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    重庆时时彩任选三敲门: 口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中化学成分测定.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410249780.3

    申请日:

    2014.06.09

    公开号:

    CN103983750A

    公开日:

    2014.08.13

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利权质押合同登记的生效IPC(主分类):G01N 33/15登记号:2018990000887登记生效日:20180926出质人:贵州威门药业股份有限公司质权人:中国农业银行股份有限公司贵阳分行发明名称:口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中化学成分测定申请日:20140609授权公告日:20150513|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/15申请日:20140609|||公开
    IPC分类号: G01N33/15; G01N30/88 主分类号: G01N33/15
    申请人: 贵州威门药业股份有限公司
    发明人: 周欣; 龚小见; 陈华国; 马风伟; 赵杨; 梁斌; 杨槐; 张丽艳
    地址: 550018 贵州省贵阳市乌当区高新路23号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410249780.3

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2018.10.23|||2015.05.13|||2014.09.10|||2014.08.13

    法律状态类型:

    专利权质押合同登记的生效、变更及注销|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中两种成分的确定及其含量测定方法,含量测定方法是采用高效液相色谱质谱联用检测方法,在所建立的检测方法下对口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分没食子酸和原儿茶酸进行含量测定。本发明含量测定方法的精密度高,重现性好,稳定性好,测定结果准确,可对有效评价热淋清颗粒中的没食子酸和原儿茶酸在生物体内的排泄情况。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  大鼠口服热淋清颗粒后尿液和粪便中两种成分的测定方法,其包括以下步骤:
    (1)尿液测试样品的制备:
    (a)取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg;
    (b)分别在0~48h采集大鼠尿液,记录尿量,将尿液样品3000~5000r/min转速离心5~30min后,取上层液转移至新空白EP管中;
    (c)加入内标岩白菜素母液10μL,然后用乙酸乙酯萃取,尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4~1:8,萃取时间2~5min,涡旋混匀30~60s后,在0~10℃恒温下以10000~12000r/min离心5~15min;
    (d)上层液转移至新空白EP管中,于30~50℃氮气流吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀30~60s后,在0~10℃恒温下以10000~12000r/min离心5~15min,取上清液即为尿液供试品溶液;
    (e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白尿液进行处理,得到尿液空白溶液;
    (2)粪便测试样品的制备:
    (a)取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给予大鼠(体重230-270g)热淋清颗粒水溶液10ml/kg;
    (b)分别收集48h内大鼠粪便,将大鼠粪便烘干,称重,取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液,将样品3000~5000r/min转速离心5~30min后,取上层液转移至新空白EP管中;
    (c)加入内标岩白菜素母液10μL,然后用乙酸乙酯萃取,尿液与乙酸乙酯的体积比为1:4~1:8,萃取时间2~5min,涡旋混匀30~60s后,在0~10℃恒温下以10000~12000r/min离心5~15min;
    (d)上层液转移至新空白EP管中,于30~50℃氮气流吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀30~60s后,在0~10℃恒温下以10000~12000r/min离心5~15min,取上清液即为粪便供试品溶液;
    (e)按步骤(b)至步骤(d)的方法对未服用药物的空白粪便进行处理,得到粪便空白溶液;
    (f)对照品溶液的制备:分别精密称取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~1mg,各自加纯甲醇定容至10ml,即得三种母液,分别取三种母液适量至同一量瓶中,加甲醇稀释至所需浓度,即为对照品溶液;
    (3)LC-MS/MS分析的色谱条件和检测条件:
    色谱柱为反相色谱柱,酸性乙腈或酸性甲醇:酸性水=0~20:80~100(体积比)为流动相,流速为0.1~0.5mL/min,柱温为20~40℃,离子化方式为电喷雾条件,负模式监测,喷雾电压为2000~3000V,雾化温度为300~500℃,鞘气压力为30~50mTorr,辅助气压力为5~15mTorr,毛细管温度为200~400℃(所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中,酸的浓度为0.05%~0.5%,所述酸选自甲酸、乙酸或其组合);
    (4)测定法:分别精密吸取对照品溶液、尿液空白溶液、粪便空白溶液、尿液供试品溶液、粪便供试品溶液5~20μL,注入高效液相色谱-质谱联用仪,测定,即得。

    2.  根据权利要求1的方法,其中:
    步骤(1)之(a)中,通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4ml;
    步骤(2)之(a)中,通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4ml;
    步骤(1)之(b)中,分别在2h,12h,24h后采集大鼠尿液;
    步骤(2)之(b)中,分别在24h、48h后采集大鼠粪便;
    步骤(1)之(b)中,将尿液样品于低速离心机4000r/min离心10min;和/或
    步骤(2)之(b)中,将尿液样品于低速离心机4000r/min离心10min。

