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    重庆时时彩平台lg: 采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器.pdf

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    采用 静电 纺丝 法制 纳米 纤维 生物 传感器
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410157515.2

    申请日:

    2014.04.17

    公开号:

    CN103901088A

    公开日:

    2014.07.02

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/327申请日:20140417|||公开
    IPC分类号: G01N27/327 主分类号: G01N27/327
    申请人: 扬州大学
    发明人: 薛怀国; 侯玉婷; 刘龙杰; 李丹阳; 虞惠艳
    地址: 225009 江苏省扬州市大学南路88号
    优先权:
    专利代理机构: 南京中新达专利代理有限公司 32226 代理人: 孙鸥;朱杰
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410157515.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.08.31|||2014.07.30|||2014.07.02

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于采用静电纺丝法制备纤维膜生物传感器。本发明将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N,N-二甲基甲酰胺溶液作为外层的纺丝溶液,将酶配置成酶溶液作为内层纺丝溶液,一起加以高压电在电极上电纺成纤维膜,制得生物传感器。本发明克服了现有固定酶等生物活性分子的吸附、交联、共价键合、包埋等存在准确度、灵敏度、操作稳定性、使用寿命、选择性等差的缺陷。本发明生物传感器稳定性好、灵敏度高、重现性好,而所需的酶量少。由于制作方法也非常简单,所以投入市场的可能性较大。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器,适合多种酶底物的检测,可广泛用于医学、食品、环境等领域,具有较高的经济效益。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其特征在于将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N,N-二甲基甲酰胺溶液作为外层的纺丝溶液,将酶配置成酶溶液作为内层纺丝溶液,一起加以高压电在电极上电纺成纤维膜,制得生物传感器。

    2.  根据权利要求1所述的采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其特征在于丙烯腈-丙烯酸共聚物溶液的质量分数为6~15%,其粘均分子量为30000~100000,丙烯酸链段的含量为1%~5%。

    3.  根据权利要求1所述的采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其特征在于所述酶为血红蛋白酶、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。

    4.  根据权利要求1所述的采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其特征在于同轴纺丝时,外层为可纺聚合物。

