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    重庆时时彩的注册网址: 乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410222663.8

    申请日:

    2014.05.23

    公开号:

    CN103965354A

    公开日:

    2014.08.06

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/18申请日:20140523|||公开
    IPC分类号: C07K16/18; G01N33/68; G01N33/577; A61K39/395; A61P31/04 主分类号: C07K16/18
    申请人: 苏州大学
    发明人: 高晓明; 董红亮; 扈晓敏; 钟桥
    地址: 215123 江苏省苏州市工业园区仁爱路199号
    优先权:
    专利代理机构: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 常亮
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410222663.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.05.25|||2014.09.03|||2014.08.06

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及抗体领域,特别涉及乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品。该乳铁蛋白的单克隆抗体由保藏号为CCTCC?NO:C201448的杂交瘤产生。本发明提供的单克隆抗体M-860可用于可溶性乳铁蛋白的检测,可用于特异性区分变性与非变性乳铁蛋白,可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测,可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗,可用于辅助诊断类风湿关节炎。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种乳铁蛋白的单克隆抗体,其特征在于,由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生。

    2.  根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体为IgG1型。

    3.  根据权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示。

    4.  根据权利要求3所述的单克隆抗体,其特征在于,所述单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。

    5.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备检测可溶性乳铁蛋白产品中的应用。

    6.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品中的应用。

    7.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备检测膜结合型乳铁蛋白产品中的应用。

    8.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备治疗败血症药物中的应用。

    9.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备检测乳铁蛋白免疫复合物含量试剂盒中的应用。

    10.  如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体在制备诊断类风湿性关节炎试剂盒中的应用。

    11.  一种检测可溶性乳铁蛋白产品,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    12.  一种区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    13.  一种检测膜结合型乳铁蛋白产品,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    14.  一种治疗败血症的药物,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    15.  一种检测乳铁蛋白免疫复合物含量试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    16.  一种诊断类风湿性关节炎试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体。

