• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 11
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩官方开奖记录: 水稻RUBISCO大亚基抗原表位、其抗体及应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410178847.9

    申请日:

    2014.04.30

    公开号:

    CN103952389A

    公开日:

    2014.07.30

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 9/88申请日:20140430授权公告日:20160120终止日期:20170430|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/88申请日:20140430|||公开
    IPC分类号: C12N9/88; C07K16/40; C07K16/06; G01N33/573 主分类号: C12N9/88
    申请人: 华中农业大学
    发明人: 唐红玲; 何莹; 李海霞; 曾汉来
    地址: 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
    优先权:
    专利代理机构: 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 代理人: 徐绍新
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410178847.9

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2018.05.18|||2016.01.20|||2014.08.27|||2014.07.30

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种水稻光合作用关键酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基抗原表位、抗水稻Rubisco大亚基的多克隆抗体及其制备方法与应用。水稻Rubisco大亚基特异性抗原表位的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示,经过多肽合成,多肽与载体蛋白偶联,免疫动物制得抗血清,并经过亲和层析纯化得到水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好,可与水稻Rubisco大亚基发生特异性结合反应,且制备成本低,得率高,为水稻Rubisco大亚基的基础研究及其相关生理功能的研究提供了一个重要的工具。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种水稻Rubisco大亚基的抗原表位,其多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。

    2.  权利要求1所述的抗原表位在制备水稻Rubisco大亚基多克隆抗体中的应用。

    3.  一种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体的制备方法,其特征在于:首先对权利要求1中所述的多肽的氨基酸序列进行末端修饰,然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联,得到抗原,用抗原免疫动物后,取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。

    4.  根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法,其特征在于:所述末端修饰为在权利要求1中所述的氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基,修饰后的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。

    5.  根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法,其特征在于所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白,偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。