    说明书

    说明书采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器
    技术领域
    本发明属于以高分子聚合物为外层,包裹内层酶活性分子通过电纺纳米纤维膜制备生物传感器的方法,特别涉及采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器。
    背景技术
    生物传感器的基本原理是基于生物活性物质具有优异的分子识别功能,对测定物质具有较高的选择性和灵敏度;生物活性物质构成分子识别部分,被识别的信息再经过信息转换部分以可检测的信号输出。生物传感器核心主要由分子识别和信息转换两部分组成,其中分子识别部分是指固定化的酶、微生物、抗体、细胞或组织等,它是生物传感器的核心。因此生物活性分子的固定化是生物传感器制备的关键步骤。
    在本发明之前,现有的固定酶等生物活性分子的方法主要有吸附、交联、共价键合、包埋等,但这些方法在准确度、灵敏度、操作稳定性、使用寿命、选择性等都方面存在着不足和局限。
    发明内容
    本发明的目的就是克服上述缺陷,提供采用静电纺丝法制备纤维膜生物传感器。
    本发明的技术方案是:
    采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其主要技术特征在于将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N,N-二甲基甲酰胺溶液作为外层的纺丝溶液,将酶配置成酶溶液作为内层纺丝溶液,一起加以高压电在电极上电纺成纤维膜,制得生物传感器。
    所述丙烯腈-丙烯酸共聚物溶液的质量分数为6~15%,其粘均分子量为30000~100000,丙烯酸链段的含量为1%~5%。
    所述酶为血红蛋白酶、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸 氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
    所述同轴纺丝时,外层为可纺聚合物。
    采用本发明方法制备出的生物传感器稳定性好、灵敏度高、重现性好,而所需的酶量少。由于制作方法也非常简单,所以投入市场的可能性较大。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器,适合多种酶底物的检测,可广泛用于医学、食品、环境等领域,具有较高的经济效益。
    附图说明
    图1为静电纺丝法制备的纳米纤维膜的扫描电镜图,其中A为同轴静电纺丝法制备的Hb/P(AN-co-AA)纤维膜扫描电镜图,B为A图的局部放大图。(因为同轴静电纺丝法制备的不同酶的含有生物活性的纳米纤维形貌基本一致,直径也相仿,故而只挑选Hb/P(AN-co-AA)纤维膜的扫描电镜作为代表。)
    图2为静电纺丝法制备的Hb/P(AN-co-AA)纤维膜电极在磷酸缓冲溶液中对H2O2溶液反应的时间电流曲线图。
    图3为Hb/P(AN-co-AA)纤维膜电极对H2O2浓度变化的直线部分校正曲线拟合图。
    图4为Hb/P(AN-co-AA)纤维膜电极的表观米氏常数的线性范围的直线拟合图。
    图5为静电纺丝法制备的PPO/P(AN-co-AA)纤维膜电极在磷酸缓冲溶液中对儿茶酚溶液反应的时间电流曲线图。
    图6为PPO/P(AN-co-AA)纤维膜电极对儿茶酚浓度变化的直线部分校正曲线拟合图。
    图7为PPO/P(AN-co-AA)纤维膜电极的表观米氏常数的线性范围的直线拟合图。
    图8为静电纺丝法制备的GOD/P(AN-co-AA)纤维膜电极在磷酸缓冲溶液中对葡萄糖溶液反应的时间电流曲线图。
    图9为GOD/P(AN-co-AA)纤维膜电极对葡萄糖溶液浓度变化的直线部分校正曲线拟合图。
    图10为GOD/P(AN-co-AA)纤维膜电极的表观米氏常数的线性范围的直线拟合图。
    具体实施方式
    本发明的基本思路是:
    用静电纺丝法制得的纤维比传统纺丝法制得的纤维细得多,直径一般在几十纳米至几微米之间,且纳米纤维膜具有很好的力学性能、高的比表面积、高孔隙率、高吸附性。
    丙烯腈-丙烯酸聚合物有非常好的成纤能力,且因为引入羧基具有很好的生 物相容性;将酶活性分子作为内层一起电纺成膜,制备生物传感器,制备简单、增大了酶的固定量和酶的固定稳定性、防止了酶的失活。
    因此,本发明从此入手。
    下面具体说明本发明的实施方案。
    本发明采用静电纺丝法制备纳米纤维膜生物传感器,其主要步骤如下:
    步骤1:采用自由基聚合法合成丙烯腈-丙烯酸共聚物,其粘均分子量为30000~100000,共聚物中丙烯酸链段的含量为1%~5%。
    步骤2:将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成浓度为6~15%的N,N-二甲基甲酰胺溶液,再配置检测所需的血红蛋白、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶溶液。
    步骤3:将聚合物溶液作为外层,再将酶溶液作为内层纺丝溶液,一起加以15KV高压电、15cm的纺丝距离、20~50%的湿度、室温下在电极上电纺成纤维膜,即可制得生物传感器。该方法制备的生物传感器制备操作简单、克服了简单吸附中稳定性差的缺点和共价键合中酶易失活的不足,需要的酶量小、固定量高。