    说明书

    说明书乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品
    技术领域
    本发明涉及抗体领域,特别涉及乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品。
    背景技术
    败血症是指致病菌或条件致病菌侵入血循环,并在血中生长繁殖,产生毒素而发生的急性全身性感染。40%左右的革兰阴性菌引起的败血症可以发生感染性休克。感染性休克,亦称脓毒性休克,是指由微生物及其毒素等产物所引起的脓毒病综合征伴休克,其主要原因是由革兰氏阴性菌释放的极低浓度的脂多糖(LPS)能非常有效的刺激巨噬细胞释放炎性细胞因子、花生四烯酸的代谢产物及其他的炎性介质,LPS侵入血循环,激活宿主的各种细胞和体液系统,产生的细胞因子和内源性介质,作用于机体各种器官、系统,影响其灌注,导致组织细胞缺血缺氧、代谢紊乱、功能障碍,甚至造成罹患败血症的病人多器官衰竭。
    目前对于这类感染性休克类型败血症患者的治疗主要是选用第3代头孢菌素与氨基糖糖甙类联合应用,染中毒症状严重者可在足量应用有效抗生素的同时给予肾上腺皮质激素短程(3~5天)治疗。由于这类感染致病菌株之间药敏差异大,对常用的抗菌药耐药现象严重,病死率高,预后差。因此,能够有效的抑制LPS刺激巨噬细胞释放炎性细胞因子,并可联合抗生素用于革兰阴性菌引起的败血症治疗的抗体药物的研究成为了目前医学研究的热点。
    LPS的免疫识别受体主要包括LBP和CD14,Toll样家族的成员TLR2和TLR4以及整合素CD11/CD18。近年来,研究发现分泌型乳铁蛋白能够与LPS结合。乳铁蛋白(Lactoferrin,LTF)是一种分子量为80KD的铁结合性糖蛋白,一般情况下由中性粒细胞分泌,乳铁蛋白根据来源可分为分泌型乳铁蛋白(可溶性乳铁蛋白)和膜结合型乳铁蛋白(membrane-bound lactoferrin,mbLTF)。乳铁蛋白广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中, 如泪液、血液、唾液、精液等。乳铁蛋白含量最高的是乳汁,由乳腺细胞合成,成熟母乳和初乳的浓度中的乳铁蛋白浓度为1~7g/L。乳铁蛋白也是嗜中性粒细胞次颗粒的主要成分,为血液中乳铁蛋白的主要来源。该蛋白除了参与铁的转运,还具有抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抑制肿瘤细胞生长、消除炎症及参与免疫调节等多种生物学功能,在哺乳动物的固有免疫应答过程中起着重要作用。
    尽管分泌型乳铁蛋白能够与LPS结合,但它们结合后不能直接诱导细胞活化,因此分泌型乳铁蛋白不能被看做严格意义上的模式识别受体(PRR),它可能作为PRRs的竞争者,或者某些情况下作为载体分子发挥作用。在对乳铁蛋白在小鼠巨噬细胞表达的基础上研究发现,膜结合型乳铁蛋白是一种新型的LPS受体,也参与了LPS活化巨噬细胞的过程。虽然目前的研究对分泌型乳铁蛋白的诸多功能已经有了足够多的认识,但对mbLTF的功能却知之甚少,仅有少数报道探讨了膜结合型乳铁蛋白在细胞上的表达。Cho JK等人通过亲和层析等方法从人乳脂肪球膜中纯化出了膜结合型乳铁蛋白,发现它的相对分子量,N端氨基酸序列与分泌性乳铁蛋白一致,但并未对膜结合型乳铁蛋白的功能进行研究。Butler TW等人通过流式细胞术发现其在慢性B型淋巴细胞性白血病和扁桃腺来源的B细胞表面高表达,且在细胞不同的成熟阶段表达水平会发生改变。Lucy V.Deriy等人用针对人乳铁蛋白的单克隆抗体2B8及AHN-9对人外周血来源的中性粒细胞进行了表面染色,发现乳铁蛋白在人静息态中性粒细胞表面表达。但单克隆抗体2B8和AHN-9并不能识别人外周血单个核细胞(peripHeral blood mononuclear cell,PBMC)来源的单核细胞,不能作为探针检测单核巨噬细胞表面的mbLTF。因此,提供一种能够与mbLTF特异结合的单克隆抗体具有重要的现实意义。
    发明内容
    有鉴于此,本发明提供了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品。该单克隆抗体M-860除了能很好地识别可溶性乳铁蛋白之外,可用于特异性区分变性与非变性乳铁蛋白,还可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测,可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗,可用于辅助诊断类风湿关节炎。
    为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
    本发明提供了一种乳铁蛋白的单克隆抗体,由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生。
    蛋白质抗原的表位根据结构特点可分为构象表位和线性表位这两种类型。其中构象表位由抗原氨基酸序列上不连续排列、空间上形成特定构象的短肽、多糖残基或核苷酸所构成。本发明提供的单克隆抗体的纯度在95%以上,与乳铁蛋白具有较高的亲和力,且单克隆抗体M-860识别的是可溶性乳铁蛋白或膜结合型乳铁蛋白的构象表位。
