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    重庆时时彩验证技巧: 己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410180431.0

    申请日:

    2014.04.28

    公开号:

    CN103954780A

    公开日:

    2014.07.30

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/74申请日:20140428|||公开
    IPC分类号: G01N33/74; G01N21/76; C07K16/44 主分类号: G01N33/74
    申请人: 广西壮族自治区兽医研究所
    发明人: 吴健敏; 马玲; 张启模; 韦建兴; 张怡轩; 白安斌; 陈凤莲; 覃绍敏; 林俊; 刘金凤; 饶桂波
    地址: 530001 广西壮族自治区南宁市友爱北路51号
    优先权:
    专利代理机构: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 杨立华
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410180431.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2014.08.27|||2014.07.30

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒,该法结合了免疫反应和化学发光技术,通过优化实验条件,将传统两步式化学发光酶免疫分析法简化为一步。该法应用在动物源性食品中己烯雌酚残留检测,具有快速、简便、特异、灵敏、准确、检测范围宽等特点,更加符合快速检测的要求,具有较好的应用前景。本发明试剂盒的最低检测限是0.006μg/L,IC50为0.50μg/L,回收率为72.43~113.62%,与英国Randox雌酚类酶联免疫试剂盒的阴阳性符合率为100%,适合用于己烯雌酚的痕量分析与批量检测。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法,其特征在于包括以下步骤:
    <1>处理待测样品;
    <2>将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白的偶联物DES-OVA作为抗原包被于发光固相载体,封闭后,依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚单克隆抗体DES-McAb进行反应,然后再加入化学发光液,测定系列标准样品和待测样品的发光值;
    <3>以步骤<2>测得的发光值计算抑制率,绘制标准曲线,并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中己烯雌酚的含量。

    2.  根据权利要求1所述的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法,其特征在于:
    步骤<1>按以下操作进行:取5g组织样品加入10mL叔丁基甲基醚,剧烈震荡5min后,超声提取10min,3000g/min离心10min,移出上清液后,用10mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物,将两次的上清液合并,吹干,用1mL甲醇溶液溶解,再用3mL石油醚洗涤甲醇溶液;蒸发甲醇,用1mL二氯甲烷溶解后,再用3mL1N NaOH溶液提取,最后,用300μL磷酸中和提取液,用于检测;
    步骤<2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成0.5μg/mL,每孔加入100μL,4℃孵育过夜,倾去包被液,用洗板机洗涤化学发光板3次,拍干;然后,每孔加入350μL封闭液,37℃孵育2h,倾去封闭液,用洗板机洗涤3次,拍干;37℃烘干后,用锡箔纸真空密封,4℃保存;将化学发光板从4℃中取出,待温度平衡至室温,按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板,各设3孔重复,然后依次加入各50μL酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb,混匀,37℃孵育45min;倾去液体,用洗板机洗涤5次,拍干;每孔中加入100μL化学发光液,混匀,尽快测定各孔发光值。

    3.  根据权利要求2所述的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法,其特征在于:所述封闭液是5%的脱脂奶粉;所述DES-McAb稀释为0.2μg/mL;所述系列标准样品溶液的浓度为0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L;所述包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。

    4.  一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒,其特征在于包括包被有DES-OVA的化学发光板、DES系列标准样品溶液、DES-McAb工作液、浓缩洗涤液、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液;所述包被抗原DES-OVA为DES与载体蛋白卵清蛋白的偶联物;所述DES系列标准样品溶液为7个浓度梯度,分别是0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L;所述浓缩洗涤液由NaCl8.00g、KH2PO4 0.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL,加水定容至100mL制成;所述化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018—BeyoECL Plus。

    5.  权利要求4所述试剂盒在动物源性食品中己烯雌酚残留检测中的应用。

    6.  一种己烯雌酚单克隆抗体,其特征在于按以下操作制备:以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物DES-BSA作为免疫原,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选,对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次,经过鉴定、冻存和建株后,进行腹水的制备,然后通过纯化腹水,获得能特异性识别己烯雌酚的单克隆抗体。

    7.  根据权利要求6所述的己烯雌酚单克隆抗体,其特征在于按以下操作制备::
    <1>动物免疫
    将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后,对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫;
    <2>细胞融合和克隆筛选
    冲击免疫3天后,摘除小鼠眼球放血后处死,收集血液、无菌取脾脏,融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞,融合后的细胞悬液加至已铺有饲养细胞的96孔板中,采用HAT选择培养基筛选融合细胞;
    待细胞生长至培养孔面积1/10时,无菌准确吸取100μL上清,加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内;以间接ELISA法测细胞培养上清效价,采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次,直至阳性率为100%时,对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株,对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上,每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力;
    <3>细胞冻存与复苏
    用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液,分装于冻存管,置于液氮中保存;复苏时取出冻存管,立即放入37℃水浴中速融,离心去除冻存液,移入细胞瓶中培养;
    <4>腹水的制备与纯化
    采用体内诱生法,将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔,7-14天后注入杂交瘤细胞,7-10天后收集腹水;收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后,再用亲和层析法进一步纯化,即得DES-McAb。

