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鸦葱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱.pdf
(10)申请公布号 CN 103901152 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103901152 A (21)申请号 201410168988.2 (22)申请日 2014.04.24 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长春市前进大街 2699 号 (72)发明人 王广树 张爽 谢扬 周小平 孙薇 王艳 杨锦竹 张沐新 刘银燕 (74)专利代理机构 长春市四环专利事务所 ( 普 通合伙 ) 22103 代理人 郭耀辉 (54) 发明名称 鸦葱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 (57) 摘要 本发明提供了一种鸦葱指纹图谱的建立方 法， 具体步骤为将鸦葱制备成供试品溶液， 在一定 的条件下经过高效液相色谱仪的分离检测， 获得 鸦葱的指纹图谱， 本发明同时提供了由该方法得 到的鸦葱的标准指纹图谱， 该图谱能够为鸦葱鉴 别和内在的质量控制提供可靠的依据， 本发明操 作简便， 稳定性高、 重现性好、 特征峰多， 能全面、 准确地评价鸦葱药材的质量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103901152 A CN 103901152 A 1/2 页 2 1. 鸦葱指纹图谱的建立方法， 其特征在于将鸦葱制成供试品溶液， 经高效液相色谱仪 分离检测， 获得鸦葱的指纹图谱 ； 所述方法包括如下步骤 ： 1) 供试品溶液的制备 ： 取鸦葱药材粗粉， 以乙醇溶液超声提取， 过滤， 取滤液适量采用 微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 2) 参照物溶液的制备 ： 取鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃 葡萄糖碳苷 )、 鸦葱黄酮苷 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 ) 对照品， 溶于甲醇溶液作为参照物溶液 ； 3) 制作鸦葱指纹图谱 ： 分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液， 经高效液相色谱仪分 离检测， 其中， 流动相的组成为 14.6mmol·L-1的磷酸溶液 - 乙腈 ； 采用梯度洗脱 ； 得到鸦葱 指纹图谱。 2. 如权利要求 1 所述的鸦葱指纹图谱的建立方法， 其特征在于所述供试溶液按如下 步骤制备 ： 精密称取鸦葱药材粗粉 2.00g， 置具塞容器中， 精密加入 70％乙醇 50ml， 密塞后 称定重量， 超声提取 1h， 静置， 放冷， 70％乙醇补足缺失重量， 摇匀， 滤过， 取滤液适量采用 0.45μm 微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液。 3. 如权利要求 1 所述的鸦葱指纹图谱的建立方法， 其特征在于所述的高效液相色谱仪 分离检测条件为 ： 色谱柱为 ： Phenomenex Gemini5u C18110A(250×4.60mm5micron) 柱 ； 流 动相为14.6mmol· L-1的磷酸-乙腈 ； 采用梯度洗脱 ： 00min→15min→30min→50min→70m in → 75min， 乙腈 3％→ 15％→ 18％→ 30％→ 40％→ 66％ ； 流速 1ml·min-1； 检测波长为 273nm ； 进样量 10μl ； 柱温 25℃。 4. 如权利要求 1 所述的鸦葱指纹图谱的建立方法， 其特征在于所述的参照物溶液按 如下步骤制备 ： 取鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳 苷 )、 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 ) 对照品适量， 精密称定， 加甲 醇溶解并稀释成每 1ml 中黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳 苷)0.1mg、 D(5,7,4′-三羟基黄酮-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)0.1mg的混合溶液， 摇匀。 5. 