    6.  根据权利要求3-5任何一项所述的制备方法得到的多克隆抗体。

    7.  权利要求6所述的多克隆抗体在检测水稻Rubisco大亚基中的应用。

    8.  一种检测水稻Rubisco大亚基的方法,其特征在于包括使用权利要求6所述的多克隆抗体的步骤。

    9.  一种检测水稻Rubisco大亚基的试剂,该试剂含有权利要求6所述的多克隆抗体。

    说明书

    说明书水稻Rubisco大亚基抗原表位、其抗体及应用
    技术领域
    本发明属于分子生物学和免疫学领域,具体涉及一种水稻光合作用关键酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亚基抗原表位,其抗体及应用。
    技术背景
    核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco;EC4.1.1.39)是植物叶片中含量最丰富的蛋白,占叶片总蛋白的12-35%及可溶性蛋白的50%。Rubisco是具有双重功能的光合碳同化的关键酶,一方面作为光合作用卡尔文循环中CO2固定的关键酶,参与催化CO2与核酮糖-1,5-二磷酸(ribulose-1,5-bisphosphate,RuBP)反应形成2分子3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate,3-PGA);同时又参与C3植物光呼吸过程,催化CO2与RuBP反应生成1分子的3-PGA和1分子的2-磷酸乙醇酸(2-phosphoglycolate,2-PG)。因此,Rubisco可以作为评价植物光合作用能力的生化指标,研究Rubisco的结构稳定性与降解机理对探索植物光合作用能力和调控作物生长具有重要意义。
    高等植物的Rubisco对生长环境中的营养供应、光照、温度、病虫害和叶片年龄变化较为敏感,表现为结构上的变化,在不利条件下发生解体,从而降低光合作用功能,影响产量与品质的形成。经研究,在水稻Rubisco组成的大、小亚基中,大亚基对环境因素反应更为敏感。同一种植物中,不同基因型的Rubisco大亚基的稳定性存在差异,高产品种的Rubisco大亚基结构通常具有较好的稳定性。因此快速准确检测Rubisco大亚基蛋白稳定性水平是了解和评价植物叶片功能稳定性的关键技术。
    高等植物Rubisco全酶由8个分子量约55kDa的大亚基(Rubisco large subunit,rbcL)和8个分子量约14kDa的小亚基(Rubisco small subunit,rbcS) 聚合而成,分布于叶绿体基质中。其中rbcL由叶绿体基因编码的475个氨基酸残基组成,rbcS由核基因编码的123个氨基酸残基组成;不同物种间rbcL序列同源性高达80%以上,而rbcS同源性不到70%。根据结构-功能学分析,催化所必需的最重要的氨基酸残基位于rbcL上。据此,种间杂交的Rubisco动力学性质应遵循母体遗传(Evans and Austion,1986)。此外,Whitney等(2011)报道含有C4黄顶菊属rbcL和烟草rbcS的杂交Rubisco表现C4黄顶菊属高活性类型Rubisco的催化性能。这些结果说明Rubisco的催化性能很大程度上取决于rbcL的氨基酸序列。
    rbcL包括N、B和C三个结构域。N结构域开始于N端的137个氨基酸残基,含有5个β折叠。B和C结构域由α螺旋构成,C端结构域由8个平行的β折叠和8个α螺旋组成的αβ桶状结构。αβ桶的核心除了两末端的β折叠外,都是疏水残基,Rubisco活性中心呈漏斗状,由rbcLN结构域的2个环和C端结构域αβ桶状区域的8个Loop环所提供的大量电子和极性基团所组成,并有Mg2+参与,它和带有氨甲?;腖ys191和侧链Asp193及Glu194三个氨基酸发生作用(Lundqvist et al.,1991)。位于rbcL活性中心附近的氨基酸如(Lys-191,Lys-166,Lys-329)则表现出序列的保守性。
    关于Rubisco相关研究聚焦在大亚基上,涉及基因表达、蛋白表达和生化活性等方面研究,还有待深入。蛋白质印记技术(Western Blot)是一种用特异性抗体定性定量分析目的蛋白的的蛋白质检测技术,具有灵敏度高、特异性好、操作简便和结果直观等优点。目前,国内外已有制备rbcL抗体合成的报道,依据抗原来源分为三类:一是提取植物Rubisco粗酶液,经硫酸铵分级沉淀纯化后作为抗原,此种最为常见;二是采用纯化后的重组蛋白作为抗原免疫动物;三是经人工合成多肽途径制备抗原,免疫动物而获得抗体,此种鲜有报道。虽然前两种方法对抗原蛋白进行纯化,但由于存在多个潜在抗原决定簇,所制备的抗体特异性无法保证。而经多肽合成单一抗原,具有易操作、准确性高和成本低廉的优点。
    发明内容
    本发明通过对水稻Rubisco大亚基(rbcL)进行抗原表位预测并合成相应多肽作为抗原,制备了rbcL多克隆抗体,该抗体具有较高的灵敏性和特异性。具体地,本发明包括以下几方面:
    本发明的第一个目的是提供一种水稻Rubisco大亚基的抗原表位。通过分析水稻Rubisco大亚基蛋白的特性(亲水性和疏水性)及二级结构,得到多个抗原表位序列,综合考虑多肽的长度等因素,确定了一条最有效的抗原表位,其氨基酸序列为KLTYYTPEYETKDTD(如SEQ ID NO:1所示)。
    本发明的第二个目的是提供所述抗原表位的用途。该抗原表位用于制备人工合成多肽抗原以及水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。
