• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 15
    • 下载费用:30 金币  

    2018新版重庆时时彩: 一种针对靶标的即时定量分析方法.pdf

    关 键 词:
    一种 针对 靶标 即时 定量分析 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201410057505.1

    申请日:

    2014.02.20

    公开号:

    CN103913542A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/00申请日:20140220|||公开
    IPC分类号: G01N33/00; G01N24/08; G01N21/33 主分类号: G01N33/00
    申请人: 厦门大学
    发明人: 杨朝勇; 官志超; 郏莎莎; 朱志
    地址: 361000 福建省厦门市思明南路422号
    优先权:
    专利代理机构: 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 代理人: 张松亭
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410057505.1

    授权公告号:

    103913542B||||||

    法律状态公告日:

    2017.06.16|||2014.08.06|||2014.07.09

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种针对靶标的即时定量分析方法,包括如下步骤:(1)根据靶标选择合适的核酸适体,并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A,以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B;在链A、链B上分别修饰水凝胶单体;(2)将修饰单体的链A、链B聚合,并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶,同时将信号放大分子,包埋在该水凝胶结构中;(3)在水凝胶中加入靶标,靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子;(4)滑动芯片中放置溶液相底物,信号放大分子作用于溶液相底物,催化产生可由滑动芯片读出的信号分子;(5)记录检测结果。该方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种针对靶标的即时定量分析方法,包括如下步骤: 
    (1)根据靶标选择合适的核酸适体,并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A,以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B;在链A、链B上分别修饰水凝胶单体; 
    (2)将修饰单体的链A、链B聚合,并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶,同时将信号放大分子,包埋在该水凝胶结构中; 
    (3)在水凝胶中加入靶标,靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子; 
    (4)滑动芯片中放置溶液相底物,信号放大分子作用于溶液相底物,催化产生可由滑动芯片读出的信号分子; 
    (5)根据滑动芯片的示数,记录检测结果。 

    2.  如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于:步骤(2)中,水凝胶中三条DNA链的终浓度分别为100μM-1mM。 

    3.  如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于:步骤(3)在缓冲液中进行,使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。 

    4.  如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于:溶液相底物为H2O2,信号分子为O2时,信号放大分子选自过氧化氢酶、AuNPs、[email protected]中的一种。 

    5.  如权利要求4所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于:信号放大分子采用为[email protected],其在水凝胶中的包埋量为1nM-100μM。 

    6.  如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于:步骤(3)中,水凝胶与靶标溶液体积比为1:1-10。 

    7.  如权利要求1所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,用于可卡因检测,包括如下步骤:(1)将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与[email protected]混合,制备核酸适体交联水凝胶;(2)将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中,30℃条件下反应1小时,释放出[email protected];(3)利用滑动芯片,使[email protected]与H2O2接触并催化H2O2产生O2,从而测定反应产物中的纳米粒子含量。 

    8.  如权利要求7所述的一种针对靶标的即时定量分析方法,其特征在于,包括如下步骤: 
    (1)合成丙烯酸亚磷酰胺单体 
    (2)甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化 
    以普通CPG作为固相载体,以DNA单体碱基为原料,在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体,最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体,具体合成的序列见表1;合成结束后,将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中,加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65℃下氨解30min,使DNA从CPG上切割下来;氨解完毕后提取上清,并用少量超纯水清洗CPG,合并上清;向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl,于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min;酒精沉淀完毕后,在14,000rpm的转速下离心10min,弃上清;将得到的粗产物纯化;定量后真空浓缩; 
    (3)水凝胶的制备 
    将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液,分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED,即0.05g过硫酸铵溶解至0.5ml超纯水和25μL TEMED溶解于0.5mL超纯水;将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液,放入真空干燥器中抽真空除气10min,加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED,混匀后将反应体系置于真空干燥器中,30℃条件下抽真空反应15min,得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B;将PS-A与PS-B按照1:1混合后,加入反应缓冲液,之后加入[email protected],振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker核酸适体;重复振荡、加热步骤,直至得到包裹有[email protected]的三维交联水凝胶; 
    (4)制作滑动芯片 
    (5)DNA水凝胶可视化定量检测 
    利用缓冲液配制靶标溶液,并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上,于30℃,150rpm的转速下进行充分反应;反应结束后,取反应上清液用于滑动芯片催化反应;分别在加样孔,底物孔,染料孔加入反应上清液,H2O2和罗丹明6G,滑动芯片,使[email protected]与H2O2接触并催化H2O2产生O2,根据产生气体量进行读数,并记录数据。 