    研究发现,单克隆抗体M-860能够很好地识别人单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞表面的LTF,可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测,从而可进一步确定膜结合型乳铁蛋白的表达谱,为研究特定细胞上膜结合型乳铁蛋白的功能提供依据。另外,单克隆抗体M-860可作为工具研究膜结合型乳铁蛋白作为一种新型模式识别受体在LPS、β-葡聚糖活化免疫细胞如巨噬细胞中的作用。
    研究发现,LPS能够竞争抑制单克隆抗体M-860与LTF的结合,表明M-860和LTF的结合位点,与LPS和LTF的结合位点相同;且单克隆抗体M-860能够在体外、体内均可抑制LPS活化巨噬细胞释放TNF-α,并可有效延长LPS诱导的败血症小鼠的寿命,且这种效应具有剂量依赖性,可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗。
    类风湿关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病,其病理特点为慢性进行性关节滑膜和关节软骨损伤,往往累及终生,形成长期病痛。类风湿关节炎患者体内存在多种抗自身抗体及免疫复合物,如类风湿因子、抗核抗体、抗角蛋白抗体、抗磷脂抗体及抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)等。而抗乳铁蛋白抗体属于ANCA的一种,在部分RA患者血清中呈高表达。由于RA病人体内乳铁蛋白与其抗体均在血清中高表达,乳铁蛋白与其抗体结合后产生的LTF免疫复合物的含量明显升高。且该LTF免疫复合物能够刺激人单核细胞活化,释放TNF-α等炎性因子,在RA的疾病发展过程中发挥重要的作用,因此血清中LTF免疫复合物的含量可以成为一个良好的辅助诊断指标。研究发现,本发明提供的单克隆抗体M-860能够有效地结合血清中的LTF 免疫复合物,结果表明该单克隆抗体用于类风湿关节炎病人血清中LTF免疫复合物的检测具有很好地特异性和敏感性,从而可用于辅助诊断类风湿关节炎。
    在本发明中,该单克隆抗体为IgG1型。
    在本发明中,该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示。
    在本发明中,该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测可溶性乳铁蛋白产品中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在区分检测变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测膜结合型乳铁蛋白产品中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO: 9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在制备治疗败血症药物中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在制备检测乳铁蛋白免疫复合物含量试剂盒中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ IDNO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了该单克隆抗体在制备诊断类风湿性关节炎试剂盒中的应用;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了一种检测可溶性乳铁蛋白产品,包括本发明提供的单克隆抗体;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ IDNO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为 GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了一种区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的产品,包括本发明提供的单克隆抗体;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了一种检测膜结合型乳铁蛋白试剂盒,包括本发明提供的单克隆抗体;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ IDNO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明还提供了一种治疗败血症的药物,包括本发明提供的单克隆抗体;;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ IDNO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    在本发明提供的一些实施例中,治疗败血症的药物还包括抗生素。
    本发明还提供了一种检测乳铁蛋白免疫复合物含量的产品,包括本发明提供的单克隆抗体;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ ID NO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链 CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    在本发明提供的一些实施例中,该检测乳铁蛋白免疫复合物含量的产品可以为检测乳铁蛋白免疫复合物含量的试剂或试剂盒。
