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    重庆时时彩开奖视频直播时时彩网: 白介素6检测试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410176133.4

    申请日:

    2014.04.29

    公开号:

    CN103969438A

    公开日:

    2014.08.06

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20140429|||公开
    IPC分类号: G01N33/577; C07K16/24; C12N5/20; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: G01N33/577
    申请人: 北京普恩光德生物科技开发有限公司
    发明人: 于晖; 李雨心; 王旭; 陈勤慧; 李鑫; 刘琦; 李丽萍
    地址: 101318 北京市顺义区后沙峪镇裕民大街甲1号4幢
    优先权:
    专利代理机构: 北京戈程知识产权代理有限公司 11314 代理人: 程伟
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410176133.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.03.30|||2014.09.03|||2014.08.06

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种白介素6检测试剂盒。试剂盒包含两株特异性白介素6单克隆抗体。多孔板上包被的单克隆抗体与生物素标记的单克隆抗体以及被测样本的白介素6形成“包被抗体-抗原-生物素标记抗体”的夹心复合物结构??固迳纤昙堑纳锼赜際RP标记的链霉亲和素结合,HRP进而与底物反应产生信号,用以进行白介素6定量分析。通过本发明的试剂盒,使得能够迅速、灵敏地定量检测样本中的白介素6含量。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒,其包含:
    包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、
    试剂1、
    试剂2、
    试剂3、
    样本稀释液、和
    底物液;
    其中:
    试剂1包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、生物素标记的第二白介素6单克隆抗体、和防腐剂;
    试剂2包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、和防腐剂;
    试剂3包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂;
    样本稀释液包含:磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、山羊血清、吐温20和防腐剂;
    底物液包含:辣根过氧化物酶底物;
    当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生;或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生;
    样本来自哺乳动物,优选人类,样本选自全血、血浆和血清。

    2.  根据权利要求1所述的检测样本中白介素6的ELISA试剂盒,还包括:
    校准品,校准品包含已知浓度的白介素6,白介素6浓度在0-1500pg/ml范围内。

    3.  根据权利要求1所述的检测样本中白介素6的ELISA试剂盒,还包括质控品,质控品包含已知浓度的白介素6,白介素6浓度在200-1000pg/ml范围内。

    4.  一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒,其包含:
    包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、
    试剂1、
    试剂2、
    试剂3、
    样本稀释液、和
    底物液;
    其中:
    试剂1包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素标记的第二白介素6单克隆抗体;
    试剂2包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、和0.5ml/L Proclin-300;
    试剂3包含:5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12mg/L辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素;
    样本稀释液包含:58g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钠、180g/L氯化钠、250ml/L山羊血清、10ml/L吐温20和5ml/L防腐剂;
    底物液由底物液A和底物液B组成,底物液A含有过氧化脲和柠檬酸缓冲液,底物液B含有四甲基联苯胺和柠檬酸缓冲液;
    当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生;或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生。

    5.  一种白介素6单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.8796的 杂交瘤细胞所产生。

    6.  一种白介素6单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生。

    7.  如下两株白介素6单克隆抗体的组合在制备ELISA诊断试剂中的用途:
    由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生的白介素6单克隆抗体、以及由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生的白介素6单克隆抗体。