    说明书

    说明书一种针对靶标的即时定量分析方法
    技术领域
    本发明涉及一种针对可卡因等多种靶标的即时可视化定量分析方法,属于可视化定量分析方法技术领域。
    背景技术
    水凝胶是一类亲水性的高分子聚合物,能够在水环境下发生溶胀,依靠物理交联或化学交联两种方式生成。凝胶结构能够响应多种环境参数,如温度,pH,离子强度和溶剂组成等,而发生改变,因而也被称作“智能水凝胶”?;诟髦执骋庖迳系乃汗菇ǖ拇衅髟谙煊Ω髦滞饨缧藕挪⒎⑸灾矢谋浜?,通?;挂岷弦恍└丛?、精密的仪器对特征变化进行表征和记录,这样往往耗时费力,不适合普及。DNA交联水凝胶的出现,极大地扩展了水凝胶传感器的应用范围(1、Liu J,Liu H,Kang H,et.al.,Aptamer-incorporated hydrogels for visual detection,controlled drug release,and targeted cancer therapy[J].Anal Bioanal Chem(2012)402:187–194.)。
    核酸适体作为一类新型的分析、诊断分子,自出现以来,受到科研工作者的广泛关注。因其优于传统蛋白单克隆抗体的诸多特性,核酸适体已成为新兴的研究工具,在科研、疾病诊断和治疗试剂等方面逐步取代传统的抗体类诊断和生物技术产品(2、Gold L.,PoliskyB.,Uhlenbeck O.,et.al.,Diversity of oligonucleotide functions,Annual Review of Biochemistry[J].1995,64.763-797;3、Jayasena S.,Aptamers:An emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics,Clinical Chemistry[J].1999,45.1628-1650;4、Wilson D.,Szostak J.,In vitro selection of functional nucleic acids,Annual Review of Biochemistry[J].1999,68.611-647;5、Joyce G.,In-vitro evolution of nucleic-acids,Current Opinion in Structural Biology[J].1994,4.331-336.)。核酸适体是指从人工合成的DNA/RNA库中筛选得到的能够与靶标分子结合的单链寡核苷酸。核酸适体技术存在的基础是核酸适体借助氢键、范德华力、疏水作用等分子间作用力形成的特殊的三维结构,如发夹、假结、凸环、G-四聚体等(6、Li,F.,Zhang,J.,Cao,X.N.,Wang,L.H.,Li,D.,Song,S.P.,Ye,B.C.,Fan,C.H.,Adenosine detection by using gold nanoparticles and designed aptamer sequences,Analyst[J].2009,134.1355-1360.)。另一方面,核酸适体的特异性很高,如茶碱与其RNA核酸适体的亲和力相当于其类似物如咖啡因(与茶碱只相差一个碱基)的10,000倍(7、Kato, T.,Takemura,T.,Yano,K.,Ikebukuro,K.,Karube,I.,In vitro selection of DNA aptamers which bind to cholic acid,Biochimica Et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression[J].2000,1493.12-18.),还可以将氨基酸、腺苷等生物小分子的突变体、异构体区分开来。核酸适体技术在分子生物学中的应用对象相当广泛,涵盖了离子、小分子、生物大分子以及细胞。应用目的则相对专一,主要是检测和分析。
    与此同时,遗传变异、疾病诊断、治疗等与人类健康息息相关的问题受到越来越广泛的重视。致力于解决上述问题的生物小分子、生物大分子、细胞,特别是癌变细胞等的检测,也因此成为化学、生物医学等相关领域的研究热点。其中基于核酸适体的放大技术凭借其高分析灵敏度,在超痕量核酸序列检测中大放异彩,向着普及化、便携化、低污染等方向发展。目前有代表性的涉及核酸相关酶的分子生物学信号放大研究方向有以下几种:基于飞速发展的纳米生物技术的DNA的可视化检测、癌症检测等;应免疫学和癌症生物学发展要求涌现的新型诊断和治疗工具以及灵敏的系统监测技术;更有利于生物分析及临床诊断的对实际样品中小分子及蛋白质的检测;与基于核酸适体的免疫磁分离相结合的血液、血浆等各种体液中存在的疾病标志物的检测;多态效应的评估;应用于酶活性的表征的核酸放大技术、miRNA的定量分析及治疗研究;新的DNAzyme。
    即时诊断是近年来日渐成熟的一项诊断技术。所谓即时诊断(Point of Care Test,POC Test),是指在病人身旁迅速获得检测结果。该技术方便、快捷,不依赖昂贵的实验仪器设备或者专业的技术人员,亦不需借助复杂的样品处理步骤,依靠简单的设备读出信号或者通过观测试纸上条纹、斑点等的颜色变化来反映检测结果。除应用于医院、诊所中迅速获取病人信息外,即时诊断使疫情早期预警、家庭保健防护、贫困地区医疗乃至食物、水、环境等的现场监测等成为可能。
    发明内容
    本发明针对现有仪器手段复杂、价格昂贵等问题,提出一种快速、灵敏、特异性分析复杂体系中靶标的可视化定量分析方法。
    本发明的技术方案为:
    一种针对靶标的即时定量分析方法,包括如下步骤:
    (1)根据靶标选择合适的核酸适体,并合成一可和核酸适体的第一部分序列互补的至少一链A,以及和核酸适体的第二部分序列互补的至少一链B;在链A、链B上分别修饰水凝胶单体;
    (2)将修饰单体的链A、链B聚合,并与包含有核酸适体的linker链混合形成水凝胶,同时将信号放大分子,包埋在该水凝胶结构中;