    本发明还提供了一种诊断类风湿性关节炎试剂盒,包括本发明提供的单克隆抗体;单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生;该单克隆抗体为IgG1型;该单克隆抗体的重链序列如SEQ ID NO:5所示,轻链序列如SEQ ID NO:6所示;该单克隆抗体的重链CDR1序列如SEQ ID NO:7所示,重链CDR2序列如SEQ ID NO:8所示,重链CDR3序列如SEQ IDNO:9所示,轻链CDR1序列如SEQ ID NO:10所示,轻链CDR2序列为GIS,轻链CDR3序列如SEQ ID NO:11所示。
    本发明提供了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及乳铁蛋白单克隆抗体的产品。该乳铁蛋白的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤产生。荧光标记试验的结果显示,单克隆抗体M-860能够很好地识别人单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞表面的LTF,表明单克隆抗体M-860可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测;LPS竞争抑制试验的结果显示,LPS能够竞争抑制M-860与LTF的结合,结果说明M-860和LTF的结合位点,与LPS和LTF的结合位点相同;单克隆抗体M-860抑制LPS活化巨噬细胞试验的结果显示,单克隆抗体M-860能够在体内或内外明显抑制LPS诱导产生的TNF-α含量,并有效延长LPS诱导的败血症小鼠的寿命,且这种效应具有剂量依赖性,表明单克隆抗体M-860可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗;通过检测RA病人血清中LTF免疫复合物的含量,结果显示单克隆抗体M-860能够有效地结合血清中的LTF免疫复合物,表明该单克隆抗体用于类风湿关节炎病人血清中LTF免疫复合物的检测具有很好地特异性和敏感性,从而可用于辅助诊断类风湿关节炎。
    生物保藏说明
    分类命名:杂交瘤细胞株M-860,于2014年03月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏中心地址为湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学校内,保藏编号为CCTCC NO:C201448。
    附图说明
    图1示实施例1中ELISA鉴定乳铁蛋白免疫效果;
    图2示实施例2中SDS-PAGE鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860的纯度;
    图3示实施例2中ELISA鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860的敏感性;
    图4示实施例3中ELISA鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860亚型;其中,图4(a)示将IgG1作为二抗的吸光度,图4(b)示将IgG2a作为二抗的吸光度,图4(c)示将IgG2b作为二抗的吸光度,图4(d)示将IgG3作为二抗的吸光度;
    图5示实施例5中ELISA鉴定单克隆抗体M-860识别乳铁蛋白的构象表位;其中,图5(a)示将未经处理的LTF作为包被抗原的吸光度,图5(b)示将加热处理后的LTF作为包被抗原的吸光度,图5(c)示将β-巯基乙醇处理后的LTF作为包被抗原的吸光度;
    图6示实施例6中流式细胞术分析单克隆抗体M-860对人及小鼠单核巨噬细胞表面乳铁蛋白的识别;其中,图6(a)示M-860对人外周血单核细胞表面染色结果,图6(b)示M-860对小鼠腹腔巨噬细胞表面染色结果;
    图7示实施例7中LPS竞争抑制单克隆抗体M-860与乳铁蛋白的结合;
    图8示实施例8中单克隆抗体M-860体外抑制LPS活化巨噬细胞释放细胞因子TNF-α;其中,图8(a)示同型对照抗体兔IgG(RbIgG)与多抗L3262对TNF-α的影响;图8(b)示同型对照抗体鼠IgG1(mIgG1)与M-860对TNF-α的影响;
    图9示实施例8中单克隆抗体M-860体内抑制LPS诱导释放细胞因子TNF-α;
    图10示实施例8中小鼠的生存曲线;其中,图10(a)示空白对照组小鼠的生存曲线,图10(b)示腹腔注射生理盐水的小鼠的生存曲线,图10(c)示腹腔注射mIgG(50μg/只)的小鼠的生存曲线,图10(d)示腹腔注射M-860(50μg/只)的小鼠的生存曲线,图10(e)示腹腔注射mIgG(200μg/只)的小鼠的生存曲线,图10(f)示腹腔注射M-860(200μg/只)的小鼠的生存曲线;
    图11示实施例9中LTF免疫复合物在健康人血清和类风湿关节炎患者 血清中的表达;
    图12示实施例9中单克隆抗体M-860检测乳铁蛋白免疫复合物的含量。
    具体实施方式
    本发明公开了乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
    说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下:

