑病的发生和线虫类的侵袭,大大提高了其营养价值和生产效率。 
    另外,复合微生物菌剂在畜禽养殖和水产养殖方面也有很明显的作用。复合微生物菌剂能防病抗病,提高成活率,提高生产性能,降低饲养成本,增加经济效, 改善产品品质,生产绿色食品。倪永珍等对鸡进行400d的EM饲喂结果表明,与对照组比较鸡的死亡率平均下降了35.5%。据石专林报道,在饲粮中添加5%的EM发酵饲料,可使肉仔鸡增重提高10.3%,料肉比下降7.8%。刘华周等试验也表明,蛋鸡日粮中 EM发酵饲料占20%时,蛋壳厚度增加6.99%,蛋白哈 氏单位提高10.31%,蛋黄颜色提高1.5罗氏级。 
    盐碱地(土),也叫盐渍土,是盐化土, 碱化土和盐碱土的总称。随着生态环境的不断恶化和人们不合理的开发利用,导致土壤盐碱化不断的加深扩大。除了沿海地区的氯化钠盐土外,许多内陆的干旱、半干早地区因不适当灌溉也形成了大面积的次生盐渍化土壤,近年来土壤盐渍化有日益加重的趋势。当前,全世界盐渍土面积约10亿公顷;我国盐渍土面积约3460万公顷,耕地盐碱化760万公顷,近1/5耕地发生盐碱化,其中原生盐化型、次生盐化型和各种碱化型分布分别占总面积的52%、40%和8%。而盐碱逆境胁迫是限制草坪草生长的一个主要环境因素之一。土壤盐渍化对作物的危害主要表现为引起植物生理干旱,抑制作物生长破坏光合作用功能,伤害植物组织,造成植物细胞膜伤害,使营养失衡等。出于城市绿化及环境?;さ男枰?,在盐碱土上建植草坪已不可避免。因此国内外许多草坪学者开始致力于草坪草抗盐碱品种筛选及抗盐碱机理的研究,取得了一定的研究结果。 
    目前,给草坪草施加微生物菌剂已有报道。王晓洁,真菌可以改良高羊茅、黑麦草等草坪植物的抗逆作用,提高了其抗寒性、抗旱性、抗水分胁迫以及抵抗生物危害的影响。有研究发现接种菌根真菌可使多年生黑麦草根系受到侵染,并可明显增加多年生黑麦草叶片中叶绿素含量,VA 菌根可促进黑麦草对 P、 F e 、 Cu、 M g 、 K、 B、 S i、 S 和N 等矿质养分的吸收,但却使黑麦草组织中M n 的浓度降低?;寡芯勘砻?,在干旱的条件下,丛枝菌根的侵染、菌丝的发育均良好,接种从枝菌根后,增强了白三叶草的抗旱能力。有也对五种押宝杆菌进行了研究,结果发现施加过微生物菌剂的黑麦草与没有施加菌剂的对照相比,其株高、干重、叶绿素含量、根系体积和总表面积、根系活力等都显著升高。 
    城市污泥是城市污水处理厂在各级污水处理净化后所产生的含水量75%-99%的固体或者流体状物质。它包括污水中的泥砂、纤维、动植物残体等固体颗粒及其凝结的絮状物,各种胶体、有机物及吸附的金属元素、微生物、病菌、虫卵、杂草种子等综合固体物质。城市污泥中出现的微生物主要由细菌、放线菌、 真菌以及原生动物和后生动物等,其中细菌是最主要成分,细菌主要有菌胶团细菌和丝状菌,数量可占污泥中微生物总量的90%-95%左右。 
    20世纪80年代之前,活性污泥菌群的研究主要以传统分离培养法为主。该方法从活性污泥中发现的主要优势菌群有:动胶杆菌属、丛毛单胞菌属、不动杆菌属、螺菌属、产碱杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属和假单胞菌属等。但是后来大量研究发现,在活性污泥中经典纯培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微生物总数的 1% ~15%。 
     20 世纪80年代后期,随着以16 S r RNA 为主要基石的细菌分子分类学的发展,PCR 技术、电泳技术、克隆库技术、荧光原位杂交和流式细胞术逐渐成为研究活性污泥菌群的主要手段,活性污泥中菌群的复杂性和多样性也以惊人的速度被人们认识,大量传统检测方法未能发现却在活性污泥中起关键作用的微生物陆续被发现,如具有除磷作用的类红环菌、小月菌、类Tetr asphaera 的棒状菌、俊片菌等;具有脱氮作用的反硝化生丝微菌属、固氮弧菌属相关菌、类硝化螺菌等;与污泥泡沫有关的诺卡氏菌形放线菌、丝状菌和等。 
    近期的相关文献及实际生产表明:微生物菌剂在促进植物生长的同时就还能够明显提高植物的抗病、抗旱能力,降低土壤pH和含盐量,提高植物的抗冻能力。尽管植物接种微生物的效应研究报道较多,但大部分研究工作涉及的微生物菌剂只限于从土壤或垃圾堆肥中提取。有关污泥内部微生物菌种之间共生及相互影响关系,以及污泥微生物菌剂应用对植物生长和生理特性的影响方面的研究较少;而在草坪植物抗逆中的应用则更是尚无文献报道。 
     城市污泥含有丰富的微生物种类,虽然有些是条件致病菌,但是也含有很多对植物有益菌种。例如假单胞菌的生防促生作用应经得到公认,这方面的研究报道也很多。固氮弧菌属有着高效的固氮作用,他能够侵入水稻、小麦和高粱根内,并提高了幼苗含氮量。并且污泥为微生物提供了一个天然的驯化场所,其微生物具有潜在利用价值。因此筛选污泥中微生物种,群筛选出合适的有益微生物菌株,配制成复合微生物菌剂,研究其对植物的促生作用已经植物在盐碱或寒冷等逆境条件下的影响是完全可行的。 