由权利 1 至 4 中任一项所述的鸦葱指纹图谱的建立方法得到的鸦葱标准指纹图谱， 其特征在于 ： 图谱总长度为 75min， 有 13 个特征峰， 第 7、 10 号色谱峰分别为对应鸦葱黄酮 苷A(5,7,3′,4′-四羟基黄酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)、 鸦葱黄酮苷D(5,7,4′-三 羟基黄酮-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)， 7号峰平均保留时间为31.65min， 以7号峰为参照 峰， 计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积， 平均相对保留时间和相对峰面积如下 ： 1 号峰， 平均相对保留时间为 0.6916， 平均相对峰面积为 1.1849 ； 2 号峰， 平均相对保留时间为 0.7769， 平均相对峰面积为 0.2001 ； 3 号峰， 平均相对保留时间为 0.8470， 平均相对峰面积为 0.3560 ； 4 号峰， 平均相对保留时间为 0.9215， 平均相对峰面积为 0.3585 ； 5 号峰， 平均相对保留时间为 0.9515， 平均相对峰面积为 1.2582 ； 6 号峰， 平均相对保留时间为 0.9636， 平均相对峰面积为 0.3097 ； 7 号峰， 平均相对保留时间为 1.0000， 平均相对峰面积为 1.0000 ； 8 号峰， 平均相对保留时间为 1.0439， 平均相对峰面积为 0.3555 ； 9 号峰， 平均相对保留时间为 1.1185， 平均相对峰面积为 0.0643 ； 权 利 要 求 书 CN 103901152 A 2 2/2 页 3 10 号峰， 平均相对保留时间为 1.1712， 平均相对峰面积为 0.6158 ； 11 号峰， 平均相对保留时间为 1.4673， 平均相对峰面积为 0.2808 ； 12 号峰， 平均相对保留时间为 1.5434， 平均相对峰面积为 0.1145 ； 13 号峰， 平均相对保留时间为 1.6789， 平均相对峰面积为 0.1384。 权 利 要 求 书 CN 103901152 A 3 1/4 页 4 鸦葱指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱 技术领域 [0001] 本发明涉及一种鸦葱指纹图谱的建立方法， 以及由该方法所得的鸦葱标准指纹图 谱， 属于中药分析领域。 背景技术 [0002] 鸦葱为菊科植物 Scorzonera austriaca Wild 的干燥全草。五月～六月采挖、 晒干。本品全长 10 ～ 40 厘米 ； 根粗壮， 倒圆锥状， 直径约 0.3 ～ 3 厘米 ； 茎多数， 簇生于 根颈顶端， 不分枝， 光滑无毛， 茎基被稠密褐色的纤维状撕裂的鞘状残遗 ； 基生叶广披针形 至长圆状卵形， 长 20 ～ 30(-40) 厘米， 宽 1.2 ～ 3.5(-5) 厘米， 边缘平展， 基部鞘状扩大， 鞘内被稠密的棉毛， 基部边缘有棉毛 ； 茎生叶少数， 1 ～ 3 枚， 鳞片状 ； 头状花序单生茎顶， 瘦果无毛。鸦葱作为传统中药， 全草入药， 具有清热解毒、 消炎、 通乳的功效， 主治痈疮、 淋 病、 妇女带下、 乳腺炎等症。鸦葱也是一味传统藏药 ( 藏名 : 巴多拉 )。关于鸦葱化学成 分的研究除本研究室外， 只有武全香等报道了鸦葱中倍半萜类和三萜类化学成分的研究 ( 武全香 , 李娟 , 祝英 . 藏药鸦葱化学成分的研究 [J]. 有机化学 ,2003,23(11) ： 446)， Ting-Fu Jiang 等报道了香豆素类化学成分的研究 (T.F.Jiang et.al.Determination of kavalactones and flavonoid glycoside in Scorzonera austriaca by capillary zone electrophoresis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis， 2007,43(3) ： 854-858)。本研究室对鸦葱中黄酮类化学成分进行了研究 ( 李泉妙 , 王广树 . 鸦葱中黄酮苷类成分的提取分离与结构鉴定 [J]. 吉林大学学报 ( 医学 版),2010,36(1):10-12)、 (刘欣， 张子龙， 王广树等. 鸦葱中黄酮成分的提取分离及结构鉴 定 [J]. 吉林大学学报 ( 医学版 )， 2012， 38(3) ： 595-597)、 ( 何琭 . 鸦葱中黄酮类化合物的 研究 [D]. 吉林大学研究生学位论文 ,2012)、 ( 李泉妙 . 鸦葱中化学成分的研究及保肝活性 的初探 [D]. 