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    重庆时时彩官方网站号码: 新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用.pdf

    关 键 词:
    新型 特异性 细胞 免疫 应答 体外 检测 方法 及其 临床 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410122051.1

    申请日:

    2014.03.29

    公开号:

    CN103983785A

    公开日:

    2014.08.13

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20140329|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 陈仁奋
    发明人: 陈仁奋; 魏秀妹
    地址: 350001 福建省福州市鼓楼区华林路屏东城11栋-302
    优先权:
    专利代理机构: 福州元创专利商标代理有限公司 35100 代理人: 蔡学俊
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410122051.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.12.30|||2014.09.10|||2014.08.13

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用,该方法包括Sm合成肽抗原的合成及筛选,待检血液与Sm混合肽抗原的混合培养,检测培养血上清液中特定细胞因子的水平。该检测方法可以应用于系统性红斑狼疮临床的辅助诊断和治疗监控。本发明具备多种临床应用功能,而且简便快速,容易操作,可灵活运用等特点,具有很好的应用前景。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种新型的细胞免疫应答体外检测方法,其特征在于包括以下步骤:
    (1)筛选并混合能被T细胞特异识别的Smith(Sm)合成肽,作为刺激待检外周血白细胞的抗原,同时设立丝裂原PHA作阳性对照;
    (2)将待检血液与抗原混合,37℃培养20-24小时;
    (3)检测培养血上清液中特定细胞因子的水平,以判断机体对特异性抗原Sm混合肽和非特异性免疫原丝裂原PHA的细胞免疫应答水平。

    2.  如权利要求1所述的细胞免疫应答体外检测方法,其特征在于:所述的Sm混合肽抗原包含五条合成肽, 分别为Sm1、Sm2、Sm3、Sm4、Sm5 ,具体氨基酸序列如下:
    Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL;         
    Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT;   
    Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT;           
    Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI;   
    Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM。

    3.   如权利要求1、2所述的细胞免疫应答体外检测方法,其特征在于:所述的Sm合成肽抗原由FMOC固相合成方法自动或人工合成,经HPLC分析和纯化,抗原纯度90%以上。

    4.  一种如权利要求1、2、3所述的细胞免疫应答体外检测方法的临床应用,其特征在于包括:
    (1)通过测定待检血经Sm 混合肽刺激产生IL-6的含量,判断患者对Sm混合肽抗原的刺激是否存在高水平的细胞免疫应答,以实验诊断SLE;
    (2)通过分析SLE患者经Sm混合肽抗原特异刺激后产生的细胞因子谱,为病人选择细胞因子拮抗剂进行个体化治疗提供实验参考;
    (3)通过观察SLE患者外周血对丝裂原刺激所释放的细胞因子的能力,既可以评估病人的整体细胞免疫功能状态, 也可用来判定该实验结果的可靠性,以排除假阴性结果。