    随着草坪绿化日益收到人们重视的同时,见效快、益操作的草皮卷也日益被广大绿化工作者普遍接受。但这种方式会带走肥沃的表层土壤。为保证草皮品质,传统的草皮生产每完成一次生产过程,至少要铲去2 cm以上熟土,在同一地块连续生产3-4茬草皮之后,肥沃的农田便遭到破坏,最肥沃的有机质土壤层被剥离干净,造成土地贫瘠。有土草皮卷不仅严重的破坏耕地的质量,还会引起一系列的生态环保问题。而我国存在面积巨大的盐碱土地,在盐碱地上生产草皮卷可有效减轻耕地压力,因此盐碱土地存在巨大的潜在录用价值。 
    长期以来,盐碱土改良主要采用灌溉排水利用覆盖物施加化学改良剂等措施。近年来,微生物菌剂在盐碱地改良中作用的研究得到不断加强。宋家清等研究发现,施用菌肥后表土层铵态氮含量增加明显,速效钾含量一定程度增加,硫酸盐含量降低明显,土壤酸碱度降至中性。李翠兰等研究表明,施用菌剂有利于玉米苗期根系对营养元素的吸收尤其是磷素的吸收,在养分胁迫条件下菌剂起固氮解磷解钾作用,而当NPK养分充足时,菌剂的固氮解磷解钾作用降低,逄焕成等认为微生物菌剂对0 20cm土壤脱盐率有显著影响,与不加菌剂处理相比脱盐率提高9.04%,宋燕飞等研究认为盐胁迫下,施用复合微生物菌剂处理玉米幼苗能显著促进根的生长,增加根冠比和根体积,提高根系活力和根系活跃总吸收面积。洪坚平等在豌豆上试验也表明,施用菌剂能刺激作物生长,还通过土壤中营养元素的转化,提高豌豆植株含磷量。 
     本技术基于前期接种提取于污泥中的施氏假单胞菌,里氏木霉及灰黄链霉菌的复合微生物菌剂对草坪植物生理生态影响研究的基础上,筛选出合适的有益微生物菌株,配制成不同浓度的复合微生物菌剂接种到草坪建植体系中,进一步研究在盐碱胁迫条件下,复合微生物菌剂对栽培基质的保水性能及对高羊茅生理特性的影响,目的是为筛选优良抗旱污泥复合微生物菌剂,提高草坪植物抗盐性,为草坪植物在盐碱土壤上的建植提供科技支撑。 
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种风干污泥菌剂提高高羊茅抗盐性的方法。本发明的研制结果表明:高羊茅的生长状况随着培养基质盐含量的升高而降低。加入CM菌剂能显著提高植物的生长,缓解盐胁迫对高羊茅造成伤害。其中菌液100倍稀释液的效果要好于菌液200倍稀释液。说明复合微生物菌剂对缓解草坪植物盐胁迫有促进作用。为实现此目的,本发明提供如下的技术方案: 
    一种风干污泥菌剂,其特征在于它是由下述成分组成:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592;
    本发明优选的原料为:施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。
    本发明进一步公开了采用风干污泥菌剂提高高羊茅抗旱性的方法,其特征在于按如下的步骤进行: 
    (1)研制材料
    选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料,供试基质盐碱土取自河北省黄骅市海边;
    (2)复合微生物菌剂制备 
         复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线,选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592;
    (3)实验设计
     1)将取自河北省黄骅市海边的供试基质盐碱土,按照不同比例与正常土混合,配成含盐量分别为0.2%,0.4%,0.8%的基质土,分别用:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液或;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液;
    2)将高羊茅植物种子分别播于盛有1Kg基质土的花盆中,每盆1.5g,每天统一定量给水,以保持培养基质有较好的水分状况,经常调换各培养容器位置,以保证光照一致,待植物生长到分蘖期的时候,以浇灌的形式加入上述不同处理的污泥微生物菌剂个15ml,持续处理35天后测定植物的各个指标,养期间实验室的平均温度为22-35℃;平均湿度为54.5%,光照为自然光,进行指标测定。
    本发明更进一步公开了风干污泥菌剂在改良盐碱地方面的应用。特别是在提高植物生长缓解盐胁迫对高羊茅造成伤害方面的应用;其中风干污泥菌剂为100倍的菌液稀释液。同时风干污泥菌剂在提高高羊茅株高、生物量、叶绿素含量、?;っ富钚砸约氨?、脯氨酸含量也有显著的效果。 
    本发明更加详细的制备方法如下: 
    1 研制材料与方法
    1.1 研制材料
    (1)草种与土壤
       选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料。试的基质盐碱土取自河北省黄骅市海边。
    (2)菌株的培养 