    8.  一种杂交瘤细胞,其选自保藏号为CGMCC No.8796、和CGMCC No.8797的杂交瘤细胞。

    说明书

    说明书白介素6检测试剂盒
    技术领域
    本发明属于分子免疫学领域,具体涉及一种检测白介素6(IL-6)蛋白含量的试剂盒。
    背景技术
    机体在受到不同类型的创伤和刺激后会出现一个类似炎症反应的状态,即全身炎症反应综合征(SIRS)。在这一过程中损伤因素刺激机体炎性细胞释放炎症介质。通常情况下,作为防御机制有益于机体创伤后的恢复,并会随着创伤的痊愈而自行消退。然而,如果由于感染、再次损伤等原因使这种炎症反应过度或者反应时间过长,机体合成释放过多的炎症介质,就会引起失控和逐级放大的连锁反应?;褰胍恢植涣嫉娜碜刺?,表现出中重度SIRS,随着病情进一步恶化,严重多发伤继发多器官功能不全综合征(MODS)就会序贯发生。因此,创伤、SIRS、MODS在发展上是一个渐进的过程,炎症反应的强度与患者创伤的发展和转归密切相关。
    IL-6是降钙素的前体,生理情况下由甲状腺C细胞合成与分泌。正常情况下,体内不能检测到IL-6的存在,在危重病患者的外周血、肺及肝组织中可被检测到,且被认为对全身性感染具有较好的诊断价值和预警作用。
    IL-6由T淋巴细胞、B淋巴细胞及内皮细胞产生,它能刺激T细胞、B细胞的增殖,并能促进细胞毒性T细胞分化,提高自然杀伤细胞的活力。创伤后不良者早期血液中即可检测到IL-6的异常升高。在SIRS过程中,促炎细胞因子首先被激活,而后促使机体释放IL-6,后者又正反馈于单核巨噬细胞系统和多形核粒细胞,进一步产生更多的各种炎症介质。因此,IL-6在炎症反应中起核心调节作用,是炎症免疫反应的重要介质。
    发明内容
    根据一些实施方式,提供了一种检测样本中白介素6的ELISA试剂盒,其包含:
    包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板、
    试剂1、
    试剂2、
    试剂3、
    样本稀释液、和
    底物液。
    在一些实施方案中,包被有第一白介素6单克隆抗体的多孔板中第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796或8797的杂交瘤细胞所产生。
    在一些实施方案中,试剂1也作生物素标记的白介素6单克隆抗体工作液。其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠,小牛血清、生物素标记的第二白介素6单克隆抗体和防腐剂。在一些实施方案中,第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797或8796的杂交瘤细胞所产生。第二白介素6单克隆抗体能特异性识别并结合样本中的IL-6,抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合,HRP进而与底物反应产生信号。产生的信号换算成浓度,用于定量分析。在一些实施方案中,试剂1包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、和12.5mg/L生物素标记的第二白介素6单克隆抗体。当第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生;或者当第二白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生时,第一白介素6单克隆抗体由保藏号为CGMCCNo.8797的杂交瘤细胞所产生。
    在一些实施方案中,试剂2用作生物素标记抗体的稀释液、或用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素的稀释液。在一些实施方案中,试剂2包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠,小牛血清、和防腐剂。在具体实施方案中,1000ml的试剂2中包含5.8g磷酸氢二钠、0.593g 磷酸二氢钠、8.0g氯化钠、200ml小牛血清和0.5ml Proclin-300。
    在一些实施方案中,试剂3用作辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液。在一些实施方案中,试剂3包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、和防腐剂。
    在一些实施方案中,样本稀释液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、山羊血清、吐温20和防腐剂。在具体实施方案中,1000ml样本稀释液是10×的,其包括58g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钠、180g/L氯化钠、250ml/L山羊血清、10ml/L吐温20和5ml/L防腐剂。样本稀释液可以配制成浓缩型,也可以不是。技术人员可以理解,其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
    在一些实施方案中,底物液包含:辣根过氧化物酶底物。在具体实施方案中,底物液包含底物液A和底物液B。底物液A是含有过氧化脲的柠檬酸缓冲液。底物液B是含有TMB的柠檬酸缓冲液。
    应当理解,本发明的各试剂可以配制成浓缩型,也可以不是。在一些实施方案中,一些试剂配制成浓缩型,这可以减少运输、储存体积。技术人员可以理解,除了具体实例以外的其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。
    在一些实施方案中,样本来自哺乳动物,优选来自人类。样本选自全血、血浆、和血清。在具体实施方案中,样本为人血清。
    在一些实施方案中,本发明的试剂盒还可以根据需要包括校准品。校准品用于标准曲线的绘制。校准品包含已知浓度的白介素6,白介素6浓度在0-1500pg/ml范围内。在具体实施方案中,校准品中白介素6浓度分别为0、10、25、250、750、1500pg/ml。
    在一些实施方案中,本发明的试剂盒还可以根据需要包括质控品。质控品包含已知浓度的白介素6,白介素6浓度在200-1000pg/ml范围内。在具体实施方案中,质控品中白介素6浓度分别为700pg/ml–900pg/ml;200pg/ml–400pg/ml。
    在一些实施方案中,校准品或质控品是已知IL-6浓度的血清;血清可以是任何市售血清、或收集自临床机构的人血清;其经灭活处理,并且抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均为阴性。在一些实施方案中,还可以使用阴性血清稀释IL-6纯品来制备校准品或质控品。
    根据一些实施方案,提供了一种白介素6单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞所产生。
    根据另一些实施方案,提供了一种白介素6单克隆抗体,其由保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞所产生。
    根据一些实施方案,提供了本发明的白介素6单克隆抗体在制备ELISA诊断试剂中的用途。在一个具体实施方案中,保藏号为CGMCCNo.8796和8797的杂交瘤细胞所产生2株白介素6单克隆抗体共同用于制备ELISA诊断试剂。
    根据一些实施方案,提供了保藏号为CGMCC No.8796的杂交瘤细胞。
    根据另一些实施方案,提供了保藏号为CGMCC No.8797的杂交瘤细胞。
    具体实施方式
    为了使本发明易于理解,下面结合具体实施例进一步阐述本发明。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是,应当理解的是,这些仅仅是示例性的,并不意图限制本发明,与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
    实施例1.IL-6重组蛋白的制备
    从NCBI数据库中获得IL-6编码序列,构建原核表达载体pET32-IL6,诱导表达IL-6重组抗原,经Western印迹分析蛋白有免疫反应,镍亲和层析柱纯化大量制备IL-6重组蛋白,该蛋白可以用于抗体的制备。
    1.pET28-IL-6表达载体构建
    IL-6基因购买于武汉三鹰生物技术有限公司,参照IL-6cDNA序列设计引物:
    IL-6-F:cgggatccccagtacccccaggag(SEQ ID No.1)和
    IL-6-R:ccgctcgagctacatttgccgaag(SEQ ID No.2)。
    PCR扩增IL-6基因,PCR体系:

    PCR程序:
    94℃10min 1个循环
    94℃30s,55℃30s,72℃30s 30个循环
    72℃10min 1个循环
    PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后与T载体连接,16℃连接1h获得IL-6-T,转化大肠杆菌DH5α。IL-6-T载体经酶切鉴定后,送公司测序。
    测序正确的IL-6-T载体与pET32a表达载体经BanmH I和Xho I酶切3h后,

    使用T4DNA连接酶16℃连接过夜,转化大肠杆菌DH5α;

    将连接产物加到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中,冰浴20min,在42℃水浴中热击90s,然后迅速置于冰上2-3min,加入900μl新鲜的LB培养基混匀后,37℃摇床培养1h,使DH5α恢复正常生长状态。将转化细胞溶液涂布含有氨苄青霉素的LB培养基;37℃恒温培养过夜。经酶切鉴定。将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21。
    序列经测序鉴定如下:
    ccagtacccccaggagaagattccaaagatgtagccgccccacacagacagccactcacctcttcagaacgaattgacaaacaaattcggtacatcctcgacggcatctcagccctgagaaaggagacatgtaacaagagtaacatgtgtgaaagcagcaaagaggcactggcagaaaacaacctgaaccttccaaagatggctgaaaaagatggatgcttccaatctggattcaatgaggagacttgcctggtgaaaatcatcactggtcttttggagtttgaggtatacctagagtacctccagaacagatttgagagtagtgaggaacaagccagagctgtgcagatgagtacaaaagtcctgatccagttcctgcagaaaaaggcaaagaatctagatgcaataaccacccctgacccaaccacaaatgccagcctgctgacgaagctgcaggcacagaaccagtggctgcaggacatgacaactcatctcattctgcgcagctttaaggagttcctgcagtccagcctgagggctcttcggcaaatgtag(SEQ ID No.3)。
    2.IL-6蛋白诱导表达
    构建好的原核表达质粒pET32-IL6转化BL21感受态细胞,挑取单克隆菌落于5ml的LB液体培养基(含氨苄青霉素)中220rpm/min,37℃培养过夜培养。过夜培养菌按1:100转接到新鲜的LB液体培养基中,220rpm/min,37℃培养,待菌液浓度OD600=0.6时加入IPTG开始诱导(终浓度为0.25mM);30℃220rpm/min诱导4h收菌;超声破碎菌体,超声条件:每处理3sec间隔7sec,超声5min,输出功率50%。9500rpm,4℃离心20min,分离上清和沉淀。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。结果显示,IL-6蛋白大部分为可溶性表达。
    3.IL-6蛋白纯化
    诱导表达100ml菌液,9500rpm,4℃离心2min,收集菌体。加入预冷的上样缓冲液20ml(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,10mM咪唑,10mM Tris碱,pH8.0),重悬菌体,超声破碎菌体:每处理3sec间隔7sec,超声20min,输出功率50%。9500rpm,4℃离心20min,分离上清和沉淀。
    上样前,要将上清过0.22μm的滤膜。灌制好Ni2+-NTA亲和层析柱,用去离子水进行缓慢洗脱,避免在柱床中引入气泡;用10倍柱体积的上样缓冲液进行预平衡,上样,收集流出液;用20倍柱床体积的冲洗缓冲液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,50mM咪唑,10mM Tris碱,pH8.0)进行漂洗,收集滤过液。用5倍柱床体积的洗脱缓冲液(300mM NaCl,50mM NaH2PO4,200mM咪唑,10mM Tris碱,pH8.0)进行洗脱,收集目的蛋白。经BCA蛋白定量试剂盒定量,最终得到3mg,SDS-PAGE电泳分析,蛋白纯度大于95%。
    4.Western印迹法鉴定蛋白的免疫反应
    纯化后的IL-6抗原,经SDS-PAGE电泳,取出胶板,将胶浸于转移缓冲液中平衡10min;依据胶的大小剪取膜和滤纸4片,放入转移缓冲液中平衡10min。将PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。装配转移三明治:由下到上分别铺:2层滤纸-膜-胶-2层滤纸,每层放好后,用试管赶去气泡。转移,电压设置:24V,转移时间:30min。置膜于15ml封闭缓冲液(1g/100ml BSA)中4℃,过夜。TBS/T洗3次(5min/T)。加入Abcam的抗IL-6单克隆抗体,室温孵育2h。TBS/T洗3次(5min/T)。加入1ml辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠的二抗,室温孵育2h。TBS/T洗3次(5min/T)。15ml TBS洗2次。加入0.5ml化学发光法液,置于凝胶成像系统中显色。结果显示:抗IL-6单克隆抗体可以和IL-6结合反应。
    实施例2.单克隆抗体的制备与鉴定
    1.免疫Balb/c小鼠
    选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c小鼠,初次免疫,分别取上述IL-620-50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射,第14和28天分别进行第二次和第三次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂腹腔内注射,融合前3天加强免疫,剂量20-50μg为宜,3天后,取脾融合。