    说明书

    说明书新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用
    技术领域
    本发明属于临床免疫及医学实验诊断领域,具体涉及一种新型的细胞免疫应答体外检测技术。这种实验方法基于检测由Smith (Sm) 合成肽抗原体外刺激外周血T细胞产生的细胞因子水平,为系统性红斑狼疮(SLE)的实验诊断和治疗监控提供参考。
    背景技术
    系统性红斑狼疮(SLE)是影响人群最广泛、最严重的自身免疫病之一,通常好发于育龄女性,能引发全身多种组织及器官的炎症病变。由于该疾病发作潜伏,病程迁延反复并不断加重,临床表现复杂多样,诊断和治疗难度大,世界卫生组织把它列为新世纪医学领域急待攻克的堡垒。
    该疾病的病因目前尚不清楚。传统的观点是SLE患者的多器官炎症损害主要归因于体液免疫紊乱引起的B 细胞异?;罨亩嘀肿陨砜固?,并通过抗原抗体免疫复合物沉积并激活补体等途径造成。因此,临床诊断,病情监控及治疗的参考实验指标几乎都依赖血清中自身抗体。而近年来的大量研究表明,细胞介导的免疫应答及其产生的细胞因子,特别是炎症性的细胞因子等异??赡苁窃斐珊彀呃谴±硌字⒌牧硪还丶?YAP, D. Y. & LAI, K. N. Cytokines and their roles in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus: from basics to recent advances. J Biomed Biotechnol, 2010, 365083.),并与体液免疫相互作用,在整个疾病的发生和发展过程中起重要作用(DAVIS, L. S., HUTCHESON, J. & MOHAN, C. The role of cytokines in the pathogenesis and treatment of systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res, 2011, 31, 781-9.)。最近Iwata 报道了一些SLE病人甚至出现以T细胞免疫紊乱为主导的发病机制(IWATA, S., SAITO, K., TOKUNAGA, M. & TANAKA, Y. B cell or T cell-dominant recurrence after rituximab therapy in patients with SLE. Ann Rheum Dis. 2012. )。这样,检测细胞免疫应答的产物(如细胞因子)与自身抗体一样,对SLE的诊断,监控与治疗至关重要。
    衡量细胞免疫应答的水平可通过检测由免疫原体外刺激全血白细胞产生的细胞因子来衡量。虽然细胞因子能敏感地反映机体的细胞免疫反应,但由于多种生理或病理因素均可影响细胞因子的释放,所以细胞因子本身不具疾病特异性(PICCOLI, L., MERONI, V., GENCO, F., TAMAROZZI, F., TINELLI, C., FILICE, C. & BRUNETTI, E. Serum cytokine profile by ELISA in patients withechinococcal cysts of the liver: a stage-specific approach to assess their biological activity. Clin Dev Immunol, 2012, 483935.)。至今为止,国际上尚未实现以检测细胞因子来诊断自身免疫性疾?。ò⊿LE)的实验技术。 
    诊断及监控SLE 是基于综合临床表现及实验检查的美国风湿病学会(ACR)的分类标准,临床医生在判断该标准规定的11项指标时受主观因素影响较大,诊断准确性差,加上缺乏既敏感及特异的实验指标,经常出现误诊或漏诊。而对SLE的治疗基本上依赖各类免疫抑制剂,药物副作用大,常引发继发性感染。虽然近年来不断涌现出新型的治疗药物(细胞因子拮抗剂),临床医生对它们的选择多依赖个人经验作主观判断,存在盲目性。而目前国际上仍缺乏能指导细胞因子个体化治疗的实验方法(KALUNIAN, K. & JOAN, T. M. New directions in the treatment of systemic lupus erythematosus. Curr Med Res Opin. 2009.;RONNBLOM, L. & ELKON, K. B. Cytokines as therapeutic targets in SLE. Nat Rev Rheumatol, 2010,6, 339-347.)。
    Smith(Sm) 抗原已被证明是系统性红斑狼疮(SLE)最特异的抗原。SLE病人体内除了出现高特异的抗Sm抗体,还存在针对Sm抗原的特异性T细胞免疫反应(FRITSCH-STORK, R., MULLEGGER, D., SKRINER, K., JAHN-SCHMID, B., SMOLEN, J. S. & STEINER, G. The spliceosomal autoantigen heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 (hnRNP-A2) is a major T cell autoantigen in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther, 2006, 8, R118.)。与双链DNA相比,Sm属于蛋白抗原,具有能直接刺激T细胞活化增殖并释放细胞因子的优点。
    基于以上背景,本发明结合Sm抗原对SLE的高特异性及其能在体外直接刺激T细胞活化产生大量细胞因子的高敏感性,发展了一种新型的细胞免疫应答体外检测的实验方法,用以辅助诊断SLE并为其治疗和监控提供参考。
    发明内容
    本发明的目的在于建立一种新型的细胞免疫应答体外检测方法,并用于SLE的辅助诊断和治疗监控。
    本发明的技术方案如下:
    本发明利用Sm抗原能特异地刺激SLE患者T细胞活化并产生多种细胞因子的现象,首先筛选出这些能被T细胞特异识别的Sm合成肽,并将其混合作为体外刺激全血细胞的抗原?;赟LE患者全血中的记忆性T细胞能快速而特异地识别Sm抗原并活化产生细胞因子,本发明将待检血液与Sm混合肽抗原混合培养时间控制在18-24小时(37℃)。然后检测培养血上清液中特定细胞因子的水平,以判断机体对特异性抗原的细胞免疫应答能力以及患者的整体细胞免疫功能状况。实验同时设定本底对照(只加生理盐水)及阳性对照(丝裂原:植物血凝素(PHA))。