    所述丙烯腈-丙烯酸共聚物作为外层聚合物必须具有可纺性,而内层溶液并不要求可纺性,因此才能将内层分子一起固定在纳米纤维中,而本发明方案中的丙烯腈-丙烯酸聚合物拥有非常好的成纤能能力,对纺丝要求非??硭?。
    实施例1:
    制备血红蛋白酶传感器
    将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成浓度为6%的N,N-二甲基甲酰胺溶液,再用磷酸缓冲溶液配置8mg/ml的血红蛋白酶溶液,聚合物溶液作为外层、酶溶液作为内层,再15KV电压、15cm的纺丝距离、40%的湿度、室温下进行静电纺丝,外层推注速度设为0.3mm/min,内层推注速度设为0.1mm/min,纺丝时间设为40s,用常规的玻碳电极(直径为0.3mm)为接收器,即可制备纳米纤维膜生物传感器。以该电极为工作电极、铂丝电极为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极,以-0.3V恒定电位,pH为7.0的磷酸缓中溶液中测定该生物传感器对H2O2溶液的响应。
    该生物传感器对H2O2的响应时间为10秒;测量H2O2的线性范围为5~70mM;检测限为0.13mM;灵敏度为0.092mA·M-1·cm-2;米氏常数KMapp为25.61mM;线性相关度为0.996;传感器具有较高的操作稳定性,在1mM H2O2溶液中连续测量50次后,响应电流基本保持不变,相对标准偏差(RSD)仅为3.0%。对应于 说明附图1-4,图1为该静电纺丝法制备的纳米纤维膜的扫描电镜图,其中A为同轴静电纺丝法制备的Hb/P(AN-co-AA)纤维膜扫描电镜图,B为A图的局部放大图,可以看出该方法制得的纳米纤维膜均一度高,直径在200-300nm之间;图2可以看出该方法制备的传感器有较短的响应时间,说明底物可以快速与酶发生催化反应;图3可以看出低浓度时催化反应为一级反应,该方法制备的传感器催化底物的反应有非常好的线性关系,且测定浓度先行范围宽,根据斜率可求出灵敏度;图4为该方法制得的传感器米氏常数测定曲线。
    实施例2:
    制备多酚氧化酶传感器
    先将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成浓度为6%的N,N-二甲基甲酰胺溶液,再用磷酸缓冲溶液配置8mg/ml的多酚氧化酶溶液,聚合物溶液作为外层、酶溶液作为内层,再15KV电压、15cm的纺丝距离、40%的湿度、室温下进行静电纺丝,外层推注速度设为0.3mm/min,内层推注速度设为0.1m/min,纺丝时间设为40s,用常规的玻碳电极(直径为0.3mm)为接收器,即可制备纳米纤维膜生物传感器。以该电极为工作电极、铂丝电极为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极,以-0.2V恒定电位,pH为6.0的磷酸缓冲溶液中测定该生物传感器对儿茶酚溶液的响应。
    该生物传感器对儿茶酚的响应时间为10秒;测量儿茶酚的线性范围为0.5nM~500nM;检测限为0.364nM;灵敏度为161.78mA·M-1·cm-2;米氏常数KMapp为0.0175mM;线性相关度为0.9997;电极制作的重现性好(五支电极同时制备的相对标准偏差为4.9%)。对应于说明附图5-7,图5可以看出该方法制备的传感器有较短的响应时间,说明底物可以快速与酶发生催化反应;图6可以看出低浓度时催化反应为一级反应,该方法制备的传感器催化底物的反应有非常好的线性关系,且测定浓度先行范围宽,根据斜率可求出灵敏度;图7为该方法制得的传感器米氏常数测定曲线。
    实施例3:
    制备葡萄糖氧化酶传感器
    先将丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成浓度为6%的N,N-二甲基甲酰胺溶液,再用磷酸缓冲溶液配置8mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液,聚合物溶液作为外层、酶溶液作为内层,再15KV电压、15cm的纺丝距离、40%的湿度、室温下进行静电纺 丝,外层推注速度设为0.3mm/min,内层推注速度设为0.1mm/min,纺丝时间设为40s,用常规的铂电极(直径为0.2mm)为接收器,即可制备纳米纤维膜生物传感器。以该电极为工作电极、铂丝电极为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极,以0.6V恒定电位,pH为7.0的磷酸缓冲溶液中测定该生物传感器对葡萄糖溶液的响应。
    该生物传感器对葡萄糖的响应时间为12秒;测量葡萄糖的线性范围为20mM~80mM;检测限为16.07mM;灵敏度为0.0529mA·M-1·cm-2;米氏常数KMapp为30.13mM;线性相关度为0.997。对应于说明附图8-10,图8可以看出该方法制备的传感器有较短的响应时间,说明底物可以快速与酶发生催化反应;图9可以看出低浓度时催化反应为一级反应,该方法制备的传感器催化底物的反应有非常好的线性关系,且测定浓度先行范围宽,根据斜率可求出灵敏度;图10为该方法制得的传感器米氏常数测定曲线。
    采用同样的方法还可分别制备成黄嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
    本发明所采用的电极为本领域公知的基底电极。

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