    称取新鲜污泥,采用稀释分离法制备10-3、10-4、10-5、10-6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物,取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10-3、10-4,放线菌取10-4、10-5,细菌取10-5、10-6),摇匀后吸取0.2 mL加入到预先制好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板;放线菌用高氏一号琼脂平板;细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀,每处理重复 3次,28℃培养。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点,从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌株,进行编号保存,待进一步鉴定。
    (3)菌种的鉴定 
    镜检:细菌的鉴定采用革兰氏染色法,放线菌采用印片法,丝状真菌直接镜下观察。
    PCR鉴定:直接挑取单菌体溶于100 μL高纯水中,沸水中煮10 min裂解菌体,使DNA释放出来,直接作为PCR反应的模版。细菌和放线菌采用通用引物27f(5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’)和1492R(5’—GGTTACCTTGTTACGACTT— 3’)进行PCR扩增16S rRNA基因。真菌采用真菌核糖体18S rDNA的通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’)和 ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC —3’)进行PCR扩增。PCR反应程序如下:94℃2 min,94℃1 min,57℃1 min,72℃1 min,25个循环;72℃10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较。 
    (4)菌剂的配制 
    选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各1种,分别为假单胞菌、木霉和链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min适温培养,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种,配制成菌剂。
    1.2 复合微生物菌剂制备 
         复合微生物菌剂制备,选取对植物生长有利的细菌、真菌、放线菌各1种,分别为施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min适温培养,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂。
    1.3 实验设计 
    将取自河北省黄骅市海边的供试基质盐碱土,按照不同比例与天津师范大学校园内正常土混合,配成含盐量分别为0.2%,0.4%,0.8%的基质土,分别用T1、T2、T3表示。在此盐胁迫条件下设定处理方式:处理1为对照,不接种菌剂(CK);处理2加入施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液(CM1);处理3加入施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液(CM2)。各处理菌液均按体积比为1:1:1的比例混合后用无菌水稀释。将高羊茅植物种子分别播于盛有1Kg基质土的花盆中,每盆1.5g。每天统一定量给水,以保持培养基质有较好的水分状况,经常调换各培养容器位置,以保证光照一致。待植物生长到分蘖期的时候,以浇灌的形式加入上述不同处理的污泥微生物菌剂个15ml。各处理3次重复。持续处理35天后测定植物的各个指标。养期间实验室的平均温度为22~35℃;平均湿度为54.5 %。光照为自然光。
    1.4 测定指标 
    1.4.1 干旱胁迫条件下高羊茅动态株高变化
    高羊茅培植到分蘖期时,施加菌剂,10 d第一次测量株高,后没10d测量一次,共3次。
    1.4.2 地上生物量和地下生物量 
    待草坪植物生长35d后将草坪植物齐根刈割,地上部分和地下部分分别用蒸馏水冲洗干净,吸水纸吸干表面水分,放入烘箱中,在105℃下杀青1 h,80℃烘干至恒重,以其干重视为地上部分和地下部分的生物量。
    1.4.3 离体叶片持水力的测定 
    将准确称过鲜重的植物叶片,放入25℃~30℃的干燥器中,在黑暗条件下干燥2~6 h,再称量失水后叶片的重量,按下式计算失水率:失水率(%)=(鲜重-失水后重)/ 鲜重×100%    
    1.4.4 叶绿素含量的测定
    叶绿素含量的测定:取0.1 g叶片,剪成1-2 mm碎片,浸泡于丙酮:乙醇(V:V=1:1)溶液中24小时,浸泡液为待测液。用分光光度计于波长633 nm和645 nm下测量吸光值,并根据公式计算叶绿素含量;计算公式结果计算:
                                                               
    1.4.5 ?;っ富钚缘牟舛?