    其中,用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五条合成肽,由FMOC固相合成方法自动或人工合成,经HPLC分析和纯化,抗原纯度90%以上。具体氨基酸序列如下:
    Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL              Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT   
    Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT              Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI   
    Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM             
    本实验检测的结果可有多种临床用途:1. 通过测定待检血经Sm混合肽刺激产生IL-6的含量,判断患者对Sm抗原的刺激是否存在高水平的特异性细胞免疫应答,可实验诊断SLE;2.通过分析SLE患者经Sm混合肽刺激后产生的细胞因子谱,为患者选择细胞因子拮抗剂进行个体化治疗时提供实验参考;3. 通过观察SLE患者外周血对丝裂原刺激所释放的细胞因子的能力,既可评估病人的整体细胞免疫功能状况, 也可用来判定该实验结果的可靠性(如患者是否存在较强的免疫功能抑制),以排除假阴性结果。
    本发明的优点:
    本发明原创性地应用一组对SLE 高度特异的Sm合成肽抗原刺激外周全血中的T细胞,然后通过测定T细胞活化后产生的细胞因子水平,首次在国际上建立了一种针对疾病特异性抗原的细胞免疫应答的体外测定方法,并应用于SLE的实验诊断,免疫功能监控及指导个体化治疗,填补了该领域的空白。这种新型的细胞免疫功能检测手段具备多种临床应用功能,而且简便快速,容易操作,可灵活运用等特点。将与目前广泛应用的抗Sm和 抗dsDNA 抗体等体液免疫检测方法互为补充,并可更全面地评估SLE患者的免疫状况,大大地提高了SLE 的实验诊断水平。综合分析由Sm合成肽抗原和丝裂原刺激产生的多种细胞因子,可为SLE的治疗提供科学的实验依据,为降低治疗的副作用,减少目前狼疮治疗中的主观性和盲目性起到重要的作用,具有很好的应用前景。
    附图说明
    图1.体外检测Sm混合肽抗原刺激外周血白细胞产生细胞因子的实验方法。
    图2.  系统性红斑狼疮 (SLE)患者与对照的外周血在Sm 抗原刺激后产生的IL-6 水平。虚线为阳性界值。检测对象包括SLE 患者41例,疾病对照(Disease control )61例(其中包括类风湿性关节炎10例,干燥综合征7例,硬皮病6例,混合结缔组织病6例,其它疾病32例),健康对照(Healthy control)42例。
    图3. 受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析本发明的临床诊断价值。 A: SLE区分疾病对照(disease control)的ROC 曲线; B: SLE区分健康对照(healthy control)的ROC 曲线;C: SLE区分所有对照(controls)的ROC 曲线。AUC: ROC 曲线区域下的面积.
    图4.不同SLE患者(A,B,C)外周血白细胞受Sm合成肽混合抗原(Sm peptide cocktail)刺激产生的细胞因子谱比较。Nil及PHA(植物血凝素)为自身本底及阳性对照。
    图5. 随访SLE患者在使用免疫抑制剂(泼尼松:prednisone)治疗过程中外周血白细胞对PHA刺激应答水平的变化。图示为同一病人的外周血白细胞在用药前(day 0),使用20mg/d的泼尼松一周(day 7)后,继续使用10mg/d泼尼松的第30 天,以及使用低剂量5mg/泼尼松的第60 天对PHA刺激产生的各种细胞因子水平。
    具体实施方式
        以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明,但本发明不仅限于此。
    实施例1:体外检测Sm混合肽抗原刺激患者白细胞产生细胞因子
    1. 实验材料
    (1)无菌血培养管:含有30μl生理盐水(本底对照),30μg Sm 混合肽抗原 (每种Sm合成肽各5μg)及10μg PHA 阳性对照;
    (2)细胞因子检测:可自由选择商业化的试剂盒。如需同时检测多种细胞因子,可用本实验采用的液态芯片技术(Luminex xMAP multiplex beads assay)。如只需检测单一的细胞因子(如 IL-6)含量,可用ELISA 方法。
    2. 实验步骤
    (1)Sm合成肽序列及合成
    用于刺激外周血的Sm混合肽抗原包含五条合成肽,由FMOC固相合成方法自动或人工合成,经HPLC分析和纯化,抗原纯度90%以上。具体氨基酸序列如下:
    Sm1: RGNNIRYFILPDSLPLDTLL              Sm2 :SHETVTIELKNGTQVHGTIT   
    Sm3:GVDVSMNTHLKAVKMT        Sm4:TVGKSSKMLQHIDYRMRCI   
    Sm5: PMGIPPGRGTPMGMPPPGM             
    (2)血培养:如图1所示,外周肝素抗凝血各1 ml加入三种分别含有30μl生理盐水(空白对照管),6×5μg Sm 混合合成肽及10μg 丝裂原植物血凝素(PHA)的无菌管,经充分混匀后放入37℃温箱孵育20-24小时(过夜)。
    (3)细胞因子检测:第二天取出离心(3000转 10分钟)分离血浆,然后采用液态芯片技术同时检测血浆中的多种细胞因子 或用ELISA 检测单一的细胞因子(e.g. IL-6)含量。
    3. 结果计算及判定
    细胞因子释放水平 = 细胞因子含量(抗原或阳性对照)- 细胞因子含量(自身本底对照)