    3.  根据权利要求1的方法,其中:
    步骤(1)之(c)中,所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸,例如添加0.5%~1%酸;例如,所述的酸选自甲酸、乙酸及其组合;例如,所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸;
    步骤(2)之(c)中,所述乙酸乙酯中添加0.2%~2%酸,例如添加0.5%~1%酸;例如,所述的酸选自甲酸、乙酸及其组合;例如,所述的酸是甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸;
    步骤(1)之(c)中,尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6,萃取时间4min;
    步骤(2)之(c)中,尿液与乙酸乙酯(优选地该乙酸乙酯中包含0.75%的甲酸和乙酸二者以体积比2:1的混合酸)的体积比为1:6,萃取时间4min;
    步骤(1)之(c)中,萃取后涡旋均匀30s后4℃恒温离心,转速12000r/min,离心10min;和/或
    步骤(2)之(c)中,萃取后涡旋均匀30s后4℃恒温离心,转速12000r/min,离心10min。

    4.  根据权利要求1的方法,其中:
    口服热淋清颗粒后大鼠尿液和粪便中检测的两种成分是没食子酸和原儿茶酸;
    步骤(1)之(d)中,将上层清液于氮吹仪于40℃吹干;
    步骤(2)之(d)中,将上层清液于氮吹仪于40℃吹干;
    步骤(1)之(d)中,残留物用100μl流动相溶解,涡旋混匀60s后12000r/min,4℃恒温,离心10min;和/或
    步骤(2)之(d)中,残留物用100μl流动相溶解,涡旋混匀60s后12000r/min,4℃恒温,离心10min。

    5.  根据权利要求1的方法,其中:
    步骤(3)中,色谱柱为C18色谱柱;
    步骤(3)中,所述的酸性乙腈或酸性甲醇或酸性水中,酸的浓度为0.1%;
    步骤(3)中,流速为0.2ml/min,柱温为30℃;
    步骤(3)中,离子化方式为电喷雾条件,负模式监测,喷雾电压为2500V,雾化温度为350℃,鞘气压力为40mTorr,辅助气压力为10mTorr,毛细管温度为300℃;
    步骤(3)中,使用梯度洗脱,洗脱液的变化为:开始时,酸性乙腈相2%,酸性水溶液相98%,稳定3min;接着至第10min时,酸性乙腈相线性增加至10%,酸性水溶液相90%;第10.1min时,酸性乙腈相改为2%,酸性水溶液相98%,稳定7min;
    步骤(4)中,各溶液的进样量均为10μL。

    6.  根据权利要求1的方法,其中:
    尿液供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒0.5~4g用5~10倍水溶解,配成水溶液,通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4mL,分别在2h,12h,24h后采集大鼠尿液,将 尿液于低速离心机4000r/min离心10min后,取上层液体转移至新的空白EP管中,用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min,涡旋均匀30s后4℃恒温离心,转速12000r/min,离心10min,重复3次,合并上清液,将上层清液于氮吹仪于40℃吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀60s后12000r/min,4℃恒温,离心10min后取10μL进样,空白尿液按同样方法处理;和/或
    粪便供试品溶液包括以下操作步骤:取热淋清颗粒0.5~4g用5~10倍水溶解,配成水溶液,通过灌胃给药方式给大鼠(230~270g)热淋清颗粒水溶液2~4mL,分别在24h、48h采集大鼠粪便,将大鼠粪便烘干,称重,取0.5g样品加入10倍量水制成混悬液,于低速离心机4000r/min离心10min后,取上层液体转移至新的空白EP管中,用乙酸乙酯按体积比1:4萃取5min,涡旋均匀30s后4℃恒温离心,转速12000r/min,离心10min,重复3次,合并上清液,将上层清液于氮吹仪于40℃吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀60s后12000r/min,4℃恒温,离心10min后取10μL进样,空白粪便按同样方法处理。

