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    重庆时时彩老基本走势图: 一种香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410218371.7

    申请日:

    2014.05.22

    公开号:

    CN103983725A

    公开日:

    2014.08.13

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20140522|||公开
    IPC分类号: G01N30/88 主分类号: G01N30/88
    申请人: 广西中烟工业有限责任公司
    发明人: 范忠; 黄善松; 黄世杰; 朱静; 冯守爱; 王维刚; 周艳枚; 陆冰琳; 蒋宏霖; 周奕
    地址: 530001 广西壮族自治区南宁市北湖南路28号
    优先权:
    专利代理机构: 北京三聚阳光知识产权代理有限公司 11250 代理人: 李红团
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410218371.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.11.18|||2014.09.10|||2014.08.13

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,以乙醇水溶液为溶剂,香精香料样品经振荡萃取后,提取液经有机滤膜过滤,采用超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定香豆素和黄樟素。本发明的特点是:采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难;以乙醇水溶液为样品萃取溶剂,在保证提取效率的同时,还能够减小样品中有机杂质进入色谱柱中的量,并有效?;ど字?;与以往方法相比,超高效液相色谱-串联质谱联用法分析速度快,重复性和回收率好,适用于大批量样品的分析。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于:该方法包括以下步骤:
    ①配制乙醇水溶液作为提取液;
    ②配制内标溶液:称取一定量香豆素-d4,用乙醇水溶液配制浓度为125μg/mL的内标溶液;
    ③配制混合标准溶液:称取一定量香豆素、黄樟素,用乙醇水溶液配制含黄樟素和香豆素分别为5μg/mL的混合标准溶液;
    ④样品前处理:称取香精香料样品于三角瓶中,依次加入内标溶液和乙醇水溶液,振荡萃取,取上层清液经有机滤膜过滤后,供超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定;
    ⑤标准曲线的绘制:取混合标准溶液0.05ml、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、8mL,各加入内标溶液40μL,用乙醇水溶液定容至10mL,摇匀,得7级工作标准溶液;对上述系列标准溶液进行UPLC-MS/MS分析,以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析,求得香豆素和黄樟素的标准曲线;
    ⑥数据处理与检测:由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。

    2.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于所述乙醇水溶液(v/v)中乙醇浓度范围为40%~80%。

    3.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于:在步骤④中,内标溶液和乙醇水溶液的加入量分别为40μL和10mL。

    4.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于:在步骤④中,振荡萃取的时间为10min,转速150r/min。

    5.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征 在于:在步骤④中,有机滤膜为0.22μm尼龙滤膜。

    6.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于:在步骤④和⑤中,超高效液相色谱条件为:色谱柱为Agilent ZORBAX StableBond SB-C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.8μm);进样量5μL;柱温为40℃;流动相为0.2%甲酸溶液/乙腈(体积比40:60),等梯度洗脱;流速为0.25mL/min。

    7.  根据权利要求1所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于:在步骤④和⑤中,质谱条件为:质谱检测采用ESI离子源,在正离子检测方式下,选择MRM工作模式进行二级质谱分析,优化后的主要质谱条件为:雾化气50psi,辅助加热气50psi,气帘气10psi,电喷雾电压5000V,干燥温度600℃;各化合物的特征离子分析别为:
    香豆素:定量和定性母-子离子对分别为147.1/91.1和147.1/103.1;
    黄樟素:定量和定性母-子离子对分别为162.9/130.0和162.9/117.2;
    香豆素-d4:定量和定性母-子离子对分别为151.1/95.1和151.1/107.1。

    8.  根据权利要求2所述的香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,其特征在于所述乙醇水溶液(v/v)中乙醇浓度范围为60%。

