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    重庆时时彩大小玩法: 利用HPLC检测木聚糖合成中Β1,4木糖转移酶活性的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410150610.X

    申请日:

    2014.04.15

    公开号:

    CN103954701A

    公开日:

    2014.07.30

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20140415|||公开
    IPC分类号: G01N30/02 主分类号: G01N30/02
    申请人: 华南农业大学
    发明人: 吴蔼民; 赵先海; 邓小梅; 陈晓阳; 宋丽丽
    地址: 510642 广东省广州市天河区五山路483号
    优先权:
    专利代理机构: 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 代理人: 苏运贞
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410150610.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.12.09|||2014.08.27|||2014.07.30

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法。本发明通过提取植物微囊体,利用微囊体中存在的β-1,4-木糖转移酶,进行Xyln-AA与UDP-Xyl的加成反应,然后利用HPLC进行加成产物的检测,探讨XylT在植物中的活性。由于XylT是木聚糖合成的关键酶,木聚糖是生物质半纤维素的主要成分,理解木聚糖的合成机理有利于更好地利用生物质半纤维素。本发明为深入研究木聚糖合成机理和调节半纤维素中木聚糖成分提供了一种可靠的途径,可根据需要,通过筛选木聚糖合成缺陷型植株,研究调节木聚糖形成的基因,或通过调节影响XylT合成的关键基因,来满足对材料中半纤维素不同含量的需求。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于包括以下步骤:
    (1)将植物茎部去皮,加入提取液,4℃匀浆,过滤,收集滤液,将滤液离心,取上清液进行离心,得到的沉淀为细胞的膜结构,加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,得到微囊体;利用BCA法测定得到的微囊体的蛋白浓度;-80℃保存;
    (2)以尿苷二磷酸木糖和含荧光基团的低聚木糖为底物,利用步骤(1)中制备的微囊体的蛋白活性进行加成反应,反应产物进行酶失活处理,离心后,取上清,过滤,收集滤液,即为加成产物;
    (3)取步骤(2)得到的加成产物和标准品分别进行高效液相色谱检测,通过对照各寡聚产物与标准品的保留时间获得加成产物构成谱;
    (4)对步骤(2)得到的加成产物进行酶失活处理,然后离心,弃沉淀,取上清液,进行酶解,酶解产物进行高效液相色谱分析,可验证加成产物糖苷键的结构;
    (5)对步骤(2)得到加成产物,进行纯化,然后进行MALDI-TOF-MS分析,通过比对分子量得知加成产物为不同聚合度的木糖。

    2.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(2)中所述的含荧光基团的低聚木糖通过如下步骤制备:
    ①配制衍生反应试剂:30mg/mL荧光基团2-氨基苯甲酸和20mg/mL氰基硼氢化钠溶解在MABS中,得到衍生反应试剂;其中,MABS为:24mg/mL醋酸钠和20mg/mL硼酸溶解在甲醇溶液中,MABS要现配现用;
    ②标记反应:将低聚木糖与步骤①中得到的衍生反应试剂按照质量体积比1mg:1mL混合,在80℃反应80min,过量的衍生试剂通过加入乙醚混合后萃取三次去除上层溶液,底层为荧光基团2-氨基苯甲酸标记的低聚木糖,再通过Sep-Pak C18萃取萃取小柱纯化,得到将低聚木糖的还原末端标记荧光基团2-氨基苯甲酸成含荧光基团的低聚木糖,通过高效液相色谱中紫外检测;
    所述的纯化通过如下步骤进行:按体积百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗过后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL反应产物和等量的水混合上柱,再用10mL1%甲酸洗柱,最后用2mL含0.1%甲酸的 60%乙腈洗脱低聚木糖,得到纯化的产物;纯化的产物用氮气吹干后,溶解于20~100μL水备用。

    3.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(1)中所述的将植物茎部去皮,加入提取液,植物与提取液的质量体积比为(2~5)g:1mL;
    步骤(1)中所述的植物为黄梁木(Neolamarckia cadamba(Rubiaceae))或芦笋(Asparagus officinalis L.)。

    4.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(1)中所述的提取液的组成成分为100mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,1mM DTT,1mM EDTA,0.1mM MnCl2,0.4M蔗糖;
    步骤(1)中所述的过滤通过滤布进行过滤;
    步骤(1)中所述的将滤液离心的条件为10000g,4℃离心10min;
    步骤(1)中所述的取上清液进行离心的条件为100000g,4℃离心1h;
    步骤(1)中所述的含有蛋白酶抑制剂的提取液为蛋白酶抑制剂的终浓度是1×cocktail的提取液;
    所述的加入含有蛋白酶抑制剂的提取液悬浮沉淀,植物与含有蛋白酶抑制剂的提取液的重量体积比为1g:20μL。

    5.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(2)中的反应的体系为:50mM pH6.8的Hepes-KOH buffer,5mMMnCl2,1mM DTT,0.5%Triton X-100,0.1mM UDP-Xyl,0.5μM Xyln-AA,4μg/μL微囊体,共90μL;20℃反应30mim~6h;所述的酶失活处理为用5μL终浓度是0.017M的乙酸进行酶失活处理5min。

    6.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(2)中所述的离心的条件为3000g离心3min;
    步骤(2)中所述的过滤通过0.22μm滤膜过滤;
    步骤(3)中所述的标准品为含有Xyl1-AA~Xyl6-AA,其终浓度均为0.1mM。

    7.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(3)和(4)中所述的高效液相色谱的色谱,其中,高效液相色谱的色谱柱为2.1mm×250mm,1.8μm的ZORBAX Eclipse XDB-C18柱,流动相:A相为50mM pH4.3的乙酸钠水溶液,B相为色谱纯乙腈;分析条件:流速为0.5mL/min,柱温为20℃,检测器:Agilent1100HPLC systems,Ex320nm,Em420nm,进样量为5μL,记录时间为42min,洗脱方式为梯度洗脱。

    8.  根据权利要求7所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    所述的梯度洗脱为:0,5min,25min,30min,35min,42min;相应的B相的体积变化为:0%,8%,20%,40%,100%,0%。

    9.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(4)中所述的进行酶失活处理的条件为100℃处理3min;
    步骤(4)中所述的离心的条件为12000g离心5min;
    步骤(4)中所述的酶解的反应体系为50mM pH6.0的乙酸钠水溶液和9U木聚糖内切酶或0.01U木聚糖外切酶,30μL,10μL上清液,共40μL;37℃反应6h;反应产物用5μL0.1M乙酸钠水溶液处理后过0.22μm滤膜,得到酶解产物。

    10.  根据权利要求1所述的利用HPLC检测木聚糖合成中β-1,4-木糖转移酶活性的方法,其特征在于:
    步骤(5)中所述的纯化的步骤为:按体积百分比:Sep-Pak C18固相萃取小柱用含0.1%甲酸的60%乙腈洗过后,用10mL1%甲酸活化小柱,100μL加成产物和等量的水混合上柱,最后用2mL含0.1%甲酸的60%乙腈洗脱低聚木糖,得到纯化的加成产物;纯化的加成产物用氮气吹干后溶解于20μL水,取1μL和等量的MALDI基质混合,在样品板上干燥,进行MALDI-TOF-MS分析;
    所述的MALDI基质为0.2M2,5-二羟基苯甲酸,0.06M1-羟基异喹啉,体积比50%乙腈。

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    利用 HPLC 检测 聚糖 合成 转移酶 活性 方法
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