    (3)在水凝胶中加入靶标,靶标刺激水凝胶瓦解从而释放出包埋其中的信号放大分子;
    (4)滑动芯片中放置溶液相底物,信号放大分子作用于溶液相底物,催化产生可由滑动芯片读出的信号分子;
    (5)根据滑动芯片的示数,记录检测结果。
    其中,步骤(2)中,水凝胶中三条DNA链的终浓度优选分别为100μM-1mM。
    其中,步骤(3)在缓冲液中进行,使用的缓冲液体系优选采用磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
    其中,溶液相底物为H2O2,信号分子为O2时,信号放大分子选自过氧化氢酶、AuNPs、[email protected]中的一种。优选采用[email protected],因其可催化H2O2产生O2,且催化效果好。
    其中,信号放大分子采用为[email protected]时,其在水凝胶中的包埋量优选采用1nM-100μM。
    其中,步骤(3)中,水凝胶与靶标溶液体积比为1:1-10。
    前述的针对靶标的即时定量分析方法,用于可卡因检测时,该方法包括如下步骤:(1)将两条丙烯酰胺/DNA高聚链、一条核酸适体分子与[email protected]混合,制备核酸适体交联水凝胶;(2)将含有不同已知浓度分析物的溶液加入上述水凝胶中,30℃条件下反应1小时,释放出[email protected];(3)利用slip chip,使[email protected]与H2O2接触并催化H2O2产生O2,从而测定反应产物中的纳米粒子含量。
    在步骤(1)中采用修饰有丙烯酸亚磷酰胺单体的DNA和丙烯酰胺的自由基聚合反应制备聚合物链,按照反应配比1:1:0.6分别加入两条聚合物链、一条核酸适体链并包裹[email protected],制备的水凝胶中DNA链的浓度为110μM,[email protected]浓度为4.6nM。
    在步骤(2)中使用的水凝胶体积为10μL,分析物溶液体积为50μL。
    在步骤(3)中使用的H2O2浓度为30%,催化反应时间为15min-1hr。
    优选方法如下:
    (1)合成丙烯酸亚磷酰胺单体
    (2)甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化
    以普通CPG作为固相载体,以DNA单体碱基为原料,在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体,最后在两条链A和B的5′端修饰上前节中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1;合成结束后,将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中,加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65℃下氨解30min,使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清,并用少量超纯水清洗CPG,合并上清;向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl,于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min;酒精沉淀完毕后,在14,000rpm的转速下离心10min,弃上清;将得到的粗产物纯化;定量后真空浓缩;
    (3)水凝胶的制备
    将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10%的过硫酸铵和5%的TEMED,即0.05g过硫酸铵溶解至0.5mL超纯水和25μL TEMED溶解于0.5mL超纯水。将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液,放入真空干燥器中抽真空除气10min,加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂过硫酸铵和加速剂TEMED,混匀后将反应体系置于真空干燥器中,30℃条件下抽真空反应15min,得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B;将PS-A与PS-B按照1:1混合后,加入反应缓冲液,之后加入[email protected],振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker核酸适体;重复振荡、加热步骤,直至得到包裹有[email protected]的三维交联水凝胶;
    (4)制作滑动芯片
    (5)DNA水凝胶可视化定量检测
    利用缓冲液配制靶标溶液,并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上,于30℃,150rpm的转速下进行充分反应;反应结束后,取反应上清液用于slip chip催化反应;分别在加样孔,底物孔,染料孔加入反应上清液,H2O2和罗丹明6G,滑动芯片,使[email protected]与H2O2接触并催化H2O2产生O2,根据产生气体量进行读数,并记录数据。