    7.  根据权利要求1的方法,其中:
    处理好的样品,采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行:
    色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱,酸性(甲酸0.1%)乙腈:酸性(甲酸0.1%)水=0~20:80~100(体积比)为流动相,梯度洗脱,流速为0.2mL·min-1,柱温为30℃,离子化方式为电喷雾条件,负模式监测,喷雾电压为2500V,雾化温度为350℃,鞘气压力为40mTorr,辅助气压力为10mTorr,毛细管温度为300℃;
    对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~1mg,精密称定,加纯甲醇定容至10mL,即得母液,工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度;
    测定法:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5μL,注入高效液相色谱-质谱联用仪,测定,即得;
    前述流动相梯度洗脱过程中,洗脱液的变化为:开始时,甲酸乙腈相2%,甲酸水溶液相98%,稳定3min;第10min时,甲酸乙腈相10%,甲酸水溶液相90%,第10.1min时,甲酸乙腈相2%,甲酸水溶液相98%,稳定7min;
    前述质谱检测为多反应监测模式,反应离子对及形成稳定子离子所需碰撞能量分别为:没食子酸169.181→125.268,补偿电压(Tube Lens Offset)71V,碰撞压力(Collision Pressure)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV,原儿茶酸152.918→109.244,补偿电压(Tube Lens Offset)75V,碰撞压力(Collision Pressure)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)13eV,内标326.922→192.167,补偿电压(Tube Lens Offset)100V,碰撞压力(Collision Pressure)1.5mTorr,碰撞能量(Collision Energy)22eV。

    8.  根据权利要求1的方法,其中:
    取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg,分别在0~48h,采集大鼠尿液,将大鼠尿液样品3000~5000r/min转速离心5~30min后,取上层液体转移至新空白EP管中,加入内标岩白菜素10μL,然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取,萃取时间2~5min,涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min,0~10℃恒温,离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中,重复萃取1~3次,合并乙酸乙酯部分有机相,于30~50℃氮气流吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min,0~10℃恒温,离心5~15min后取5~20μL进样, 空白尿液按同样方法处理;
    取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg,分别收集48h大鼠粪便,将大鼠粪便烘干,称重,取0.1~1g样品加入5~10倍量水制成混悬液,3000~5000r/min转速离心5~30min后,取上层液体转移至新空白EP管中,加入内标岩白菜素10μL,然后按1:4~1:8体积比乙酸乙酯萃取,萃取时间2~5min,涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min,0~10℃恒温,离心5~15min,上层液转移至新空白EP管中,重复萃取1~3次,合并乙酸乙酯部分有机相,于30~50℃氮气流吹干,残留物用100μL流动相溶解,涡旋混匀30~60s后10000~12000r/min,0~10℃恒温,离心5~15min后取5~20μL进样,空白粪便按同样方法处理;
    以上处理好的样品,采用液相色谱-质谱联用仪按以下条件进行:
    色谱条件和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱,酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5%)乙腈或甲醇:酸性(甲酸或乙酸0.05%~0.5%)水=0~20:80~100(体积比)为流动相,梯度洗脱,流速为0.1~0.5 mL/min,柱温为20~40℃,离子化方式为电喷雾条件,负模式监测,喷雾电压为2000~3000V,雾化温度为300~500℃,鞘气压力为30~50mTorr,辅助气压力为5~15mTorr,毛细管温度为200~400℃;
    对照品溶液的制备:取没食子酸对照品、原儿茶酸对照品、岩白菜素对照品0.01~1mg,精密称定,加纯甲醇定容至10mL,即得母液,工作液为母液加甲醇稀释至所需浓度。

    9.  根据权利要求1的方法,其中:
    取热淋清颗粒0.5~4g,加5~10倍水溶解,通过灌胃给药方式给大鼠(230-270g)热淋清颗粒水溶液10mL/kg,分别在0~48h采集大鼠尿液,记录尿量,将尿液样品4000r/min转速离心10min后,取上层液体转移至新空白EP管中,加入内标岩白菜素10μL,然后按1: 4体积比用乙酸乙酯萃取,萃取时间5min,涡旋混匀后12000r/min离心5min,上层液转移至新空白EP管中,重复3次,于40℃氮气流吹干,残留物用100μL流动相溶解,4℃恒温,12000r/min离心10min后取10μL进样,空白尿液按同样方法处理;
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    10.  根据权利要求1的方法,其中:
    所述色谱柱规格为2.1×150mm,填料粒径为1.7μm;
    以甲酸0.1%乙腈A:甲酸0.1%水B为流动相,按以下条件梯度洗脱:0~3min2%A,3.0~3.1min2%A—10%A,3.1~10.0min10%A,10.0~10.1min10%-2%A,10.1~17.0min2%A;
    所述质谱喷雾电压为2500V,雾化温度为350℃,鞘气压力为40mTorr,辅助气压力为10mTorr,毛细管温度为350℃;
    所述质谱检测为多反应监测模式,反应离子对分别为:没食子酸169.181→125.268,原儿茶酸152.918→109.244,内标326.922→192.167。

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