    说明书

    说明书一种香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法
    技术领域
    本发明属于分析方法技术领域,具体是涉及一种烟用香精香料中香豆素和黄樟素含量的测定方法。
    背景技术
    美国食品和药品管理局(FDA)早在1954年就禁止在食品中添加香豆素,英国食品标准化委员会也于1965年就将香豆素列为禁止在食品中使用的添加剂,我国也禁止将其作为食品添加剂?;普了啬茉诟巫橹行纬苫普了?脱氧核糖核酸(DNA)加合物,食物中黄樟素的含量在0.5%以上时引起肝细胞瘤,有致癌作用,是消化系统、血液系统、泌尿系统的强致癌物,世界各国均禁止使用。在香精、香料生产过程中有可能由天然植物精油带入黄樟素、香豆素等成分,因此对香精香料中香豆素和黄樟素进行测定和质量控制是非常必要的。
    目前,香豆素和黄樟素的测定方法主要有气相色谱、液相色谱和气相色谱-质谱联用法、气相色谱-串联质谱法等。相比这些方法,超高效液相色谱-串联质谱联用法具有更好的分离度、更好的选择性和特异性、更高的灵敏度和更快的分析速度。但目前采用超高效液相色谱-串联质谱联用法同时测定香精香料中黄樟素和香豆素的方法未见报道。
    发明内容
    本发明的目的针对现有技术存在的不足,提供一种简单、快速、灵敏、定性定量准确的使用超高效液相色谱-串联质谱联用法检测香精香料中的香豆素和黄樟素的方法。
    本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
    一种香精香料中香豆素和黄樟素的快速测定方法,该方法包括以下步骤:
    ①配制乙醇水溶液作为提取液;
    ②配制内标溶液:称取一定量香豆素-d4,用乙醇水溶液配制浓度为125μg/mL的内标溶液;
    ③配制混合标准溶液:称取一定量香豆素、黄樟素,用乙醇水溶液配制含黄樟素和香豆素分别为5μg/mL的混合标准溶液;
    ④样品前处理:称取香精香料样品于三角瓶中,依次加入内标溶液和乙醇水溶液,振荡萃取,取上层清液经有机滤膜过滤后,供超高效液相色谱-串联质谱联用法(UPLC-MS/MS)测定;
    ⑤标准曲线的绘制:取混合标准溶液0.05ml、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、8mL,各加入内标溶液40μL,用乙醇水溶液定容至10mL,摇匀,得7级工作标准溶液。对上述系列标准溶液进行UPLC-MS/MS分析,以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析,求得香豆素和黄樟素的标准曲线;
    ⑥数据处理与检测:由组分峰面积与内标峰面积之比进行内标法定量。
    进一步地,乙醇水溶液(v/v)中乙醇浓度范围可以为40%~80%,优选地为60%乙醇水溶液。
    作为优选地,在步骤④中,内标溶液和乙醇水溶液的加入量分别为40μL和10mL。
    作为优选地,在步骤④中,振荡萃取的时间为10min,转速150r/min。
    作为优选地,在步骤④中,有机滤膜为0.22μm尼龙滤膜。
    作为优选地,在步骤④和⑤中,超高效液相色谱条件为:色谱柱为Agilent ZORBAX StableBond SB-C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.8μm);进样量5μL;柱温为40℃;流动相为0.2%甲酸溶液/乙腈(体积比40:60),等梯度洗 脱;流速为0.25mL/min,总分析时间为5min。
    作为优选地,在步骤④和⑤中,质谱条件为:质谱检测采用ESI离子源,在正离子检测方式下,选择MRM工作模式进行二级质谱分析,优化后的主要质谱条件为:雾化气50psi,辅助加热气50psi,气帘气10psi,电喷雾电压5000V,干燥温度600℃。
    各化合物的特征离子分析别为:
    香豆素:定量和定性母-子离子对分别为147.1/91.1和147.1/103.1;
    黄樟素:定量和定性母-子离子对分别为162.9/130.0和162.9/117.2;
    香豆素-d4:定量和定性母-子离子对分别为151.1/95.1和151.1/107.1。
    方法验证结果:本方法回收率的结果在95.0%~99.4%之间,日内、日间测定结果的变异系数分别小于6%和8%,香豆素和黄樟素的定量限分别为77.0和68.1μg/kg。
    本发明的有益效果是:与以往方法相比,超高效液相色谱-串联质谱联用法分析速度快(总分析时间为5min),重复性和回收率好,适用于大批量样品的分析;采用同位素稀释内标法定量避免了复杂混合物体系定量分离、纯化的困难,同时可以减少基质效应的发生;以乙醇水溶液为样品萃取溶剂,在保证提取效率的同时,还能够减小样品中有机杂质进入色谱柱中的量,并有效?;ど字?。
    附图说明
    图1为本发明的标准样品色谱图,1、2、3分别为香豆素、黄樟素和内标(香豆素-d4)的色谱图;
    图2为本发明的典型样品色谱图,1、2、3分别为香豆素、黄樟素和内标(香豆素-d4)的色谱图。
    具体实施方式
    本发明结合以下实施例做进一步描述,但并不限制本发明。
    实施例1
    仪器与试剂:Agilent1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司),API3200三重四极杆串联质谱联用仪(美国AB公司),多功能全自动振荡仪,分析天平(感量0.1mg)。
    香豆素、香豆素-d4购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,纯度≥98%;黄樟素购自迪马公司,纯度≥97%;乙腈为色谱纯,水为去离子子水,其它试剂均为分析纯。
    称取香豆素0.01g,黄樟素0.01g,精确至0.0001g,以60%乙醇水溶液定容至500mL,再通过稀释配制含黄樟素和香豆素分别为5μg/mL的混合标准溶液;称取一定量香豆素-d4,用60%乙醇水溶液配制浓度为125μg/mL的内标溶液。
    样品前处理:称取约0.3g(精度0.001g)香精香料于50mL三角瓶中,加入40μL内标溶液,然后用移液管移取10mL60%乙醇水溶液,振荡萃取10min,转速150r/min,取上层清液,经0.22μm尼龙滤膜过滤后,供UPLC-MS/MS测定。
    色谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX StableBond SB-C18色谱柱(100mm×2.1mm,粒径1.8μm);进样量5μL;柱温为40℃;流动相为0.2%甲酸溶液/乙腈(体积比40:60),等梯度洗脱;流速为0.25mL/min,总分析时间为5min。
    质谱条件:质谱检测采用ESI离子源,在正离子检测方式下,选择MRM工作模式进行二级质谱分析,优化后的主要质谱条件为:雾化气50psi,辅助加热气50psi,气帘气10psi,电喷雾电压5000V,干燥温度600℃。具体化合物的MRM分析参数见表1.
    表1.各种待测物及内标的MRM参数①