    POD活性测定采用愈创木酚法,3mL的反应混合液(pH 6.0的磷酸缓冲液50mL,加入愈创木酚28μL,加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢19μL,混合均匀,保存于冰箱中),加入酶液100μL,立即开启秒表计时,在470 nm波长下测量吸光度值,每隔0.5 min读数一次。以每分钟OD值变化表示酶活性的大小,即以△OD470/min表示。并以每分钟△A470变化0.01为一个过氧化物酶活性单位。
    SOD活性测定方法,采用NBT法。3ml反应混和液包括:0.05 mol pH=7.8磷酸缓冲液,0.1 mmol/L EDTA,13 mmol/L蛋氨酸,750 umol/L NBT,20 umol/L 核黄素和0.05 mL得酶提取液,不加酶液的为对照。在人工气候箱中照射20 min,不加酶液和无光照作为空白对照。然后迅速在560 nm下测定吸光值。以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位。 
    CAT活性测定采用紫外分光光度法,在试管中加入反应混合液(pH 7.8的磷酸缓冲液1.5ml、酶液0.2ml、蒸馏水1.0ml),对照管用缓冲液代替酶液,然后在测定管中加入0.3ml浓度为0.1mol/L的过氧化氢(30%过氧化氢1.13ml蒸馏水定容到100ml),同时立即计时,迅速在240nm波长下测量吸光度值,每隔0.5 min读数一次。以每分钟△A240变化0.01为一个过氧化氢酶活性单位。 
    1.4.6 丙二醛含量的测定 
    采用硫代巴比妥酸法;称取0.5 g叶片,用10%TCA提取,定容10 ml,4000 r·min-1离心10 min,取上层液2 ml再加入2 ml的0.6%TBA,沸水中15min,离心10 min,取上清液于532 nm和450 nm下测吸光值。
    1.4.7 脯氨酸含量的测定 
    采用酸性茚三酮比色法;称取0.5 g叶片剪碎,分别置于大试管中,然后分别加入10 ml 3%的黄基水杨酸,在沸水浴中提取10min(提取过程要经常摇动),冷却后在3000 r·min-1离心10min,吸取2ml提取液于另一干净的带塞试管中,加入2 ml冰醋酸及2 ml酸性茚三酮,沸水中加热30 min,冷却用4 ml甲苯提取,3000 r·min-1离心5 min,取上层液于520 nm下测吸光值。结果计算:标准曲线查出2 ml测定液中脯氨酸含量(ug/ml),然后计算样品中脯氨酸含量百分数。公式如下:

    1.5 数据分析
    采用Microsoft Excel 2003和 SPSS 11.5软件进行处理。
    2 研制结果分析 
    2.1 菌种筛选
    通过初筛和复筛,可以看出,所得微生物菌剂中富含施氏假单胞菌、里氏木霉、灰黄链霉菌,3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592。
    表1微生物菌剂所含的菌落数 菌剂1mL菌落数15 mL菌落数 OD600 nm    施氏假单胞菌   (2.15±0.03)×109(3.23±0.03)×10100.592±0.001里氏木霉 (2.01±0.13)×109 (3.01±0.13)×1010-灰黄链霉菌  (2.07±0.07)×109(3.11±0.07)×1010  2.150±0.003
     2.2微生物菌剂对盐碱胁迫下高羊茅株高的影响
    盐碱胁迫明显的抑制高羊茅株高(表2 )。随着盐胁迫程度的增加,高羊茅株高明显的降低。但加入污泥复合微生物菌剂后,明显的增加高羊茅株高,减轻因盐碱胁迫造成危害。而以稀释倍数为100倍后的微生物菌剂效果最好,在施加菌剂10天后,轻度胁迫下,高羊茅株高比对照高出了29.31%。中度胁迫和重度胁迫分别比对照高出了36.45%和38.84%。200倍数稀释菌液对缓解盐碱胁迫抑制高羊茅株高也具有一定的作用。施加菌剂20天和30天后也是相同趋势。
      表2 不同盐胁迫下微生物菌剂对高羊茅株高的影响(cm) 

    注:同行数据不同字母表示差异显著P<0.05
        T1代表基质土的含盐量分别为0.2%,T2代表基质土含盐量为0.4%,T3代表基质土的含盐量为0.8%。CK为不接种菌剂的对照处理,CM1为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液的处理,CM2为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液的处理。