    说明书和权利要求书中所使用的核苷酸符号的含义及名称来源如下:


    本发明提供的乳铁蛋白单克隆抗体及其应用以及相关产品中所用材料和试剂均可由市场购得。其中,Balb/C雌性小鼠(6~8周),C57/B6雌性小鼠(6~8周),购自南京鹏晟;正常小鼠血清来源于正常BALB/c(H-2d)小鼠,购自斯莱克,雌性,6-8周龄;血清样品:正常人血清样品由北京市红十字血液中心提供,RA活动期病人血清样品由北京大学第二医院提供;CFA,购自Sigma,F5881-10x10ML;IFA,购自Sigma,F5506-10x10ML;HAT,购自Sigma,H0137-10VL;HT,购自Sigma,H0262-10VL;lactoferrin,购自Sigma;PEG,购自罗氏,RD10783641001;降植烷,购自Sigma,P2820;DMSO,购自Sigma,D2650;DMEM,购自HyClone,SH30021.01B;FBS,购自HyClone,SH30084.03;SP2/0,苏州大学生物医学研究院实验室细胞库;人乳铁蛋白(LTF,L4894)购自美国Sigma公司;Protein-G-Argarose购自pHarmacia Biotech公司;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体购自美国SBA公司;RNA提取试剂盒、寡聚核苷酸引物(16纳摩尔,D510)、dNTP混合物(2.5毫摩尔,D4030A)、RNA酶抑制剂(40单位/微升,D2313A)、逆转录酶M-MLV(无RNA酶,D2639A)均购自TaKaRa公司;pfu DNA聚合酶(500单位,EP0502)购自Thermo scientific;氯仿、异丙醇、乙醇等常规试剂均购自国药;DEPC 水(无DNA酶、RNA酶)(R0022)购自碧云天;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠/兔IgG抗体,购自美国SBA公司;β-巯基乙醇,购自Sigma,M-6250;LPS,购自Sigma,L2880。
    市售试剂的规格:PBS缓冲液(浓度为0.15mol/L,pH为7.2),pH9.0、0.1M Tris-Hcl,pH2.7、0.1M Gly-Hcl,20%乙醇,Protein-G-Argarose,0.1M碳酸钠-碳酸氢盐缓冲液pH9.0。
    仪器设备与耗材:Eppendorf公司微量加样器;4℃冰箱;-80℃低温冰箱;Axygen公司微量吸头;芬兰雷勃公司ELISA reader;96孔酶标板;EppendorfPCR扩增仪;Axygen胶回收试剂盒。
    序列如SEQ ID NO:3所示的轻链引物的上游引物参照文献(The FASEBJournal,Vol.15,815-822)设计。
    下面结合实施例,进一步阐述本发明:
    实施例1单克隆抗体的制备
    单克隆抗体制备的实验方法具体为:
    1、细胞融合前准备
    (1)骨髓瘤细胞的制备
    骨髓瘤细胞应和免疫动物应属于同一品系,这样杂交融合率高,也便于杂交瘤产生大量McAb,常用的骨髓瘤细胞为Sp2/0。取对数生长骨髓瘤细胞离心,弃上清。用无血清培养液洗2次,离心后再重悬计数,取得4×107细胞备用。
    (2)制备免疫脾细胞(免疫原是人乳铁蛋白hLTF)
    取10只BALB/c小鼠,6-8周,雌性,免疫前取血制备正常鼠血清作为阴性对照。以hLTF(100μg/100μL/只)作为免疫原,第一针加等体积的完全弗氏佐剂皮下免疫,10天后剂量减半加等体积的不完全弗氏佐剂加强免疫,免疫后7天取血,ELISA检测免疫效果。ELISA检测方法具体为:以乳铁蛋白(2μg/mL)作为包被抗原,倍比稀释的乳铁蛋白免疫血清为一抗,正常鼠血清作为对照,辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG作为检测二抗,通过ELISA的方法检测乳铁蛋白的免疫效果。结果如图1所示,乳铁蛋白诱导机体产生 了高滴度的乳铁蛋白特异性抗体,这些免疫小鼠脾脏可用于乳铁蛋白单克隆抗体的制备。
    激发免疫3天后将小鼠摘除眼球法处死小鼠,收集血样。无菌条件下取出脾脏,置于盛有不完全培养液的平皿中,去除结缔组织。将脾脏转移到另一盛有不完全培养液的平皿中,放在200目不锈钢筛网上,用注射器针芯将脾脏研碎。
    收集细胞悬液于50mL离心管中,1200rpm离心5min,弃上清。用培养液将细胞洗2次,每次洗后离心且去上清。用不完全培养液重悬细胞,计数脾细胞【免疫后(1~2)×108细胞/脾】的悬液备用。
    (3)制备饲养细胞(制取脾细胞悬液,细胞融合前1-2天)
    BALB/C小鼠(6~10周)摘除眼球法处死小鼠,浸泡在75%酒精内,3~5min,用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜。取脾脏,制备脾细胞悬液,用含HAT、20%FBS的DMEM培养液重悬细胞,调整细胞数至1×105/mL。加入96孔板,100μL/孔,放入37℃,5%CO2培养箱培养。
    2、细胞融合
    将上述制得的骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:5的比例混合在一起,在50mL离心管中用无血清不完全培养液洗1次,1200rpm离心8min,弃上清,用吸管吸净残留液体,以免影响聚乙二醇的(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略微松动。
    60s内加入37℃预温的1mL45%PEG(分子量1500)溶液,边加边轻微摇动,37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用,每隔2min分别加入1mL、2mL、3mL、4mL、5mL和6mL。800rpm离心10min。弃上清,用含20%胎牛血清的HAT选择培养液重悬。根据所用96孔培养板的数量,补加完全培养液至200μL/每孔的用量。将上述融合后的悬浮细胞加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100μL。将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
    3、特异性杂交瘤细胞的筛选
    10~14d后通过ELISA(酶联免疫吸附实验)筛选分泌抗LTF单克隆抗体的阳性克隆。筛选出一个分泌抗LTF单克隆抗体的阳性克隆。
    4、杂交瘤细胞的克隆化培养