    说明书

    说明书己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒
    技术领域
    本发明属于己烯雌酚检测分析领域,尤其涉及一种己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
    背景技术
    己烯雌酚(Diethylstilbesrtol,DES)是一种人工合成的雌激素,在促进子宫、输卵管、乳腺的生长发育和蛋白质合成、减少脂肪、提高日增重等方面效果显著,因而曾作为促生长剂用于畜禽、水产生产中。然而,许多科学研究表明DES能通过改变内分泌系统引发人和动物的癌症,还可以经胎盘致癌,即妊娠期使用,可导致胎儿生殖器官的畸变,甚至癌变。另外,DES很难降解,如排出体外,会严重污染水源和土壤,并通过食物链威胁人类健康和生态环境,形成恶性循环。因此,我国在1999年制定《中国人民共和国动物及动物源食品残留监测计划》中规定在动物源性食品卫生中不得检出DES,2002年又将其列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农业部公告193号)。然而,由于巨大利益的驱使,违法添加DES的情况仍屡禁不绝,严重威胁着人类健康。
    目前,文献报道的DES检测方法主要有色谱法(气相色谱、气相色谱-质谱联用、高效液相色谱等)、免疫法(放射免疫法、酶联免疫吸附法、化学发光酶免疫分析法)以及荧光分光光度计法、辐照分光光度法、生物分析法等。由于DES在体内代谢快,组织浓度较低,所以其检测方法应更灵敏、准确?;Х⒐饷该庖叻治龇?Chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)以其灵敏度高、特异性好、操作简便、无辐射、标记物有效期长等优点,越来越多地用于临床样品的高通量筛选,是一项十分有发展前景的分析监测技术,近年来已被应用于多种药物残留的检测。目前我国DES检测试剂盒主要是ELISA检测试剂盒,而且几乎完全进口,如英国RANDOX、德国r-Biopharm等,因此,建立检测DES的化学发光酶免疫分析法及其试剂盒有较好的实际意义。
    中国专利“一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒”(专利号201010244284.0公开日2011年1月5日)采用两步式化学发光酶联免疫检测体系,操作步骤繁多且复杂。
    发明内容
    本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确、检测范围宽的己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。
    本发明要解决的另一技术问题是提供一种特异性高、亲和力强的己烯雌酚单克隆抗体。
    为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
    己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法,包括以下步骤:
    <1>处理待测样品;
    <2>将半抗原己烯雌酚与载体蛋白卵清蛋白的偶联物(DES-OVA)作为抗原包被于发光固相载体,封闭后,依次加入系列标准样品或经前处理的待测样品、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG和己烯雌酚单克隆抗体(DES-McAb)进行反应,然后再加入化学发光液,测定系列标准样品和待测样品的发光值;
    <3>以步骤<2>测得的发光值计算抑制率,绘制标准曲线,并根据标准曲线的回归方程和待测样品的抑制率计算待测样品中己烯雌酚的含量。
    步骤<1>按以下操作进行:取5g组织样品加入10mL叔丁基甲基醚,剧烈震荡5min后,超声提取10min,3000g/min离心10min,移出上清液后,用10mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物,将两次的上清液合并,吹干,用1mL甲醇溶液溶解,再用3mL石油醚洗涤甲醇溶液;蒸发甲醇,用1mL二氯甲烷溶解后,再用3mL1N NaOH溶液提取,最后,用300μL磷酸中和提取液,用于检测;
    步骤<2>按以下操作进行:用包被液将抗原稀释成0.5μg/mL,每孔加入100μL,4℃孵育过夜,倾去包被液,用洗板机洗涤化学发光板3次,拍干;然后,每孔加入350μL封闭液,37℃孵育2h,倾去封闭液,用洗板机洗涤3次,拍干;37℃烘干后,用锡箔纸真空密封,4℃保存;将化学发光板从4℃中取出,待温度平衡至室温,按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板,各设3孔重复,然后依次加入各50μL酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、DES-McAb,混匀,37℃孵育45min;倾去液体,用洗板机洗涤5次,拍干;每孔中加入100μL化学发光液,混匀,尽快测定各孔发光值。
    封闭液是5%的脱脂奶粉;DES-McAb稀释为0.2μg/mL;系列标准样品溶液的浓度为0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L;包被液是pH9.6的碳酸盐缓冲液。