吉林大学研究生学位论文 ,2008)。迄今为止， 本研究室从鸦葱中分得了 10 余 种黄酮类化合物， 对总黄酮提取物进行了生物活性研究， 发现鸦葱总黄酮具有治疗肝炎和 保肝作用， 于2013年获得了中国发明专利(一种鸦葱总提取物及其在制备治疗肝炎或保肝 药物中的用途， 专利号 ZL201110255235.1， 授权公告日 2013-06-04)。本研究室正在进行以 鸦葱为原料， 以鸦葱总黄酮为有效部位， 以治疗病毒性肝炎为目标的新药创制的研究， 并获 得了国家科技重大专项的资助 ( 国家科技重大专项 “重大新药创制” ， 治疗病毒性肝炎创新 药物 -YCZT 的研究， 2013ZX09103002-007)。 [0003] 中药指纹图谱技术是目前国内外公认的用来控制中药、 天然药物或中药材整体质 量最有效、 最准确、 最直接的手段， 是一种综合的、 宏观的和可量化的鉴别方法， 其基本属性 是 “整体性” 和 “模糊性” 。 “整体性” 是指完整地比较色谱的特征 “面貌” ；“模糊性” 强调的 是对照物与待测样品指纹图谱的相似性。 运用指纹图谱技术可以鉴别中药材和中成药的真 伪， 评价原料药材、 半成品和成品质量的均一性和稳定性。 但是， 迄今为止， 有关鸦葱药材的 指纹图谱还未见报道。 [0004] 鉴于以上不足， 有必要发明一种建立鸦葱指纹图谱的新方法， 使之既能操作简便、 说 明 书 CN 103901152 A 4 2/4 页 5 稳定和重现性好， 又能全面、 准确地评价鸦葱药材的质量， 从而既能加强对鸦葱药材真伪、 产地的鉴别， 又能对鸦葱药材的质量和品质进行全面评价和控制， 弥补了现有鸦葱质量药 材控制方法的不足， 使其更加完善和科学。 发明内容 [0005] 本发明的目的是针对现有鸦葱药材质量控制方法的不足而提供一种鸦葱指纹图 谱的建立方法， 其特点是将鸦葱制备成供试品溶液后， 经过高效液相色谱仪分离检测， 获得 鸦葱的指纹图谱， 从而为鸦葱的鉴别和内在的质量控制提供可靠的依据。 [0006] 本发明一种鸦葱指纹图谱的建立方法具体包括如下步骤 ： [0007] 1) 供试品溶液的制备 ： 取鸦葱药材粗粉， 以乙醇溶液超声提取， 过滤， 取滤 液适量采用微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 2) 参照物溶液的制备 ： 取鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′,4′-四羟基黄酮-6-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)、 鸦葱黄酮苷D(5,7,4′-三羟 基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 ) 对照品， 溶于甲醇溶液作为参照物溶液 ； [0008] 3) 制作鸦葱指纹图谱 ： 分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液， 经高效液相色谱 仪分离检测， 其中， 流动相的组成为 14.6mmol·L-1的磷酸溶液 - 乙腈 ； 采用梯度洗脱 ； 得到 鸦葱指纹图谱。 [0009] 其中， 供试品溶液按如下步骤制备 ： 精密称取鸦葱药材粗粉 2.00g， 置具塞容器 中， 精密加入 70％乙醇 50ml， 密塞后称定重量， 超声提取 1h， 静置， 放冷， 70％乙醇补足缺失 重量， 摇匀， 滤过。取滤液适量采用 0.45μm 微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液。 [0010] 对照物溶液按如下步骤制备 ： 取鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄 酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )、 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 ) 对照品适量， 精密称定， 加甲醇溶解并稀释成每 1ml 中黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄 酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )0.1mg、 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖 碳苷 )0.1mg 的混合溶液， 摇匀。 [0011] 色谱条件为 ： 色谱柱为 ： Phenomenex Gemini5u C18110A(250×4.60mm5micron) 柱 ； 流动相为14.6mmol· L-1的磷酸-乙腈 ； 采用梯度洗脱 ： 00min→15min→30min→50min → 70min → 75min， 乙腈 3％→ 15％→ 18％→ 30％→ 40％→ 66％； 流速 1ml· min-1 ； 检测波 长为 273nm ； 进样量 10μl ； 柱温 25℃。 [0012] 本发明还提供由上述鸦葱指纹图谱的建立方法得到的鸦葱标准指纹图谱。 [0013] 将 12 份鸦葱样品按上述方法制备成供试品溶液， 在高效液相色谱仪上分离检测， 使用国家药典委员会的 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 版》 软件分析， 得到鸦葱 标准指纹图谱。 [0014] 所述标准指纹图谱有 13 个特征峰， 第 7、 10 号色谱峰分别为对应鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )、 鸦葱黄酮苷 D(5,7,4′ - 三 羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )， 图谱总长度为 75min， 7 号峰平均保留时间为 31.65min， 以 7 号峰为参照峰， 计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积， 平均相对保留时 间和相对峰面积如下 ： [0015] 1 号峰， 平均相对保留时间为 0.6916， 平均相对峰面积为 1.1849 ； [0016] 2 号峰， 平均相对保留时间为 0.7769， 平均相对峰面积为 0.2001 ； 说 明 书 CN 103901152 A 5 3/4 页 6 [0017] 3 号峰， 平均相对保留时间为 0.8470， 平均相对峰面积为 0.3560 ； [0018] 4 号峰， 平均相对保留时间为 0.9215， 平均相对峰面积为 0.3585 ； [0019] 5 号峰， 平均相对保留时间为 0.9515， 平均相对峰面积为 1.2582 ； [0020] 6 号峰， 平均相对保留时间为 0.9636， 平均相对峰面积为 0.3097 ； [0021] 7 号峰， 平均相对保留时间为 1.0000， 平均相对峰面积为 1.0000 ； [0022] 8 号峰， 平均相对保留时间为 1.0439， 平均相对峰面积为 0.3555 ； [0023] 9 号峰， 平均相对保留时间为 1.1185， 平均相对峰面积为 0.0643 ； [0024] 10 号峰， 平均相对保留时间为 1.1712， 平均相对峰面积为 0.6158 ； [0025] 11 号峰， 平均相对保留时间为 1.4673， 平均相对峰面积为 0.2808 ； [0026] 12 号峰， 平均相对保留时间为 1.5434， 平均相对峰面积为 0.1145 ； [0027] 13 号峰， 平均相对保留时间为 1.6789， 平均相对峰面积为 0.1384。 [0028] 本发明所述鸦葱是菊科植物 Scorzonera austriaca Wild 的干燥全草。 [0029] 本发明鸦葱指纹图谱的建立方法及其特征指纹图谱有如下显著的优点 ： [0030] (1) 供试品溶液的制备方法简便， 易于操作， 试验周期短， 制作的供试品溶液杂质 少， 不易污染色谱柱， 所得到的色谱图杂质信号干扰少 ； [0031] (2) 色谱条件容易实现， 乙腈系统柱压较低， 有利于系统的稳定。 [0032] (3) 本发明以 70％乙醇提取鸦葱中的成分， 能最大程度提取中的黄酮类小分子药 效成分， 并在此基础上建立鸦葱的指纹图谱方法， 使其对鸦葱的质量控制更具针对性和实 用性 ； [0033] (4) 本发明色谱条件下的各特征色谱峰均实现了基线分离， 不仅能从整体上对鸦 葱进行模糊识别， 也可对比参照物色谱对鸦葱进行清晰鉴别及鸦葱的多组分定量分析 ； [0034] (5) 本发明方法稳定性高、 重现性好、 特征峰多， 能全面、 准确地评价鸦葱药材的质 量， 适于对鸦葱真伪、 产地和品质的鉴别与控制。 附图说明 [0035] 图 1 是鸦葱特征指纹图谱， 图中从左到右分别是第 1 至 13 号特征峰。 [0036] 图 2 是鸦葱的参照物图谱， 图中从左到右分别对应图 1 中的第 7、 10 号色谱峰， 依 次分别为鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )、 鸦葱黄 酮苷 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )。 