    ①黑体字为定量用的参数,非黑体字为辅助定性参数。
    本发明在进行质谱条件的优化时,通过如下方式实现:在正离子模式下以流动注射的方式先对1mg/L香豆素等目标化合物的标准溶液进行母离子全扫描,确定其母离子,然后分别以其分子离子选择其子离子(碎片),每种物质先选择2个碎片,再从中选取信号较强、又无互相干扰的碎片作为定性和定量参数。
    在进行色谱柱的选择时,对3种类型的色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C18柱、ZORBAX Eclipse Plus C18柱和Waters Symmetry C18柱的分离效果进行了比较。结果显示,ZORBAX StableBond SB-C18柱可以实现香豆素和黄樟素的良好分离,且峰形好,分析时间短。
    本发明考察了不同体积比甲醇水溶液、不同体积比乙醇水溶液作为提取溶剂的提取效率。结果发现,40%~80%乙醇水溶液均有较好的提取效果,其中60%乙醇水溶液的提取效果最好。用40%~80%乙醇水溶液提取,回收率高,还可降低样品中有机杂质进入色谱柱中的量,增少基质效应,并有效?;ど字?。因此,本发明选择60%乙醇水溶液作为提取液。
    标准曲线、方法检测限实验:取混合储备液0.05ml、0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、8mL,各加入内标溶液40μL,用60%乙醇水溶液定容至10mL,摇匀,得7级工作标准溶液。对上述系列标准溶液进行UPLC-MS/MS分析,以目标物与内标的峰面积比值对二者相应的浓度比值进行线性回归分析,得到标准曲线、线性范围和相关系数(见表2)。以3倍信噪比(S/N)为检测限,10 倍信噪比(S/N)为定量限,结果见表2。
    表2分析方法的线性范围、标准曲线、相关系数、检测限和定量限

    2.5精密度和回收率实验
    精密度实验:取同一样品进行5次日内和日间平行测定,考察了方法的精密度,本方法日内、日间测定结果的变异系数分别小于6%和8%,说明该方法精密度高。
    回收率实验:在高(样品中目标物含量2倍)、中(样品中目标物含量1倍)、低(样品中目标物含量0.5倍)三个水平上进行了样品加标回收率的测定。结果表明,本回收率的结果在95.0%~99.4%之间,回收率良好。
    实际样品的测定:采用本方法对市场上的80多种香精香料样品进行香豆素和黄樟素的检测,检测过程中未发现有样品不适用于本方法。其中3个样品中检出香豆素(含量分别为137.1μg/kg,456μg/kg,25.1mg/kg),1个样品中检出黄樟素(含量为48.5μg/kg)。

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    一种 香精香料 中香豆素 黄樟素 快速 测定 方法
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