    本发明的优点在于:首先,该方法在设计上符合ASSURED(Martinez A.,Phillips S.,Whitesides G.,et.al.,Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper-Based Analytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.)的国际标准,同时它灵敏度高、 选择性好,检测结果可靠的;其次,相对于过氧化氢酶易在H2O2中失活,AuNPs催化能力差,[email protected]具有可长时间催化,易保存等特点。通过延长[email protected]与H2O2的反应时间,即可实现超低靶标的检测,通过产生O2的体积量,最终我们建立起了靶标浓度和slip chip读数的定量关系;另外,由于SELEX技术的飞速发展,现在已经有很多可用的核酸适体,此外还可以通过SELEX筛选得到更广泛的靶标的核酸适体,而我们只需简单的将水凝胶中特异性的核酸适体序列替换掉就能够将我们的发展方法用于更多其它靶标的快速、定量分析。鉴于成本低廉,检测快速,用户友好以及slip chip的广泛可用性,我们提出的基于DNA水凝胶的可视化定量检测方法有可能发展成为公众用于广泛的靶标定量检测工具。
    本发明方法检测灵敏度高,例如,在缓冲液中可卡因检出灵敏度为0.25μM。本发明方法具有操作简单、价格低廉、反应快速、不需要对样品进行复杂前处理等优点,且通用性好,可用于复杂体系,包括生物小分子、重金属离子、蛋白质等各种物质的快速、高灵敏定量检测。
    附图说明
    图1为丙烯酸亚磷酰胺单体合成路线。
    图2为过氧化氢酶、AuNPs、[email protected]催化效率对比。(A)0.25nM [email protected]催化H2O2产生O2slip chip实物图;(B)30min内不同催化剂催化H2O2产生的气体量。
    图3为slip chip芯片用于可卡因梯度浓度检测。
    图4为slip chip芯片对于250μM可卡因和2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应。
    图5为slip chip芯片用于可卡因超低浓度检测。
    图6为使用DNA水凝胶可视化定量检测方法用于检测Adenosine。
    具体实施方式
    实施例1丙烯酸亚磷酰胺单体的合成
    参见图1,丙烯酸亚磷酰胺单体的合成分为三个步骤:1)将6-氨基-1-己醇(1g,8.53mmol),三乙胺(2.36mL,17mmol)加入100mL二氯甲烷中冰浴,在无水无氧条件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2.67g,2.55mmol),之后整个体系在室温条件下搅拌反应2小时。2)将溶剂旋干,向产物中加入10mL乙醇和15%NaOH(4mL)将产物选择性水解成N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide。将N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide用乙酸乙酯在硅胶柱分离之后进行下一步反应。3)将纯化后的N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide(0.50g,2.70mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,在0℃条件下逐滴加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA,0.98g,7.5mmol),再逐滴加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(0.87mL,3.25mmol), 在室温反应2小时。将溶剂旋干后,将产物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脱液在硅胶柱上洗脱。得到的终产物为无色油状液体。终产物的核磁表征数据如下:1H NMR(CDCl3):δ5.92(br,1H),5.63(m,1H),5.27(m.1H),3.86-3.72(m,2H),3.66-3.49(m,4H),3.30-3.23(m,2H),2.61(t,2H),1.92(m,3H),1.58-1.50(m,4H)1.37-1.32(m,4H)1.17-1.13(m,12H).13C NMR(CDCl3):δ168.6,140.4,119.3,118.0,63.8,63.6,58.6,58.3,43.2,43.1,39.8,31.3,29.7,26.8,25.8,24.9,24.8,24.7,19.0.31P(CDCl3):δ148.
    实施例2甲基丙烯基团修饰的核酸分子的合成与纯化
    以普通CPG作为固相载体,以DNA单体碱基为原料,在DNA合成仪上由3′端向5′端合成链A、链B及linker核酸适体,最后在两条链A和B的5′端修饰上实施例1中合成的丙烯酸亚磷酰胺单体。具体合成的序列见表1。合成结束后,将上述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中,加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65℃下氨解30min,使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清,并用少量超纯水清洗CPG,合并上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl,于-20℃冰箱进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后,在14,000rpm的转速下离心10min,弃上清。将得到的粗产物溶解在0.1mol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中,使用反相高效液相色谱仪进行纯化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥,溶于超纯水后使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度,根据DNA的消光系数计算出其相应的物质的量和浓度值。定量后真空浓缩。
    表1实施例2中所用DNA序列