具体实施方式 [0037] 实施例 1 ： 鸦葱指纹图谱的建立 [0038] 1) 药品、 试剂和仪器 [0039] 鸦葱药材共12批， 均采集于吉林省伊通 ； 使用Shimadzu LC-10AT VP Plus高效液 相色谱仪 ； 试剂为色谱纯或分析纯 ； [0040] 2) 供试品溶液的制备 [0041] 精密称取鸦葱药材粗粉 2.00g， 置具塞容器中， 精密加入 70％乙醇 50ml， 密塞后 称定重量， 超声提取 1h， 静置， 放冷， 70％乙醇补足缺失重量， 摇匀， 滤过。取滤液适量采用 0.45μm 微孔滤膜滤过， 作为供试品溶液 ； 说 明 书 CN 103901152 A 6 4/4 页 7 [0042] 3) 参照物溶液的制备 [0043] 取鸦葱黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )、 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 ) 对照品适量， 精密称定， 加甲醇 溶解并稀释成每 1ml 中黄酮苷 A(5,7,3′ ,4′ - 四羟基黄酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳 苷)0.1mg、 D(5,7,4′-三羟基黄酮-8-C-β-D-吡喃葡萄糖碳苷)0.1mg的混合溶液， 摇匀 ； [0044] 4) 制作鸦葱指纹图谱 [0045] 色谱柱为 Phenomenex Gemini5u C18110A(250×4.60mm5micron) 柱 ； 流动相为 14.6mmol· L-1的磷酸-乙腈 ； 采用梯度洗脱 ： 00min→15min→30min→50min→70min→75mi n， 乙腈 3％→ 15％→ 18％→ 30％→ 40％→ 66％； 流速 1ml·min-1 ； 检测波长为 273nm ； 进 样量10μl ； 柱温25℃。 分别精密吸取供试液溶液和参照物溶液， 在以上色谱条件下经高效 液相色谱仪分离检测， 得到鸦葱指纹图谱， 见图 1 ； [0046] 按相同色谱条件得参照物的图谱， 见图 2。 [0047] 实施例 2 ： 鸦葱标准指纹图谱 [0048] 鸦葱药材共 12 批， 均采集于吉林省伊通。按本发明实施例 1 所述方法得到各批次 鸦葱指纹图谱， 使用国家药典委员会的 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 版》 软件 分析， 得到鸦葱标准指纹图谱， 确定了 13 个共有特征峰， 见图 1。 [0049] 第 7、 10 号 色 谱 峰 分 别 为 对 应 鸦 葱 黄 酮 苷 A(5,7,3 ′ ,4 ′ - 四 羟 基 黄 酮 -6-C-β-D- 吡喃葡萄糖碳苷 )、 鸦葱黄酮苷 D(5,7,4′ - 三羟基黄酮 -8-C-β-D- 吡喃葡 萄糖碳苷 )， 图谱总长度为 75min， 7 号峰平均保留时间为 31.65min， 以 7 号峰为参照峰， 计 算特征峰的相对保留时间和相对峰面积， 平均相对保留时间和相对峰面积如下 ： [0050] 1 号峰， 平均相对保留时间为 0.6916， 平均相对峰面积为 1.1849 ； [0051] 2 号峰， 平均相对保留时间为 0.7769， 平均相对峰面积为 0.2001 ； [0052] 3 号峰， 平均相对保留时间为 0.8470， 平均相对峰面积为 0.3560 ； [0053] 4 号峰， 平均相对保留时间为 0.9215， 平均相对峰面积为 0.3585 ； [0054] 5 号峰， 平均相对保留时间为 0.9515， 平均相对峰面积为 1.2582 ； [0055] 6 号峰， 平均相对保留时间为 0.9636， 平均相对峰面积为 0.3097 ； [0056] 7 号峰， 平均相对保留时间为 1.0000， 平均相对峰面积为 1.0000 ； [0057] 8 号峰， 平均相对保留时间为 1.0439， 平均相对峰面积为 0.3555 ； [0058] 9 号峰， 平均相对保留时间为 1.1185， 平均相对峰面积为 0.0643 ； [0059] 10 号峰， 平均相对保留时间为 1.1712， 平均相对峰面积为 0.6158 ； [0060] 11 号峰， 平均相对保留时间为 1.4673， 平均相对峰面积为 0.2808 ； [0061] 12 号峰， 平均相对保留时间为 1.5434， 平均相对峰面积为 0.1145 ； [0062] 13 号峰， 平均相对保留时间为 1.6789， 平均相对峰面积为 0.1384。 说 明 书 CN 103901152 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103901152 A 8