    (1)分析待检血对Sm混合肽刺激产生的IL-6的水平,用以实验诊断SLE:若待检者受Sm混合肽刺激产生的IL-6 ≥ 2000pg/ml, 结果为SLE阳性,反之为阴性。
    (2)如果阳性对照管产生的IL-6低于1000 pg/ml, 表明病人处于中度或高度免疫抑制状态(如使用高剂量的免疫抑制剂),试验结果为不可判定,须待患者细胞免疫功能恢复到一定水平(阳性对照管产生的IL-6≥ 1000 pg/ml)后再重新进行检测。
    实施例2:细胞免疫应答检测方法对SLE的实验诊断
    对应用Sm混合肽刺激T细胞产生IL-6水平用于诊断SLE的方法进行临床验证,分别检测了41例SLE 患者,61例疾病对照者(其中包括类风湿性关节炎10例,干燥综合征7例,硬皮病6例,混合结缔组织病6例,其它疾病32例)及健康对照41例。结果见图2。以产生IL-6 2000pg/ml作为诊断阳性的界值(图2中虚线),显示该法对SLE的诊断敏感性为73%,特异性为92%。
    采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)评估该法的诊断价值,以ROC 曲线下方区域面积(AUC)为参考指标,图3显示SLE对疾病对照(disease control),健康对照(healthy control), 及综合两对照的AUC分别为0.86,0.94 及0.90, 表明该法对SLE具有较高的临床诊断价值。
    实施例3: SLE患者经Sm混合肽刺激产生的细胞因子谱存在明显个体差异
    借助液态芯片技术同时检测培养血上清液中的七种细胞因子,结果表明不同SLE患者的免疫细胞经Sm混合肽抗原(Sm peptide cocktail)刺激后产生的细胞因子谱存在明显个体差异。以图4所示的3位SLE病人为例:SLE病人A产生的炎症性细胞因子以IL-6及IL-1β为主,病人B主要以IL-6及TNF-α为主,而病人C仅以 IL-6为主导。该结果同时也反映了同一细胞因子在不同狼疮患者的病理炎症发展中所起的作用可能不同。因此,分析SLE患者的免疫细胞在该疾病特异的Sm抗原刺激实验中产生的细胞因子谱,临床医生可对其中占主导地位的细胞因子进行针对性地抑制,这样在选择细胞因子拮抗剂治疗病理炎症时就有了科学实验依据,从而避免盲目用药,优化治疗效果。另外,检测的细胞因子类型可根据临床需要进行变换,以便为SLE 的个体化治疗提供指引。 
    本实验表明通过分析SLE患者外周全血受Sm混合肽刺激产生的细胞因子谱,可为病人进行细胞因子拮抗剂的个体化治疗时提供实验参考。
    实施例4:外周血白细胞对PHA刺激的应答能力反映临床免疫抑制水平
    SLE患者在使用免疫抑制剂(如泼尼松:prednisone)治疗过程中,其外周血白细胞对PHA刺激产生的细胞因子水平出现显著波动。以图5中随访的一位SLE患者为例,用药前(day 0),该病人的外周血白细胞在对PHA刺激应答水平很高,伴随大剂量泼尼松(20mg/天)的使用,一周(day 7)后,其对PHA刺激应答水平明显下降,再随着相对高剂量(10mg/天)泼尼松的继续使用,在第30 天,出现了显著的细胞免疫功能抑制,表现为对PHA刺激应答的无反应。随后及时减低泼尼松剂量至5mg/天,在随访的第60 天,对PHA刺激应答开始有所反应(IL-6首先开始回升),表明细胞免疫功能开始恢复。以上结果表明随着治疗狼疮炎症的免疫抑制剂使用的增加和持续,机体正常淋巴细胞功能(对PHA的刺激应该有强烈的免疫反应)出现明显的抑制,说明发生继发感染等副作用的机会在增加。而在使用低剂量免疫抑制剂一段时间后,正常淋巴细胞功能逐渐回升。因此临床医生应根据病人体征,以及对丝裂原刺激的免疫应答能力,对后续免疫抑制治疗的安全性进行评估,及时作出调整剂量的决定,以减少药物副作用,提高疗效。
    本实验说明分析SLE 患者外周全血对丝裂原刺激产生的细胞因子水平可以监控病人的免疫功能状态。 
    SEQUENCE LISTING
     
    <110>  陈仁奋
     
    <120>  新型的特异性细胞免疫应答体外检测方法及其临床应用
     
    <130>  2014
     
    <160>  5    
     
    <170>  PatentIn version 3.3
     
    <210>  1
    <211>  20
    <212>  PRT
    <213>  人工序列
     
    <400>  1
     
    Arg Gly Asn Asn Ile Arg Tyr Phe Ile Leu Pro Asp Ser Leu Pro Leu
    1               5                   10                  15     
     
     
    Asp Thr Leu Leu
                20 
     
     
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                20 
     
     
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    <212>  PRT
    <213>  人工序列
     
    <400>  4
     
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    1               5                   10                  15     
     
     
    Arg Cys Ile
               
     
     
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    <213>  人工序列
     
    <400>  5
     
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    Pro Gly Met
               
     
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