    本发明的第三个目的提供是一种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体的制备方法:首先对所述多肽的氨基酸序列进行末端修饰,然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联,得到抗原,用抗原免疫动物后,取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。
    所述末端修饰为在氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基,修饰后的多肽的氨基酸序列为KLTYYTPEYETKDTDC(如SEQ ID NO:2所示)。
    为增强动物的免疫反应,将多肽与载体蛋白偶联,所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白(keyhole limpet hemacyanin,KLH),偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(succinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)。
    将多肽采用9-芴甲氧羰基(FMOC)?;う?氨基进行固相合成。
    本发明的第四个目的是提供一种水稻Rubisco大亚基多克隆抗体。本发明所提供的水稻Rubisco大亚基抗体,是用上述抗原免疫动物,再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到特异性好、敏感性强的多克隆抗体。免疫动物可以选择兔、小鼠、大鼠、山羊等常用的免疫动物,纯化方法为亲和层析纯化。
    本发明的第五个目的是提供所述多克隆抗体在检测水稻Rubisco大亚基中的应用。所述的多克隆抗体能应用于基于抗原抗体反应原理来检测目的蛋白的生物技术中,包括免疫印迹、免疫共沉淀和免疫组化等应用技术。
    本发明的第六个目的是提供一种检测水稻Rubisco大亚基的方法,该方法包括使用所述的多克隆抗体的步骤。
    本发明的第七个目的是提供一种检测水稻Rubisco大亚基的试剂,该试剂含有所述的多克隆抗体。
    本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好,可与水稻Rubisco大亚基发生特异性结合反应,且制备成本低,得率高,具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻叶片在不同发育时期、不同生长条件下的表达情况进行分析研究,为筛选具有高稳定性Rubisco的种质资源提供了技术支持。
    附图说明
    图1.多克隆抗体anti-rbcL纯化前后的特异性检验
    图2.本发明合成的水稻Rubisco大亚基多克隆抗体(anti–rbcL)对水稻叶片不同发育时期的免疫印迹检测结果。
    图3.本发明合成的水稻Rubisco大亚基多克隆抗体(anti–rbcL)对Rubisco大亚基降解情况的检测结果。
    具体实施方式
    下面将结合实例对本发明的技术方案进行详细描述。下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为对本发明进行限制。实施例中未注明的具体技术或者条件,均按照本领域内的文献所记载或本领域常规技术手段进行操作。
    实施例1:预测候选抗原表位和人工合成抗原
    所用水稻rbcL对应的氨基酸序列在GenBank中的ID是P0C510,全长序列如SEQ ID NO:3所示,分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等,在该蛋白的N端选出了一段氨基酸序列为KLTYYTPEYETKDTD(如SEQ ID NO:1所示,该序列位于序列表SEQ ID NO:3的21-35位)。经Blast比对水稻蛋白质数据库,确定该段多肽能唯一识别rbcL。
    为将该序列与载体蛋白偶联,在该序列的C端增加一个半胱氨酸残基,因此合成的氨基酸序列为KLTYYTPEYETKDTDC(如SEQ ID NO:2所示),由百意欣生物技术有限公司进行固相合成,并经由偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯与载体蛋白匙孔血蓝蛋白偶联,形成rbcL抗原。
    实施例2:多克隆抗体anti-rbcL的血清制备和纯化
    以上述合成抗原免疫动物,免疫动物选择年龄在3个月、体重2kg的健康新西兰大白兔,具体步骤如下:
    首先对兔子进行免疫前诱导,通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂,刺激局部免疫反应,1周后进行免疫。首次免疫前,经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原(以载体蛋白计算)用PBS缓冲液(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH7.4)稀释至1mg·mL-1。取500μL抗原稀释液加入300μL PBS缓冲液和800μL弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂(第2-4次免疫)在涡旋仪上混匀和乳化,对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射。免疫每间隔两周进行,共进行4次免疫。第4次免疫11天时进行颈动脉放血,收集血样。将血样静置于4℃过夜,在4℃条件下5000rpm离心10min,收集分装血清于-80℃保存。