    2.3  CM对盐胁迫下草坪植物地上生物量和地下生物量的影响 
    盐碱胁迫明显的抑制高羊茅地上生物量和地下生物量的积累(表3),盐碱
    胁迫和污泥复合微生物菌剂(CM)对高羊茅地上生物量和地下生物量的影响都比较显著(P<0.05)。随着盐胁迫程度的增加,高羊茅地上和地下生物量积累明显的减少。但加入污泥复合微生物菌剂后,明显的增加高羊茅地上和地下生物量的积累,减轻因盐胁迫造成危害。而以稀释倍数为100下的CM效果最好,轻度胁迫下,CM1组高羊茅地上生物量比对照高出19.13%,中度胁迫和重度胁迫分别比对照高出14.85%和26.83%。CM组三种不同程度胁迫下高羊茅地下生物量分别比对照高出了34%、18.18%、33.33%。
          表3 不同盐胁迫下微生物菌剂对高羊茅生物量的影响(盆/皿) 

    注:同行数据不同字母表示差异显著P<0.05
    T1代表基质土的含盐量分别为0.2%,T2代表基质土含盐量为0.4%,T3代表基质土的含盐量为0.8%。CK为不接种菌剂的对照处理,CM1为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液的处理,CM2为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液的处理。
    2.4  微生物菌剂对盐碱胁迫下高羊茅叶绿素含量的影 
        接种复合微生物菌剂能明显促进高羊茅叶绿素的增加(见表4),轻度盐胁迫处理下,复合微生物菌剂处理后,叶绿素a明显的增加(P<0.05),100稀释浓度下叶绿素a含量最高,是对照的12倍。随着盐胁迫程度的增加,叶绿素a的含量降低。叶绿素b含量在各复合微生物菌剂浓度处理及各盐胁迫下都有明显的差异。总叶绿素含量,在轻度盐胁迫下,以稀释100 浓度处理效果最好,是对照的1.67倍,稀释200倍浓度处理是对照的1.10倍,都和对照产生明显差异
    表4 CM对盐胁迫下高羊茅叶绿素含量的影响(mg·g-1FW)

    注:同行数据不同字母表示差异显著P<0.05
        T1代表基质土的含盐量分别为0.2%,T2代表基质土含盐量为0.4%,T3代表基质土的含盐量为0.8%。CK为不接种菌剂的对照处理,CM1为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液的处理,CM2为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液的处理。
    2.5 微生物菌剂对盐碱胁迫下高羊茅活性的?;っ富钚缘挠跋?nbsp;
    复合微生物菌剂处理后,高羊茅叶片三种?;っ负吭谌植煌潭妊涡财认戮灾哂谖唇又值亩哉罩仓?,且稀释100倍的微生物菌剂效果好于稀释200倍的微生物菌剂(表5)。轻度盐胁迫时,在100倍稀释液复合菌剂处理下,高羊茅叶片CAT活性、POD活性以及SOD活性分别比对照降升高了20.77%、20.91%、18.44%。中度盐胁迫时,在100倍稀释液复合菌剂处理下,高羊茅叶片CAT活性、POD活性以及SOD活性分别比对照降升高30.39%、13.48%、44.44%。重度盐胁迫时,在100倍稀释液复合菌剂处理下,高羊茅叶片CAT活性、POD活性以及SOD活性分别比对照降升高了30.83%、9.58%、40.57%。(P<0.05)。
    表5 不同程度盐胁迫条件下微生物菌剂对高羊茅?;っ富钚缘挠跋?nbsp;
     
    注:同行数据不同字母表示差异显著P<0.05
        T1代表基质土的含盐量分别为0.2%,T2代表基质土含盐量为0.4%,T3代表基质土的含盐量为0.8%。CK为不接种菌剂的对照处理,CM1为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液的处理,CM2为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液的处理。
    2.6 微生物菌剂对盐碱胁迫下高羊茅丙二醛和脯氨酸含量的影响 
        接种复合菌剂后高羊茅丙二醛和脯氨酸含量在不同程度盐胁迫下的变化见表6。从表上可以看出,不管是否接种复合微生物菌剂,高羊茅丙二醛和脯氨酸含量都随着盐含量的增加而升高。接种复合微生物菌剂能兵线降低丙二醛和脯氨酸含量,其中稀释100倍的复合微生物菌剂的效果要好与稀释200倍的飞鹤微生物菌剂。在稀释100倍菌液浓度处理下,丙二醛含量在三种不同程度盐胁迫下分别比对照降低了42.11%、31.37%和21.79。在稀释100倍菌液浓度处理下,丙二醛含量在三种不同程度盐胁迫下分别比对照降低了35.31%、31.49%和27.019%。
