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    重庆时时彩前三走试图: 水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法和双向电泳分离方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410160031.3

    申请日:

    2014.04.21

    公开号:

    CN103951730A

    公开日:

    2014.07.30

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 1/30申请日:20140421|||公开
    IPC分类号: C07K1/30; G01N1/28; G01N27/26 主分类号: C07K1/30
    申请人: 广西大学
    发明人: 张明; 黄愉淋; 付强; 黄德伦
    地址: 530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学路100号
    优先权:
    专利代理机构: 广西南宁公平专利事务所有限责任公司 45104 代理人: 杨立华
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410160031.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.02.10|||2014.08.27|||2014.07.30

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法,该法属于裂解液提取-丙酮沉淀方法,且方法简单易行、快速可靠,结合使用组合酶有效消化和去除了睾丸肌肉组织、结缔组织等多种组织成分以及DNA等,最终将大量白色的睾丸曲精细管富集出来,获得的曲精细管较纯且不含其它杂质,提取的总蛋白质量较好,适合于双向电泳分析。据此,发明人通过不断摸索和优化双向电泳技术体系,从而建立了一套水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法,该法可获得质量较好、分辨率较高的双向电泳图谱,对于后续的质谱分析和蛋白鉴定具有非常重要的应用价值。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
    (1)用体积浓度75%酒精消毒水牛阴囊皮肤,切开阴囊并剥离其周围组织,取出睾丸,置于37℃生理盐水中保存并迅速带回实验室;用PBS反复冲洗3次,去掉被膜、白膜,剪取一小块睾丸实质,用镊子将组织慢慢撕开并置于15mL玻璃管中;
    (2)向步骤(1)的15mL玻璃管中加入胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ的混合酶溶液,使睾丸组织与混合酶溶液的质量体积比为1:10,置于37℃摇床上震摇2~3h,直到看到大量白色的曲精细管富集于管底时停止摇晃,轻轻倒掉上清液,用PBS溶液冲洗2~3次,将纯化后的曲精细管样品分装于1.5mL离心管中;
    (3)向步骤(2)的1.5mL离心管中加入纯化的曲精细管样品3~5倍体积的蛋白裂解液,冰浴下震摇30min至曲精细管样品充分裂解,4℃、12000g离心10min,收集上清液;(4)向步骤(3)收集的上清液中加入4倍预冷丙酮,-20℃静置2~3h或过夜,4℃、12000g离心30min,弃上清,再用预冷丙酮洗涤沉淀2~3次,室温放置10min使残余丙酮尽可能完全挥发,蛋白沉淀用水化液复溶,Bradford法测定蛋白质浓度,-80℃保存备用。

    2.  根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(2)的混合酶溶液按以下步骤配制:将胶原酶Ⅳ和DNaseⅠ用PBS进行溶解分别制成浓度1mg/mL和300μg/mL的溶液,然后按照体积比10:3混合,即得。

    3.  根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(3)的蛋白裂解液组成为7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS和1%DTT。

    4.  根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于步骤(4)的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS。

    5.  用于权利要求1所述水牛睾丸曲精细管总蛋白样品的双向电泳分离方法,其特征在于包括以下步骤:
    (5)取步骤(4)中得到的蛋白质样品350μg,选取24cm、pH4~7的IPG胶条进行第一向固相pH梯度等电聚焦,在蛋白质样品中加入2.25μL IPG Buffer和0.01g DTT,并根据蛋白质样品上样体积加入适量水化液使上样总体积达到450μL;
    (6)将步骤(5)中混合均匀的450μL上样溶液缓慢加入胶条槽中,IPG胶条胶面朝下轻轻盖住样品混合液,避免产生气泡,最后加入2~3mL Immobiline DryStrip矿物油覆盖防止溶液挥发,盖上盖子水平放置于聚焦仪上进行等电聚焦;
    (7)将步骤(6)中等电聚焦后的IPG胶条放入15mL平衡液I中,于摇床上平衡15min, 再使用等体积的平衡液II平衡15min;
    (8)将步骤(7)中平衡好的胶条转移至12.5%的SDS-PAGE凝胶顶端进行第二向垂直电泳,以恒流15mA/gel电泳15min后,增大电流至25mA/gel,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部停止电泳。

    6.  根据权利要求5所述的双向电泳分离方法,其特征在于还包括以下步骤:
    (9)步骤(8)中第二向SDS-PAGE电泳结束后,取出玻璃板,将凝胶剥离后进行硝酸银染色,染色结束后,使用Image Scanner扫描仪扫描凝胶并将图像保存,应用Image Master2D platinum软件分析图像。

    7.  根据权利要求6所述的双向电泳分离方法,其特征在于步骤(5)的水化液的组成为8mol/L尿素和2%CHAPS。

    8.  根据权利要求7所述的双向电泳分离方法,其特征在于步骤(6)中等电聚焦按以下程序进行:30V,6h、60V,6h、200V,1h、500V,1h、1000V,1h、8000V,1h、80000Vhs,10h、1000V,10h。

    9.  根据权利要求8所述的双向电泳分离方法,其特征在于步骤(7)中平衡液I的的组成为6mol/L尿素,2%SDS,1.5mol/L Tris-HCl,87%甘油,1%DTT;平衡液II的组成为6mol/L尿素,2%SDS,1.5mol/L Tris-HCl,87%甘油,4%IAA。

    关 键 词:
    水牛 睾丸 精细 蛋白 样品 制备 方法 双向 电泳 分离
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