    将血清进行亲和层析纯化,具体步骤如下:
    (1)亲和层析柱的制备:用适量1mM HCl充分溶胀和浸洗1g CNBr–Sepharose4B(Pharmacia)凝胶干粉后,同时将5mg的rbcL抗原溶解于适量连接缓冲液(pH8.3,0.1M NaHCO3,0.5M NaCl),两者室温下旋转混合1h。凝胶用连接缓冲液冲洗去除未结合的rbcL抗原,浸没0.1M Tris–HCl pH8.0缓冲液中装柱并静置2h以封闭凝胶上的活化基团。用5倍凝胶体积的低/高pH溶液(pH4.0,0.1M CH3COONa,0.5M NaCl;pH8.00.1M Tris–HCl,0.5M NaCl)交替洗凝胶3次,用10倍凝胶体积的TBS缓冲液(pH7.5,50mM Tris–HCl,150mM NaCl)平衡柱子。
    (2)亲和层析纯化抗多肽抗体:将20mL血清用TBS缓冲液稀释至100mL,用孔径为0.45μm的混合纤维素膜滤器(捷瑞F2502)过滤除去血细胞等杂质。将血清溶液以0.5mL·min-1的速度通过层析柱并连续上柱2次,保证抗血清与填料的结合。用TBS缓冲液清洗层析柱至洗脱液A280nm<0.008后进行洗脱。洗脱缓冲液(50mMGlycine,pH2.7)以0.5mL·min-1的速度通过层析柱洗脱目的蛋白,用离心管收集并在洗脱液中加入中和缓冲液(pH8.0,1M Tris–HCl,1.5M NaCl,1mM EDTA)调至约pH7.4防止蛋白变性。离心管中洗脱蛋白为纯化后多克隆 抗体,加入等体积的甘油,保存在-20℃。
    实施例3:多克隆抗体anti-rbcL的特异性检验
    取0.1g水稻叶片用液氮充分研磨,按照1:5(w/v)比例加入0.5mL预冷的蛋白提取缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,15mMβ-巯基乙醇,1%[w/v]PVP)静置30min。在4℃条件下15000g离心30min,上清即为Rubisco粗酶液。用Bradford法对Rubisco粗酶液中可溶蛋白进行定量后-80℃保存。
    将Rubisco粗酶液(2.5μg蛋白)和上样缓冲液等体积混合进行SDS-PAGE电泳分离。将PAGE胶经槽式转印系统快速转印(高电场强度)至硝酸纤维素膜上,转印结束后用封闭液(20mM Tris-HCl,pH7.5,500mM NaCl,5%脱脂奶粉)在37℃封闭硝酸纤维素膜1h。使用实施例2中制备的多抗anti-rbcL,用含有5%脱脂奶粉的封闭液以1:10000的比例稀释后,与封闭好的膜在37℃下孵育1h,TTBS(20mM Tris-HCl,pH7.5,500mM NaCl,0.05%[v/v]Tween-20)洗膜3次,每次10min,用含有5%脱脂奶粉的封闭液以1:5000的比例稀释AP标记的山羊抗兔二抗(北京康为世纪,CW0111),与洗好的膜在37℃下孵育1h,TTBS洗膜3次,每次10min。将膜浸泡在碱性磷酸酶缓冲液(0.1M Tris-HCl,pH9.5,0.5mM MgCl2,0.33μg·mL-1NBT,0.165μg·mL-1BCIP)中显色,直至条带清晰(约5-10min)。
    抗血清未纯化前与水稻可溶性蛋白杂交后,条带不单一,特异性较差,如图1(a)所示;而经偶联有抗原多肽的CNBR Activated Sepharose4B柱子亲和纯化后,其Western blot杂交后条带单一,特异性较高,如图1(b)所示,分子量软件预测分子量52.88kDa相近。本实验中所用纯化后抗体浓度为0.23mg·mL-1,抗体按照1:10000(w/v)比例稀释至终浓度为5×10-5mg·mL-1,所用体积大概为0.22μl,抗体效价较高。以上结果证明制备的anti-rbcL抗体可用,为后来做Rubisco蛋白表达量检测打下了基础。
    实施例4:本发明合成的水稻Rubisco大亚基多克隆抗体(anti–rbcL)对水稻叶片不同发育时期的Rubisco免疫印迹检测
    在水稻R49灌浆期,从花后第五天开始取水稻剑叶,间隔5天取一次,取4次(花后第20天),-80℃保存。按实施例3方法提取Rubisco粗酶液,其他实 验操作同实施例3。
    结果如图1所示,抗体具有很高的特异性,即只有一条主带,分子量约为50kDa,且随着灌浆期的进行,Rubisco大亚基含量有变化,所以本发明合成抗体能用于检测不同生长时期水稻叶片的rbcL。
    实施例5:本发明多克隆抗体anti–rbcL对Rubisco大亚基降解情况的检测
    按实施例3方法提取Rubisco粗酶液,将粗酶液加入等体积pH5.5的缓冲液(200mM Tris-HCl)稀释,33℃水浴4h,然后与等体积SDS-PAGE上样缓冲液混合。煮沸5min后,用于SDS-PAGE,其他实验操作同实施例3。
    尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解,根据已经公开的所有教导,可以对一些细节进行替换和修改,这些改变均在本发明的?;し段е?。


    关 键 词:
    水稻 RUBISCO 大亚基 抗原 抗体 应用
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:水稻RUBISCO大亚基抗原表位、其抗体及应用.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6143091.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03