    2.细胞融合的步骤
    制备饲养细胞层:取一只未免疫的Balb/c小鼠,6周,拉颈处死,浸泡在75%酒精内,5min,用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,用无菌注射器注入6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管),反复冲洗,吸出冲洗液,冲洗液放入10ml离心管,1200rpm/分离6min,用20%(v/v)胎牛血清(FCS)的培养液混悬,调整细胞数至1×105/ml,加入96孔板,100μl/孔,放入37℃CO2孵箱培养。
    制备免疫脾细胞:取免疫好的Balb/c小鼠,拉颈处死,无菌取脾脏,用10ml不完全培养液洗一次,脾脏研碎,过200目细胞筛,将脾细胞转移至10ml离心管中,800rpm离心10min,细胞用10ml培养液洗2次,细胞计数,取1×108脾淋巴细胞悬液备用。
    制备骨髓瘤细胞SP2/0:取对数生长骨髓瘤细胞离心,用无血清培养液洗2次,计数,取得5×107细胞备用。
    细胞融合:将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合在一起,在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次,离心,1200rpm,8min;弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略松动。
    加入37℃预温的1ml45g/100ml PEG(分子量4000)溶液,边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心,800rpm,6min。充上清,用含20%(v/v)小牛血清HAT选择培养液重悬。将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μl。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
    3.杂交瘤细胞的筛选
    脾细胞和骨髓瘤细胞融合后5天,形成多种细胞的混合体,补加HAT培养基100μl,第10天换HT培养基培养。杂交瘤细胞布满孔底1/5面积时,即可采用间接ELISA法检测培养上清,筛选阳性克隆。以实施例1制备IL-6重组抗原包被酶标板(5μg/ml)100μl/孔,4℃过夜,将酶标板孔中的液体倒尽,加入PBST,重复洗涤三次;加入封闭液200μl/孔进行封闭,置于37℃,1小时。洗涤封闭液,加入100μl细胞培养上清,阳性对照选小鼠的免疫血清,阴性对照选SP2/0培养上清,空白为洗涤液,于37℃静置2h。加入HRP标记羊抗鼠二抗(1:5000)100μl/孔,于37℃静置60min。加入PBST,重复洗涤三次;加入底物反应液100μl/孔,37℃置暗处反应10分钟。加入H2SO4(2mol/L)50μl/孔,终止反应。酶标仪检测450nm吸光度值。结果成功得到2株分泌IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
    4.杂交瘤的克隆化
    筛选得到的阳性克隆,采用有限稀释法对杂交瘤克隆化,克隆前1天制备饲养细胞层,将要克隆的杂交瘤细胞用不完全培养基从培养孔内轻轻吹干,计数。调整细胞为5个细胞/ml。取准备的饲养细胞层的细胞培养板,每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。在第7天换液,以后每3天换液1次。9天可见细胞克隆形成,ELISA法检测检测抗体效价。并将最强的阳性克隆再次克隆化,直至细胞阳性率达100%,即可定株;定株的细胞扩大培养。并送保藏中心保藏。
    5.杂交瘤细胞的保藏
    将杂交瘤细胞株(分类名IL-6杂交瘤细胞株)于2014年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号分别为CGMCC No.8796、CGMCC No.8797。
    实施例3.单克隆抗体的大量生产
    已具备2株单克隆抗体杂交瘤细胞株:取1×107的细胞浓度注射于Balb/c小鼠腹腔,10天后收集腹水。通过以下步骤纯化单克隆抗体:
    1.收集所得的腹水以2500rpm离心,取上清。加等体积的PBS(pH7.4)与1/2体积的饱和硫酸铵,4℃、静置30min;
    2.以3000rpm,4℃,离心20min;
    3.去沉淀,上清加等体积的饱和硫酸铵,静置30min;
    4.以3000rpm,4℃,离心20min;
    5.取沉淀,加5ml生理盐水与5ml饱和硫酸铵静置30min;
    6.以3000rpm,4℃,离心20min;
    7.沉淀加5ml生理盐水与5ml0.02M的PB缓冲液(PH7.4);
    8.加8倍柱体积的PB缓冲液平衡Protein G凝胶柱(购自GE公司);
    9.将第7步中的混合液加到凝胶柱中;
    10.使用10倍柱体积的PB缓冲液洗脱杂蛋白;
    11.用0.2M pH2.8甘氨酸缓冲液洗脱抗体并收集;
    12.使用再生液清洗柱子;
    13.加平衡液平衡柱子。
    实施例4.本发明IL-6-ELISA检测试剂盒关键步骤的制备
    1.制备包被有IL-6单抗的多孔板:
    a)包被:采用0.05M、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的实施例3制备的IL-6单克隆抗体(CGMCC No.8796)混合制成包被混合液,并将其加载于微孔板上,4℃包被12h;
    碳酸盐缓冲液标准配方:
    无水碳酸钠 1.600g碳酸氢钠 2.940g
    pH值9.60-9.80 纯化水定容至1000ml
    b)洗板:稀释20倍浓缩洗液至1倍浓度,使用1倍浓度洗液洗板2次;20倍浓缩洗液标准配方:

    c)封闭:将封闭液(磷酸氢二钠5.8g,磷酸二氢钠0.593g,氯化钠8.0g,山羊血清100ml,Proclin-3000.5ml,纯化水定容至1000ml)加载于微孔板上,室温2小时,甩干,干燥过夜,获得包被有IL-6单抗的多孔板。根据需要,可以将包被板进行包装。
    2.试剂1的制备(100×):
    试剂1用作生物素标记的白介素6单克隆抗体工作液。
    (1)生物素的标记步骤:
    将IL-6单克隆抗体(CGMCC No.8797)用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)调整到1mg/ml。用0.1mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0),对蛋白质充分透析。
    用1ml DMSO溶解NHSB(N-羟基琥珀酰亚胺生物素,购自Pierce)1mg,即浓度为1mg/ml。
    向1ml透析后的单克隆抗体溶液加入150μl NHSB溶液(即含NHSB150μg)。
    在室温下持续搅拌4小时。
    加入6μl1mol/L NH4Cl(每25μg NHSB加1μl),在室温下搅拌10分钟。
    在4℃,用PBS充分透析过夜,以除去游离的NHSB。
    加入50%(v/v)甘油,使生物素标记的白介素6单克隆抗体终浓度为0.5mg/ml,置-20℃保存。
    (2)试剂1的配制(100×)的配方:
    1000ml中有5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、12.5mg/L生物素标记 的第二白介素6单克隆抗体,pH7.2-7.4。
    3.试剂2的制备:
    1000ml试剂2中有5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300,pH7.2-7.4。
    4.试剂3的制备(100×):
    1000ml中有5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300、12mg/L辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(购自life)。
    5.样本稀释液的制备(10×):
    58g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钠、180g/L氯化钠、250ml/L山羊血清、10ml/L吐温20和5ml/L防腐剂;pH值6.20-6.60。
    6.底物液的制备:
    辣根过氧化物酶底物:底物液A为含有0.6‰过氧化脲的10mmol/L柠檬酸缓冲液,避光储存;底物液B为含有0.4‰TMB的5mmol/L柠檬酸缓冲液,避光储存。
    7.IL-6校准品的配制:
    用1×样品稀释液将高值阳性血清(或IL-6纯品)稀释,使得校准品的IL-6浓度梯度为0、10、25、250、750、1500pg/ml。
    根据需要,校准品可溯源至ProSpec公司的参考物质Interleukin-6Human Recombinant(Catalogue Number:CYT-213),纯度≥97.0%。
    8.IL-6质控品的配制:
    质控品收集自IL-6临床检测高值的人源样本(血清或血浆),经灭活处理,经检测其抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均为阴性。用1×样本稀释液稀释至规定浓度范围内。高值质控:700-900pg/ml;低值质控:200-400pg/ml。2-8℃保存备用。
    测试例
    测试例1.本发明IL-6ELISA试剂盒的使用方法
    样本要求:标本无需特殊处理,采用常规医用技术收集全血标本,离心分离后吸取血清或血浆用于检测。全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于 -20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。请不要使用严重溶血、脂血或黄疸标本。
    1.实验前准备
    1.1.自4℃冰箱中取出试剂盒,均应平衡到室温(18-25℃)。
    1.2.20倍浓缩洗涤液用纯化水或蒸馏水稀释20倍后使用。
    1.3.10倍样品稀释液用纯化水或蒸馏水稀释10倍后使用。
    2.试验方法
    2.1.加校准品和待测样本:取足够数量的包被板,固定于框架上,分别设置校准品孔、待测样本孔和空白对照孔,记录各孔位置,除空白对照孔外,在校准品孔中加入稀释后的校准品100μl,校准品零点孔加入IL-6样品稀释液100μl,待测样本孔中加入待测样本100μl;同时加入加生物素标记IL-6抗体工作液每孔50μl,二者混合加入室温反应120min。
    2.2.洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置5-10s,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,洗5次。
    2.3.辣根酶标记亲和素:每孔加入稀释后的辣根酶标记亲和素工作液100μl,(空白对照孔不加)室温反应60min。
    2.4.洗板:弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置5-10s,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,洗5次。
    2.5.显色:每孔加入50μl底物液A和50μl底物液B,充分混匀,室温避光反应15min。
    2.6.终止:显色完毕后,每孔加入50μl终止液,充分混匀。
    2.7.测定:终止反应后,立即置酶标仪450nm波长(以空白孔调零)或双波长450nm/630nm下测定OD值。
    2.8.计算:根据校准品的浓度及对应的OD值,使用双对数线性拟合方式(log(X)-log(Y))计算结果,结果乘以稀释倍数,即为样本最终浓度。
    测试例2.本发明IL-6的ELISA试剂盒的方法学指标
    1.准确度:回收率应在95%~105%之间;
    2.空白检出限:应不高于4.6pg/ml;
    3.测量系统的线性:在4.6pg/ml-1500pg/ml范围内线性相关系数r≥0.9900。
    4.重复性:批内变异系数:CV批内应不超于5%;
    5.批间差:批间变异系数:CV批间应不超于10%;
    表1.准确性、最低检出限、系统线性、重复性检测结果