    表6盐碱胁迫下微生物菌剂对高羊茅丙二醛、脯氨酸含量的影响 
     
    注:同行数据不同字母表示差异显著P<0.05
        T1代表基质土的含盐量分别为0.2%,T2代表基质土含盐量为0.4%,T3代表基质土的含盐量为0.8%。CK为不接种菌剂的对照处理,CM1为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液的处理,CM2为接种施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液的处理。
    3 研制结论 
    研制结果表明,高羊茅的生长状况随着培养基质盐含量的升高而降低。加入CM菌剂能显著提高植物的生长,缓解盐胁迫对高羊茅造成伤害。其中菌液100倍稀释液的效果要好于菌液200倍稀释液。当施加菌液100倍稀释液后,在三种盐度梯度下,高羊茅的株高、生物量、叶绿素含量、?;っ富钚砸约氨?、脯氨酸含量与对照相比都有显著性差异。并且在盐含量0.4%的基质上的高羊茅施加菌液100倍稀释液后,其以上各指标均与盐含量0.2%的基质上的高羊茅相差不大,甚至要好于盐含量0.2%的基质上的高羊茅。说明复合微生物菌剂对缓解草坪植物盐胁迫有促进作用。
    可以看出,随着盐胁迫程度增加,高羊茅株高、生物量降低和叶绿素降低,丙二醛和脯氨酸含量升高,?;っ富钚越档?。本研究也得出类似结论,即施加污泥复合微生物菌剂能够显著提高高羊茅株高、生物量以及叶绿素含量,降低其丙二醛和脯氨酸的含量,增强高羊茅?;っ富钚?。总体来看,微生物菌剂在低肥力和盐渍化土壤中表现出较好的效果,这充分显示了微生物菌剂在盐碱地改良上的应用潜力。 
    附图说明: 
    图1为施氏假单胞菌的生长曲线                                    
       图2为黄链霉菌的生长曲线。
      
    具体实施方式:
    下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。其中所用到的化学试剂均有市售。其中施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌均由市售,也可以根据实施例1的方法加以配制。所述的马丁氏琼脂平板培养基、高氏一号琼脂平板培养基、牛肉膏蛋白胨平板培养基均有市售。
    实施例1 
     (1)菌株的培养
    称取新鲜污泥,采用稀释分离法制备10-3、10-4、10-5、10-6的污泥悬浮液。根据所分离的微生物,取不同浓度的污泥悬浮液 (真菌取10-3、10-4,放线菌取10-4、10-5,细菌取10-5、10-6),摇匀后吸取0.2 mL加入到预先制好的平板中。真菌用马丁氏琼脂平板;放线菌用高氏一号琼脂平板;细菌用牛肉膏蛋白胨平板。用灭菌的涂布器涂抹均匀,每处理重复 3次,28℃培养。根据平板内菌落的形态、大小、色泽和生长速度等特点,从每个样品尽可能多的挑取单菌落划线纯化。依据菌落培养性状和形态特征对菌株进行归类并统计数量。确定优势菌株,进行编号保存,待进一步鉴定。
    (2)菌种的鉴定 
    镜检:细菌的鉴定采用革兰氏染色法,放线菌采用印片法,丝状真菌直接镜下观察。
    PCR鉴定:直接挑取单菌体溶于100 μL高纯水中,沸水中煮10 min裂解菌体,使DNA释放出来,直接作为PCR反应的模版。细菌和放线菌采用通用引物27f(5’—AGAGTTTGATCCTGGCTCAG—3’)和1492R(5’—GGTTACCTTGTTACGACTT— 3’)进行PCR扩增16S rRNA基因。真菌采用真菌核糖体18S rDNA的通用引物ITS1(5’—TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3’)和 ITS4 (5’—TCCTCCGCTTATTGATATGC —3’)进行PCR扩增。PCR反应程序如下:94℃2 min,94℃1 min,57℃1 min,72℃1 min,25个循环;72℃10 min。扩增产物送至上海美吉基因公司测序。测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16S rDNA和18S rDNA序列进行同源性比较。 
    (3)菌剂的配制 