    利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的。取出阳性孔内的细胞进行计数,用培液将其稀释到每毫升内10个细胞。如果在96孔板内每孔加0.1mL,其机率将为每孔内落入一个细胞。加入一定数量的饲养细胞,经过2~3天后,可观察到有集落生长的孔,并标记单克隆。10天左右可以检测。根据检测的阳性结果再次进行克隆化。直至阳性率达到100%。将获得的遗传稳定的杂交瘤细胞(杂交瘤细胞株M-860)进行保藏,保藏编号为CCTCC NO:C201448,其产生的单克隆抗体命名为单克隆抗体M-860。
    5、诱生腹水
    将保藏编号为CCTCC NO:C201448的杂交瘤细胞,通过扩大培养,接种于Balb/c小鼠腹腔内,使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖,从而得到大量含单克隆抗体的腹水。Balb/c小鼠腹腔注射降植烷(0.5mL/只),7天后腹腔接种3~5×106杂交瘤细胞。10~20天后取腹水,每毫升腹水中含1~10mg单克隆抗体。
    实施例2单克隆抗体M-860的纯化
    用PBS缓冲液(浓度为0.15mol/L,pH为7.2,以下采用的PBS缓冲液均为此种缓冲液)将Protein G粒子洗3遍备用。腹水用冷的PBS缓冲液稀释一倍后用微孔滤膜过滤腹水,以除去较大的凝块及脂肪滴,10000g4℃高速离心15分钟,除去细胞残渣及小颗粒物质。处理后的腹水重复过柱三次。用100mL的PBS缓冲液洗涤柱子后,pH2.7、0.1M的Gly-HCL洗脱抗体,pH9、0.1M的Tris-HCL中和抗体后用透析袋在PBS缓冲液中4℃透析过夜,获得纯化后的单克隆抗体M-860。SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度,ELISA鉴定抗体的特异性和敏感性。
    结果如图2、图3所示,结果显示该方法纯化得到的抗体纯度在95%以上,且保持了与乳铁蛋白结合的高亲和力。
    实施例3单克隆抗体M-860的亚型鉴定
    以乳铁蛋白(2μg/mL)作为包被抗原,实施例2制得的纯化的单克隆抗体M-860抗体作为一抗(1μg/mL),HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3作为检测二抗,ELISA鉴定乳铁蛋白单克隆抗体M-860的亚型。以小鼠IgG作为一抗的同型对照。具体操作为:将LTF(2μg/mL)溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,包被于96孔酶标板,每孔100μL,4℃过夜。PBS-T溶液(PBS缓冲液中加入0.05%Tween20)洗5次。2%BSA-PBST溶液封闭,每孔200μL,37℃封闭2小时。PBS-T溶液洗5次。加入纯化得到的LTF单克隆抗体M-860(1μg/mL),每孔100μL,37℃孵育2小时。PBS-T溶液洗5次。再分别加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,37℃孵育1小时。PBS-T溶液洗5次。OPD-磷酸柠檬酸缓冲液显色(pH9.6),12.5%硫酸溶液终止反应。ELISA reader读取OD492nm吸光度值。
    结果如图4所示,该单克隆抗体为IgG1型。
    实施例4PCR鉴定单克隆抗体M-860的高频突变区CDR3
    1、总RNA的提取
    1mL的RNAiso Plus裂解1×107M-860实施例1制得的杂交瘤细胞,向上述匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso Plus的1/5体积量),盖紧离心管盖,用手剧烈振荡15s(氯仿沸点低、易挥发,振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后,再室温静置5min。12000g4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管,此时匀浆液分为三层,即:无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃下静置10min。12000g4℃离心10min。一般在离心后,试管底部会出现沉淀。
    2、RNA沉淀的清洗
    小心弃去上清,缓缓地沿离心管壁加入75%的乙醇1mL(切勿触及沉淀),轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁,12000g4℃离心5min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量,应尽量除净乙醇)。
    3、RNA的溶解
    室温干燥沉淀2~5min(不可以离心或加热干燥,否则RNA会很难溶解),加入30微升的DEPC水水溶解沉淀,必要时可用移液器轻轻吹打沉淀,待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
    4、RNA逆转成cDNA
    Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液:1ng~1μg上述RNA作为模板,加入1μL25μM的随机引物,加水至6μl,70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。再分别加入5×M-MLV Buffer2μl,10mM dNTP0.5μL,40U/μl的RNA酶抑制剂0.25μl,200U/μl RTase M-MLV0.25~1μl,加水至10μl体系。42℃反应1h。70℃保温15min后冰上冷却,得到的cDNA产物用于PCR扩增。
    5、PCR扩增
    PCR反应的扩增体系为:取1μL cDNA产物作为模板,10μM上下游引物各0.5μL(其中,重链引物的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,重链引物的下游引物序列如SEQ ID NO:2所示,轻链引物的上游引物序列如SEQ IDNO:3所示,轻链引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示,具体见表1),2.5mM dNTP2μL,pfu酶0.2μL,10×pfu buffer(含Mg2+)2μL,加纯水至20μL。PCR反应条件及大?。?5℃预变性5min,95℃变性30s,55℃(或52℃、57℃)退火30s,72℃延伸45s,循环35次后72℃后延伸10min?;厥漳康腄NA片段,测序(苏州金唯智生物科技有限公司)。单克隆抗体M-860的重链序列如SEQ ID NO:5所示,单克隆抗体M-860的轻链序列如SEQ ID NO:6所示,具体如下:
    单克隆抗体M-860的重链序列:

    单克隆抗体M-860的轻链序列:

    表1引物序列

    实施例5ELISA鉴定单克隆抗体M-860识别可溶性乳铁蛋白的构象表位
    将未处理的人可溶性LTF、95℃5分钟加热变性或1%的β-巯基乙醇处理的人可溶性LTF(2μg/mL)作为包被抗原,溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,包被于96孔酶标板,每孔100μL,4℃过夜。PBS-T溶液(0.15mol/L、pH为7.2PBS缓冲液中加入0.05%Tween20)洗5次。2%BSA-PBST溶液封闭,每孔200μL,37℃封闭2小时。PBS-T溶液洗5次。分别加入实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860和商品化的LTF多抗L3262(1μg/mL),mIgG和RIgG作为阴性对照抗体,每孔100μL,37℃孵育2小时。PBS-T溶液洗5次。再分别加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(作为检测二抗),37℃孵育1小时。PBS-T溶液洗5次。OPD-磷酸柠檬酸缓冲液显色(pH9.6),12.5%硫酸溶液终止反应。ELISA reader读取OD492nm吸光度值,检测乳铁蛋白单克隆抗体M-860对可溶性乳铁蛋白的识别情况。结果如图5所示。
    由图5可知,单克隆抗体M-860能很好地识别未经处理的可溶性LTF,对热变性及经β-巯基乙醇变性的可溶性LTF不能识别,而LTF特异性多抗L3262则对三者均有识别。结果说明单克隆抗体M-860识别的是可溶性LTF的构象表位,可用于区分变性可溶性LTF与非变性可溶性LTF。
    实施例6单克隆抗体M-860的荧光标记
    取5mg实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860透析到0.1M碳酸钠-碳酸氢盐缓冲液(pH9.0)中。2mL的0.1M碳酸钠-碳酸氢盐缓冲液溶解FITC(20:1)。取250ul的溶解好的FITC逐滴加入到抗体中,避光,室温放置2h。将上述制得的混合物过SepHadex G-25M凝胶柱以分离未标记的抗体,获得FITC标记的M-860。按照公式Molar F/P=2.77×A495/(A280–0.35×A495)计算抗体的标记率。
    取新鲜分离的人外周血单核及小鼠腹腔巨噬细胞(106个细胞/管),用FITC标记的M-860(16μg/mL)在冰上染色30min,FITC标记的562(抗OVA的单克隆抗体)作为同型对照抗体,流式细胞仪检测。结果如图6所示。
    由图6可知,单克隆抗体M-860能够很好地识别人单核细胞及小鼠腹腔巨噬细胞表面的LTF。结果表明单克隆抗体M-860可作为探针应用于膜结合型乳铁蛋白的检测。
    实施例7ELISA检测LPS竞争抑制单克隆抗体M-860与乳铁蛋白的结合
    为检测M-860与LTF的结合位点是否与LPS与LTF结合位点相同,以LTF(2μg/mL)作为包被抗原包被到ELISA板子上,阻断剂LPS及相应对照多糖Dextran(DEX)先与板子上的LTF结合2个小时后,再相继加入单克隆抗体M-860作为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为检测二抗。具体操作为:
    将人LTF(2μg/mL)溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,包被于96孔酶标板,每孔100μL,4℃过夜。PBS-T溶液(PBS缓冲液中加入0.05%Tween20)洗5次。2%BSA-PBST溶液封闭,每孔200μL,37℃封闭2小时。PBS-T溶液洗5次。分别加入LPS和DEX(2μg/mL),每孔50μL,37℃孵育2小时。继续加入LTF单克隆抗体M860(1μg/mL),再分别加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗,37℃孵育,30分钟。PBS-T溶液洗5次。OPD-磷酸柠檬酸缓冲液显色(pH9.6),12.5%硫酸溶液终止反应。ELISA reader读取OD492nm吸光度值。结果如图7所示。
    由图7可知,LPS能够竞争抑制M-860与LTF的结合,结果说明M-860 和LTF,与LPS和LTF的结合位点相同。
    实施例8单克隆抗体M-860抑制LPS活化巨噬细胞