    己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒,包括包被有DES-OVA的化学发光板、DES系列标准样品溶液、DES-McAb工作液、浓缩洗涤液、酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG工作液、化学发光液;包被抗原(DES-OVA)为DES与载体蛋白卵清蛋白的偶联物;DES系列标准样品溶液为7个浓度梯度,分别是0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、 10μg/L、100μg/L;浓缩洗涤液由NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL,加水定容至100mL制成;化学发光液来自超敏ECL化学发光试剂盒P0018—BeyoECL Plus。
    上述试剂盒在动物源性食品中己烯雌酚残留检测中的应用。
    己烯雌酚单克隆抗体,按以下操作制备:以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(DES-BSA)作为免疫原,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,按照常规方法进行细胞融合和阳性株的筛选,对筛选出的阳性细胞株连续克隆3次,经过鉴定、冻存和建株后,进行腹水的制备,然后通过纯化腹水,获得能特异性识别己烯雌酚的单克隆抗体。
    上述己烯雌酚单克隆抗体,按以下操作制备::
    <1>动物免疫
    将健康的6周龄雌性BALB/c小鼠通过基础免疫和5次加强免疫后,对效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫;
    <2>细胞融合和克隆筛选
    冲击免疫3天后,摘除小鼠眼球放血后处死,收集血液、无菌取脾脏,融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞,融合后的细胞悬液加至已铺有饲养细胞的96孔板中,采用HAT选择培养基筛选融合细胞;
    待细胞生长至培养孔面积1/10时,无菌准确吸取100μL上清,加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内;以间接ELISA法测细胞培养上清效价,采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次,直至阳性率为100%时,对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株,对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上,每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力;
    <3>细胞冻存与复苏
    用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液,分装于冻存管,置于液氮中保存;复苏时取出冻存管,立即放入37℃水浴中速融,离心去除冻存液,移入细胞瓶中培养;
    <4>腹水的制备与纯化
    采用体内诱生法,将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔,7-14天后注入杂交瘤细胞,7-10天后收集腹水;收集的腹水用饱和硫酸铵法进行初纯后,再用亲和层析法进一步纯化,即得DES-McAb。
    本发明首次探讨了检测己烯雌酚残留的一步式化学发光酶免疫机理,发明人结合了免疫反应和化学发光技术,在不需要另外制备酶标单克隆抗体的情况下,将传统两步式化学 发光酶免疫分析法简化为一步,成功建立了一步式己烯雌酚化学发光酶免疫分析检测法及试剂盒。本发明“一步法”的线性检测范围(0.001~100μg/L)宽,最低检测限(0.006μg/L)低,试剂盒的IC50为0.50μg/L,回收率为72.43~113.62%,与英国Randox雌酚类酶联免疫试剂盒(产品编号:SJ2152)的阴阳性符合率为100%,适合用于己烯雌酚的痕量分析与批量检测,特别适合应用于检测动物源性食品中己烯雌酚的残留。
    附图说明
    图1为实施例2己烯雌酚残留一步式化学发光酶免疫分析检测法的标准曲线。
    图中:X轴为己烯雌酚梯度浓度标准样品浓度的对数值;Y轴为各浓度己烯雌酚标准样品的发光值除以“0”浓度孔发光值(RLU/RUL0%)。
    具体实施方式
    实施例1己烯雌酚单克隆抗体(DES-McAb)的制备
    1.1动物免疫
    以己烯雌酚与载体蛋白牛血清白蛋白的偶联物(DES-BSA)作为免疫原,对健康的6周龄雌性BALB/c小鼠McAb进行基础免疫和5次加强免疫后,测定血清效价和IC50,选取效价最高、竞争性最强的小鼠进行冲击免疫;
    1.2细胞融合和克隆筛选
    冲击免疫3天后,摘除小鼠眼球放血后处死,收集血液、无菌取脾脏,融合小鼠免疫脾细胞与Sp2/0细胞,融合后的细胞悬液加至已事先铺有饲养细胞的96孔板中,采用HAT选择培养基筛选融合细胞;
