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    重庆时时彩人工稳赚: 基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410151512.8

    申请日:

    2014.04.16

    公开号:

    CN103983622A

    公开日:

    2014.08.13

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 21/64申请公布日:20140813|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20140416|||公开
    IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
    申请人: 南昌大学
    发明人: 熊勇华; 江湖; 许杨; 郭亮; 许恒毅
    地址: 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号
    优先权:
    专利代理机构: 南昌新天下专利商标代理有限公司 36115 代理人: 施秀瑾
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410151512.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.10.24|||2014.09.10|||2014.08.13

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于分析检测领域,公开了一种基于两种量子点间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法。本发明选择绿色量子点与OTA偶联,红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联,二者混合后,由于抗原抗体特异性结合,两种量子点间距离靠近而发生能量共振转移,导致绿色量子点荧光下降,红色量子点荧光增强。当反应体系含有OTA时,游离的OTA与绿色量子点偶联的OTA共同竞争红色量子点偶联的抗体,OTA的浓度直接影响绿色量子点能量转移效率,且在一定范围内绿色量子点能量转移效率与OTA浓度对数成反比例关系。本发明方法具有检测时间短,灵敏度和准确性高,操作流程简单和检测成本低等特点。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种基于两种量子点之间能量转移的赭曲霉毒素A检测方法,其特征在于包含以下步骤:(1)分别制备绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物;(2)将绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物混合,并与梯度浓度的OTA标准品溶液在结合缓冲液中共孵育,在波长450 nm的激发光下测定绿色量子点能量转移效率;以OTA标准品溶液浓度对数值为横坐标,绿色量子点能量转移效率为纵坐标,绘制检测OTA的标准曲线;(3)将待测样品提取液、绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联物在结合缓冲液中共孵育,测定绿色量子点能量转移效率,与标准曲线比对即得到待测样品提取液中OTA含量。

    2.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述绿色量子点和红色量子点满足:绿色量子点最大发射波长介于530 nm至550 nm,表面氨基化修饰的量子点;红色量子点最大发射波长介于590 nm至620 nm,表面羧基化修饰的量子点。

    3.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(1)中绿色量子点与OTA偶联,采用NHS活化法制备OTA与绿色量子点偶联物,葡萄糖酸封闭绿色量子点表面残留的氨基位点;量子点与OTA偶联摩尔比为1:2~1:20,优选为1:10。

    4.  如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(1)中红色量子点与抗OTA单域抗体偶联,抗OTA单域抗体通过免疫羊驼后分离血清获得,采用EDC,NHSS介导将红色量子点与抗OTA的单域抗体偶联,氨基葡萄糖封闭红色量子点表面残留的羧基位点,量子点与抗OTA的单域抗体偶联摩尔比为1:1。

    5.  如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(2)绿色量子点与OTA偶联物、红色量子点与抗OTA单域抗体偶联物混合摩尔比为1:1~1:6,优选为1:5。

    6.  如权利要求3或4所述方法,使用的EDC和NHSS的物质量分别是量子点的100~500倍和50~100倍;活化时间是20~40min;偶联时将pH值调至7~8,偶联时间是20~40min;封闭剂葡萄糖酸或氨基葡萄糖的终浓度是0.1%~2%,封闭时间是0.5~1小时;封闭后调pH值至弱酸性为pH 4.5至5.5;偶联产物用高速离心方法分离出来,离心条件是4℃~10℃,12000r/min~20000r/min ,20~40min;复溶液为含有20%至30%丙三醇的0至0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。

    7.  如权利要求1所述方法,其特征在于步骤(2)结合缓冲液为含10%甲醇的0.01 M 磷酸盐缓冲液,溶液pH值为7.4,结合温度为37℃,结合时间20 分钟。

    8.  如权利要求1所述方法,其特征在于具体包括如下步骤:
    (1)试剂1即绿色量子点与OTA偶联物的制备:
    1)OTA的活化:每1mg OTA溶解于0.1mg无水四氢呋喃,加入0.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及2mg N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)于室温下避光剧烈摇动1小时,活化后4000r/min离心15min;取上清,挥发四氢呋喃,残留物溶解于0.2mL二甲基甲酰胺; 2)偶联:每在洁净的小烧杯中加入0.2mL 硼酸盐缓冲液和5μL浓度为10μM的绿色量子点,缓慢加入浓度为10μM的OTA活化物50μL,使OTA与绿色量子点偶联摩尔比为10,室温、避光下偶联1.5h; 3)封闭:加入质量浓度1%的葡萄糖酸100μL封闭45min,缓调pH至5.0; 4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用20%甘油水溶液20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的1000×试剂1母液;
    (2)试剂2即红色量子点与OTA单域抗体偶联物的制备:
    1)红色量子点活化:每在洁净小烧杯中加入0.2mL 硼酸水溶液,缓慢加入5μL浓度为10μM的红色量子点,将8μL 0.5mg/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和2μL 0.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHSS)混匀后加入,室温活化20min; 2)偶联:逐滴加入浓度为10μM的OTA单域抗体5μL,使OTA单域抗体与红色量子点偶联摩尔比为1:1,用0.1M NaOH调pH至7.4,室温偶联30min; 3)封闭:加入5%氨基葡萄糖100μL封闭45min,用0.1M 盐酸缓调pH至5.0; 4)纯化:4℃,19000r/min,离心30min,吸去上清液,沉淀部分用含有20%甘油的磷酸缓冲液(0.01mol PB,pH7.4)20μL复溶,得到的复溶液为后续实验的200×试剂2母液;
    (3)OTA浓度标准曲线的制作:每各取试剂1和试剂2母液1μL,分别用1mL和0.2mL超纯水稀释,得到试剂1和试剂2待用液;10μL试剂1与90μL试剂3(含10%甲醇的1×PBS,pH7.4)混合,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记为F;将10μL试剂1、10μL试剂2和用80μL试剂3倍比稀释的OTA溶液(0 ng/mL至5 ng/mL),37℃孵育20min后,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,得到数据记录为FN,分别代表F0,F0.01、F0.06、F0.08、F0.1、F0.3、F0.5、F1和F5,其中下标数值代表OTA溶液浓度(ng/mL);将(F-FN)/ F×100%记录为荧光能量转移效率E(%);以OTA浓度对数值为横坐标,荧光能量转移效率E(%)为纵坐标,绘制出的检测OTA浓度的标准曲线;
    (4)OTA的检测:
    1)待测样品溶液准备:每取待测样品1g,用5mL 60%甲醇水溶液震荡提取5min,5000 g离心10min,上清液经0.45μm滤器过滤,取100μL体积加入100μL 0.01M,pH7.4的2×PBS和400μL的pH7.4的1×PBS稀释,即得30倍稀释的待测样液;
    2)取80μL待测样液与10μL试剂1和10μL试剂2在37℃下孵育20min,在激发光450nm下测定绿色量子点最大发射波长下的荧光强度,计算待测物的E(%)值,代入OTA浓度的标准曲线即得到待测样液中OTA含量。

    关 键 词:
    基于 量子 之间 能量 转移 曲霉 毒素 检测 方法
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