    取新鲜制备的小鼠腹腔巨噬细胞铺在96孔培养板中,2×105个细胞/孔,实施例2制得的单克隆抗体M-860(25μg/mL)或多抗L3262(50μg/mL稀释5个浓度梯度)与巨噬细胞37℃孵育3h,小鼠IgG1及兔IgG分别作为同型对照抗体,继而加入1μg/mL的LPS,37℃、5%CO2培养箱中培养24小时,夹心ELISA检测细胞培养上清中释放的TNF-α。结果如图8所示。
    由图8可知,单克隆抗体M-860能够在体外抑制LPS活化巨噬细胞释放TNF-α,而多抗L3262则没有这种作用。结果表明单克隆抗体M-860可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗。
    将Balb/c小鼠分为六组,10只/组,分别在第0天、第2天腹腔注射生理盐水、mIgG(50μg/只)、M-860(50μg/只)、mIgG(200μg/只)、M-860(200μg/只),并设置未作处理的一组为空白对照。紧接着腹腔注射LPS(20mg/kg只),于第三天取血,双抗体夹心ELISA检测血清中TNF-α含量,结果如图9所示。同时监测各组小鼠的存活情况并绘制生存曲线,结果如图10所示。
    由图9、图10可知,单克隆抗体M-860能够在体内明显抑制LPS诱导产生的TNF-α含量,并有效延长LPS诱导的败血症小鼠的寿命,且这种效应具有剂量依赖性。结果表明单克隆抗体M-860可用于格兰阴性菌诱导产生的败血症的治疗。
    实施例9检测RA病人血清中LTF免疫复合物的含量
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M860(2μg/mL,作为包被抗体)溶于pH=9.6的碳酸盐缓冲液中,包被于96孔酶标板,每孔100μL,4℃过夜。PBS-T溶液(PBS缓冲液中加入0.05%Tween20)洗5次。2%BSA-PBST溶液封闭,每孔200μL,37℃封闭2小时。PBS-T溶液洗5次。加入健康人血清(NHS)或类风湿关节炎(RA)患者血清样本,1:200稀释于0.1%BSA-10%小鼠血清-PBST中,每孔100μL,37℃孵育2小时。PBS-T溶液洗5次。再加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗人IgG,37℃孵育1小时。PBS-T溶液洗 5次。OPD-磷酸柠檬酸缓冲液显色(pH9.6),12.5%硫酸溶液终止反应。ELISAreader读取OD450nm吸光度值。结果如图11、图12所示。
    由图11可知,LTF免疫复合物在健康人血清中无表达,而在大部分类风湿关节炎患者血清中明显升高,LTF免疫复合物含量在健康人和类风湿关节炎两组之间差异均十分显著(p<0.001),表明LTF免疫复合物含量可作为诊断类风湿关节炎的一个指标。而由图12可知,单克隆抗体M-860能够有效地结合血清中的LTF免疫复合物,结果表明该单克隆抗体用于类风湿关节炎病人血清中LTF免疫复合物的检测具有很好地特异性和敏感性,可用于类风湿性关节炎的辅助诊断。
    实施例10检测可溶性乳铁蛋白试剂盒
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860制得可用于检测可溶性乳铁蛋白的试剂盒。
    实施例11区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的试剂盒
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860制得可用于区分变性可溶性乳铁蛋白与非变性可溶性乳铁蛋白的试剂盒。
    实施例12检测膜结合型乳铁蛋白试剂盒
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860制得可用于检测膜结合型乳铁蛋白的试剂盒。
    实施例13治疗败血症的药物
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860与常规辅料混合,按常规方法制得可治疗败血症的药物。
    实施例14检测LTF免疫复合物含量的试剂盒
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860制得可用于检测LTF免疫复合物含量的试剂盒。
    实施例15诊断类风湿性关节炎试剂盒
    取实施例2制得的纯化后的单克隆抗体M-860制得可用于诊断类风湿性关节炎的试剂盒。
    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的?;し段?。




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