    待细胞生长至培养孔面积1/10时,无菌准确吸取100μL上清,加至已包被抗原DES-OVA的酶标板内;以间接ELISA法测细胞培养上清效价,采用有限稀释法对阳性细胞连续克隆3次,直至阳性率为100%时,对细胞株进行扩大培养、鉴定、冻存和建株,命名为3E8,对鉴定后细胞株进行连续培养传代2个月以上,每隔5代检测其稳定性和抗体分泌能力;
    1.3细胞冻存与复苏
    用冻存液将处于对数生长期的杂交瘤细胞制成细胞悬液,分装于冻存管,置于液氮中保存;复苏时取出冻存管,立即放入37℃水浴中速融,离心去除冻存液,移入细胞瓶中培养;
    1.4腹水的制备与纯化
    采用体内诱生法,将灭菌石蜡油注入8周龄Balb/c小鼠腹腔,7-14天后注入杂交瘤 细胞,7-10天后收集腹水;收集的腹水分别用饱和硫酸铵法和亲和层析法进行纯化,即得DES-McAb。
    1.5单克隆抗体的鉴定
    1.5.1杂交瘤细胞培养上清及纯化后抗体效价的测定
    采用间接ELISA方法,测定杂交瘤细胞培养上清中DES-McAb的效价为1:512,亲和层析纯化后的腹水效价达到1:1×105,蛋白含量为10mg/mL。
    1.5.2亲和力的测定
    通过非竞争ELISA,分别以OD450值为纵坐标,以DES-MAb的浓度为横坐标,绘制亲和曲线,以公式1计算不同抗原包被浓度下的亲和常数,取平均值得出DES-McAb的亲和常数(Ka)为1.2×109L/mol。
    Ka=n-12(n[Ab']-[Ab]t)]]>(公式1)
    1.5.3亚类的鉴定
    采用免疫球蛋白亚类检测试剂盒(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA,洛阳佰奥通实验材料中心产品,货号:C060101)测定DES-McAb3E8为IgG2b。
    实施例2己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测法的建立
    2.1相关试剂的配制
    碳酸盐缓冲液(pH9.6,即包被液):准确称取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g,超纯水溶解后,调节pH至9.6,定容至1000mL。
    洗涤液(pH7.4):准确称取NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g,超纯水溶解后,调节pH至7.4,加入吐温-200.50mL,定容至1000mL。
    磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4):准确称取NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g,超纯水溶解后,调节pH至7.4,定容至1000mL。
    封闭液:准确称取脱脂奶粉1.0g,加入20mL磷酸盐缓冲液,搅拌均匀至完全溶解。
    BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒,P0018,100mL):购自碧云天生物技术研究所。
    2.2DES-CLEIA反应条件的确定
    采用间接竞争化学发光酶免疫分析法,对DES-OVA稀释度(1:2000、1:5000、1:10000、和1:20000)、包被条件(37℃10h、24℃10h、4℃10h和37℃3h、24℃3h和4℃3h)、封闭液(20mM的PBS、5%的脱脂奶粉、1%的BSA、5%的胎牛血清)、封闭 条件(37℃1h、37℃2h和4℃过夜)、DES-McAb稀释度(1:10000、1:15000、1:20000和1:25000)和HRP-羊抗鼠IgG稀释度(1:1000、1:1500和1:2000)以及竞争反应时间进行筛选,确定最佳反应条件。
    结果确定如下反应条件:以50mM pH9.6碳酸盐缓冲液溶解0.5μg/mL DES-OVA于4℃包被检测板过夜,洗涤3次后,用5%脱脂奶封闭,然后依次加入梯度稀释的DES系列标准溶液、1:1500稀释的HRP-羊抗鼠IgG和0.2μg/mL DES-McAb,各50μL/孔,每个浓度DES标准溶液3次重复,反应45min,洗涤后,加入发光底物液后,置于化学发光检测仪,尽快读数。以各标准品发光强度(Relative Light Unit,RLU)为纵坐标,标准品浓度的对数为横坐标,绘制标准曲线。
    2.3标准曲线的建立、IC50和最低检测限
    在最佳条件下,将DES配成0.001~100μg/L系列浓度,每个浓度3孔重复,进行检测。以标准样品溶液浓度的对数值为横坐标,以各浓度DES标准品的发光值除以“0”浓度孔发光值(RLU/RLU0%)为纵坐标,绘制标准曲线。如图1所示,标准曲线的回归方程为y=-20.027x+43.070,R2=0.9919,曲线在0.001~100μg/L之间呈现良好的线性关系,最低检测限是0.006μg/L,IC50为0.50μg/L。
    2.7本发明的特异性
    以本发明的反应体系测定DES结构类似物(炔雌醇、雌酚酮、苯甲酸雌二醇、雌三醇)按照公式2,计算各药物的交叉反应率。由表1可见,本发明所建立的方法与受测物的交叉反应率均小于0.01%,表明本法特异性较好。
    交叉反应率=IC50(DES)/IC50(其他药物)×1O0%  (公式2)
    表1本发明特异性测定结果