    6.分析特异性:
    分别检测IL-6阴性样本N1、阳性样本P1血液标本。
    在N1、P1样本中分别添加三个浓度梯度的交叉反应原,检测交叉反应原对IL-6抗体检测的交叉反应情况,实验结果见表2:
    IL-10(30pg/ml、20pg/ml、10pg/ml)、
    降钙素原(400pg/ml、200pg/ml、100pg/ml)、
    TNF-α(25ng/ml、12.5ng/ml、6.5ng/ml)、
    C反应蛋白浓度(50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml)、
    降钙素(30pg/ml、15pg/ml、7.5pg/ml)。
    交叉反应原通常和待测物质具有较高的同源性、序列相似或者具有结构相似的表位??梢韵胂?,如果样本中存在这些交叉反应原时,抗体可能会识别并结合这些交叉反应原,导致假阳性。因此,诊断试剂盒的交叉反应性是一项重要的指标。这对于临床结果的可靠性非常重要。结果分析:白介素-10不大于30pg/ml、降钙素不大于30pg/ml、降钙素原不大于400pg/ml、C反应蛋白不大于50ng/ml、TNF-α浓度不大于25ng/ml时,对IL-6检测结果没有明显影响。
    7.稳定性:试剂盒各组分37℃可放置6天,4℃保存3个月。
    表3.37℃存放稳定性实验结果