    复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min适温培养,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线。选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液或
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    实施例2
    一种风干污泥菌剂,其特征在于它是由下述成分组成:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592;
    按如下的步骤进行:
    (1)研制材料
    选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料。供试的基质盐碱土取自河北省黄骅市海边。
    (2)复合微生物菌剂制备 
         复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min适温培养,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线,选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂,施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌100倍稀释液。
    (3)实验设计 
     1)将取自河北省黄骅市海边的供试基质盐碱土,按照不同比例与天津师范大学校园内正常土混合,配成含盐量分别为0.2%,0.4%,0.8%的基质土,分别用施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液;
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的100倍稀释液;
    2)将高羊茅植物种子分别播于盛有1Kg基质土的花盆中,每盆1.5g,每天统一定量给水,以保持培养基质有较好的水分状况,经常调换各培养容器位置,以保证光照一致。待植物生长到分蘖期的时候,以浇灌的形式加入上述不同处理的污泥微生物菌剂个15ml,持续处理35天后测定植物的各个指标,养期间实验室的平均温度为22℃;平均湿度为54.5 %,光照为自然光,进行指标测定。
    实施例3 
    一种风干污泥菌剂,其特征在于它是由下述成分组成:
    施氏假单胞菌+里氏木霉+黄链霉菌200倍稀释液;
    其中施氏假单胞菌:里氏木霉:黄链霉菌的体积份数比为1:1:1;
    3菌种的菌落数在(2.15±0.03)×109/ml~ (2.07±0.07)×109/ml之间,假单胞菌的OD600 nm值为0.592;
    按如下的步骤进行:
    (1)研制材料
    选取挑选籽粒饱满、均匀一致的高羊茅 ( Festuca arundinacea L .) 种子为试验材料。试的基质盐碱土取自河北省黄骅市海边。
    (2)复合微生物菌剂制备 
         复合微生物菌剂制备:选取施氏假单胞菌、里氏木霉和灰黄链霉菌,将分离出的菌种纯化培养2代,取活化菌种,接入装有200 mL液体培养基的三角瓶中,180 r/min适温培养,选用600 nm波长进行比浊测定,以菌悬液的OD600 nm值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制微生物的生长曲线,选取对数生长期的菌种,按照下面要求配制复合微生物菌剂。
    (3)实验设计 
     1)将取自河北省黄骅市海边的供试基质盐碱土,按照不同比例与天津师范大学校园内正常土混合,配成含盐量分别为0.2%,0.4%,0.8%的基质土,分别用施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液(CM1);
    施氏假单胞菌+里氏木霉+灰黄链霉菌混合菌剂的200倍稀释液;
    2)将高羊茅植物种子分别播于盛有1Kg基质土的花盆中,每盆1.5g,每天统一定量给水,以保持培养基质有较好的水分状况,经常调换各培养容器位置,以保证光照一致。待植物生长到分蘖期的时候,以浇灌的形式加入上述不同处理的污泥微生物菌剂个15ml,持续处理35天后测定植物的各个指标,养期间实验室的平均温度为28℃;平均湿度为54.5 %,光照为自然光,进行指标测定。

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