    实施例3水凝胶的制备
    将链A和链B分别溶解在超纯水中配制成高浓度DNA储存液。分别配制10%的过 硫酸铵和5%的TEMED,即0.05g过硫酸铵溶解至0.5mL超纯水和25μl TEMED溶解于0.5mL超纯水。将DNA与终浓度为4%的丙烯酰胺配成混合液,放入真空干燥器中抽真空除气10min。加入终浓度为1.4%的新鲜配制的引发剂(过硫酸铵)和加速剂(TEMED),混匀后将反应体系置于真空干燥器中,30℃条件下抽真空反应15min,得到链A和链B的线状高分子聚合产物PS-A、PS-B。将PS-A与PS-B按照1:1混合后,加入10×反应缓冲液1μL,(可卡因使用PB缓冲液:77mM Na2HPO4,23mM NaH2PO4,50mM NaCl,5mMMgCl2,pH7.3;腺苷使用Tris-HCl缓冲液:10mM Tris-HCl,100mM NaCl,10mM MgCl2,pH8.0),之后加入23nM [email protected]μL,振荡混匀后再加入与PS-A、PS-B浓度比为1:1:0.6的linker aptamer。重复振荡、加热步骤,直至得到包裹有[email protected]的三维交联水凝胶。上述反应在干浴器中进行,加热步骤在65℃保持5min,最后自然冷却至室温。
    实施例4slip chip(滑动芯片)的制作
    使用AutoCAD软件画出芯片的二维结构,并制作掩膜版。利用软光刻技术将图形转移到铬板玻璃上,显影坚膜去铬层后,将芯片置于腐蚀液(HF:HNO3:H2O=1:2:17)中腐蚀100min,即可获得芯片结构,并去除剩余的光刻胶和铬层。采用打孔机用1.8mm的钻头进行打孔。之后将芯片放入食人鱼洗液(浓硫酸/H2O2,v:v=3:1)中加热40min以保证芯片的洁净。干燥后,使用2%氯代全氟硅烷(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyldimethyl-chlorosilane)/氟化油FC40(w/w)进行疏水化处理,在85℃加热1hr即得到slip chip。
    实施例5DNA水凝胶可视化定量检测步骤
    使用前用超纯水将制备好的水凝胶清洗3次,以除去残留在离心管管壁上及水凝胶表面的信号放大分子,并将纯水除去。检测时,利用缓冲液配制靶标溶液,并加入到装有水凝胶的离心管中。将离心管转移至摇床上,于30℃,150rpm的转速下进行充分反应。反应结束后,取反应上清液用于slip chip催化反应。在slip chip上层芯片上滴加20μL氟油FC40,将空白玻片在其表面进行滑动,使得氟油均匀平铺在slip chip上层芯片上。盖上slip chip底层芯片,通过左右滑动,排除芯片间空隙使得通道密闭。分别在加样孔,底物孔,染料孔加入反应上清液,H2O2和罗丹明6G(C28H31N2O3Cl),滑动芯片,使信号放大分子与H2O2接触并催化H2O2产生O2,根据产生气体量进行读数,并记录数据。
    图2为过氧化氢酶、AuNPs、[email protected]催化效率对比。使用实施例4制作的slip chip芯片。在slip chip上层芯片上滴加20μL氟油FC40,将空白玻片在其表面进行滑动,使得氟油均匀平铺在slip chip上层芯片上。盖上slip chip底层芯片,通过左右滑动,排除芯片间空隙使得通道密闭。分别在加样孔,底物孔,染料孔加入反应上清液,H2O2和罗丹明6G(C28H31N2O3Cl),滑动芯片,使[email protected]与H2O2接触并催化H2O2产生O2,根据产生气体量进行读数,并记录数据。实验中在前十分钟每隔一分钟记录一次距离长度,在后20分钟,每隔五分钟记录一次。(A)0.25nM [email protected]催化H2O2产生O2slip chip实物图;(B)30min内不同催化剂催化H2O2产生的气体量。