    表4.4℃保存条件下稳定性实验结果

    R-H、R-M、R-L分别代表:高值准确度参考品、中值准确度参考品、低值准确度参考品。
    8.干扰物质分析:
    8.1血红蛋白:
    实验结果见表5。结论:当轻度溶血标本血红蛋白≤200mg/ml时,对结果基本无影响,当严重溶血时检测结果可能导致假阳性,故不宜用严重溶血标本。
    8.2甘油三酯:
    实验结果见表6。结论:当甘油三酯在1000mg/dl内,对IL-6检测结果没有显著性影响。
    8.3胆红素:
    实验结果见表7。结果分析:当胆红素浓度不大于20mg/dl时对IL-6检测结果无明显影响,但样本中胆红素高于20mg/dl时,可能会引起假阴性。
    8.4肝素钠:
    实验结果见表8。结果分析:当肝素钠浓度不大于40U/ml时对IL-6检测结果无明显影响。
    8.5EDTA.K2:
    实验结果见表9。结果分析:当EDTA.K2不大于600μg/ml时对IL-6检测结果没有明显影响。
    8.6生物素:
    实验结果见表10。结果分析:当生物素浓度不大于20ng/ml时对IL-6检测结果没有明显影响。
    本发明采用双抗体夹心法测定样本中IL-6水平,即酶标板上包被的抗体与生物素标记抗体和被测样品的IL-6形成“包被抗体-抗原-生物素标记抗体”的夹心复合物结构。另外本发明有效地采用亲和素-生物素-酶复合物实现了检测的高灵敏度。
    本发明的试剂盒一方面可以快速、准确地测定血清中IL-6的含量,对于炎症的早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值;另一方面由于使用两株特异性单克隆抗体的组合,大大提高了IL-6的检测灵敏度。
    本发明具有使用简便、检测快速、灵敏、稳定、操作简便等优点。适用于广大中小医院使用。




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