    2.8本发明的准确度
    以低、中、高三个浓度(0.025μg/L、1μg/L、100μg/L)进行回收率实验,每个样品设定3孔重复,测定其化学发光值,将得到的平均值代入标准曲线的回归方程,求 出相应标准样品浓度值,计算回收率。由表2结果确定本发明的回收率在72.43~113.62%之间,同时变异系数均小于15%,表明本法具有可靠的准确度。
    表2本发明准确度的测定结果

    2.9与两步式化学发光酶免疫分析法的比较
    在最优反应条件下分别以本发明一步式与常规两步式方法进行反应,计算得到各自的IC50值及R2值,由表3可见,二者指标相近,在一步法中,将标准品抗原或待测样品、DES-McAb和酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG同时加入到包被有DES-OVA的酶标板中,与两步式方法相比,一步法减少了操作步骤,缩短了实验时间约1.5h,更符合快速检测的要求。
    表3一步式与两步式化学发光酶免疫分析法的比较结果

    实施例3己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒的研制
    根据实施例1和2的研究结果,组装己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒。3.1试剂盒组成
    A包被有包被抗原(DES-OVA)的化学发光板;
    B DES系列标准样品溶液:0μg/L、0.001μg/L、0.01μg/L、0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L;
    C DES单克隆抗体3E8工作液;
    D HRP-山羊抗小鼠IgG工作液;
    E浓缩洗涤液:NaCl8.00g、KH2PO40.20g、Na2HPO4·12H2O2.90g、KCl0.20g、吐温-200.50mL,加水定容至100mL;
    F化学发光液A液、B液(超敏ECL化学发光试剂盒P0018--BeyoECL Plus);
    3.2化学发光板的包被
    用包被液将抗原稀释成0.5μg/mL,每孔加入100μL,4℃孵育过夜,倾去包被液,用洗板机洗涤化学发光板3次,拍干;然后每孔加入350μL封闭液,37℃孵育2h,倾去封闭液,用洗板机洗涤3次,拍干;37℃烘干后,用锡箔纸真空密封,4℃保存。
    实施例4己烯雌酚一步式化学发光酶免疫分析检测试剂盒的应用
    4.1试剂的配制
    A洗涤液:将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用超纯水稀释10倍后使用。
    B化学发光液:在添加化学发光液前,将化学发光液A液、B液按照1:1混合均匀。
    4.2组织样品的前处理
    A取5g组织样品于50mL离心管内;
    B加入10mL叔丁基甲基醚,剧烈震荡5min后,超声提取10min,3000g/min离心10min;
    C移出上清液后,用10mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物,将两次的上清液合并,吹干;
    D用1mL甲醇溶液溶解,再用3mL石油醚洗涤甲醇溶液;
    E蒸发甲醇,用1mL二氯甲烷溶解后,再用3mL1N NaOH溶液提取后;
    F用300μL磷酸中和提取液,用于检测。
    4.3检测过程
    A将化学发光板从4℃中取出,待温度平衡至室温;
    B按照每孔50μL将系列标准样品溶液和待测样品加入化学发光板,各设3孔重复,然后每孔依次加入50μL酶标二抗HRP-山羊抗小鼠IgG、50μLDES-McAb,混匀,37℃孵育45min;
    C倾去液体,用洗板机洗涤5次,拍干;
    D每孔中加入100μL化学发光液,混匀,尽快测定各孔发光值;
    E按照公式,根据所获得样品发光值,计算样品的抑制率,并将抑制率代入标准回归方程,计算出残留量;如样品曾稀释,则乘以稀释倍数,即为样品中DES的残留量。

    4.4样品的检测
    采集市售的虾、鱼样品共206份,参考上述方法进行样品的前处理,然后用本发明的 试剂盒进行检测。检出含量超过2μg/μL的1份,超过0.1μg/μL的2份,其余未检出。实施例5本发明的化学发光酶免疫试剂盒与标准检测方法的比较
    随机选取40份水产样品,同时采用本发明一步式DES-CLEIA和英国Randox雌酚类酶联免疫检测试剂盒进行检测(DES-ELISA)(产品编号:SJ2152)进行检测,判定检测值≥0.6μg/L的样品为阳性样品,并通过SPSS18.0统计学软件比对检测结果,如表4、5所示,两种方法均检出2份阳性样品,比对结果为t=-0.423,P=0.675>0.05,差异不显著上述结果均表明一步式DES-CLEIA与DES-ELISA检测结果之间差异不显著,两种方法阴阳性符合率为100%。
    表4DES检测方法的符合率

    表5DES检测结果统计分析

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