    图3为slip chip芯片用于可卡因梯度浓度检测。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液(77 mM Na2HPO4,23mM NaH2PO4,50mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.3)中于30℃,150rpm反应1hr。收集反应上清液,在如图3所示slip chip上与H2O2反应15min,根据气体产生量进行读数,并记录数据。(A)slip chip实物图;(B)可卡因浓度梯度标准曲线。
    图4为slip chip芯片对于250μM可卡因和2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应。苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯为可卡因的水解产物。通过考察该水凝胶对可卡因以及苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯的响应来判断其专一性。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液(77mM Na2HPO4,23mM NaH2PO4,50mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.3)中于30℃,150rpm反应1hr。收集反应上清液,在slip chip上与H2O2反应15min。根据气体产生量进行读数,并记录数据。(A)slip chip实物图,1、3、5为2.5mM苯甲酰芽子碱和芽子碱甲酯,2、4、6为250μM可卡因;(B)柱状图。
    图5为slip chip芯片用于可卡因超低浓度检测。实验中比较了三种信号放大分子的放大效果及优缺点,发现铂纳米粒子具有催化寿命长,且催化效率稳定等优点,因此,只要存在足够多的H2O2与其反应,就可产生足够多的O2进行检测。DNA水凝胶解胶实验在PB缓冲液(77mM Na2HPO4,23mM NaH2PO4,50mM NaCl,5mM MgCl2,pH7.3)中于30℃,150rpm反应1hr。收集反应上清液,在slip chip上与H2O2反应1hr,其检出限为0.058μM。(A)slip chip实物图;(B)可卡因浓度梯度标准曲线。
    图6为使用DNA水凝胶可视化定量检测方法用于检测Adenosine。根据靶标改变水凝胶中的DNA序列,就可实现对其相应靶标的检测。DNA水凝胶解胶实验在Tris-HCl缓冲液(10mMTris-HCl,100mM NaCl,10mM MgCl2,pH8.0)中于30℃,150rpm反应2hr。收集反应上清液,在slip chip上与H2O2反应15min。(A)slip chip实物图;(B)腺苷浓度梯度标准曲线?!  ∧谌堇醋宰ɡ鴚ww.www.4mum.com.cn转载请标明出处

    关于本文
    本文标题:一种针对靶标的即时定量分析方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6130785.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
  • 江苏快3基本走势图 甘肃快3今日开奖号码 华东15选5精准预测 免费一码中特资料 吉林快三新闻 曾道人内幕玄机ab图 海南飞鱼彩票 北京pk10赛车稳杀一号 建设彩票开奖网站 免费波克单机麻将 炒股软件 极速快3怎样骗人的 吉林时时彩开奖 麻将手机app游戏排行榜 极速飞艇开奖 宁夏十一选五走势