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    重庆时时彩后组三杀号: 一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410171321.8

    申请日:

    2014.04.26

    公开号:

    CN103913565A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/53申请日:20140426|||公开
    IPC分类号: G01N33/53; G01N27/30; G01N27/48 主分类号: G01N33/53
    申请人: 济南大学
    发明人: 魏琴; 张森; 杜斌; 庞雪辉; 马洪敏; 吴丹
    地址: 250022 山东省济南市济微路106号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410171321.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.05.06|||2014.08.06|||2014.07.09

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法及其应用,属于新型纳米功能材料与生物传感器技术领域。其特征在于:(1)铜掺杂二氧化钛[email protected]的制备;(2)双功能标记物-二抗孵化物[email protected]的制备;(3)双功能标记物构建的免疫传感器的制备及分析应用。本发明双功能标记物构建的免疫传感器优点在于识别快速、灵敏度高、检测限低、成本低、便于操作,能实现多种肿瘤标志物的高灵敏、特异性、快速准确检测。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种双功能标记物-二抗孵化物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (1)二氧化钛纳米材料的制备
    将2 mL钛酸丁酯加入40~50 mL乙二醇中,室温搅拌6~8 h制成混合物,将混合物加入150~170 mL的丙酮中,加2~3 mL水,剧烈搅拌1~2 h,离心分离,用乙醇清洗2~4 次,50℃干燥,制得二氧化钛前驱体;将0.1 g二氧化钛前驱体分散到20 mL水中,搅拌条件下加热回流1~2 h;再经过离心分离,乙醇清洗2~4 次,50℃干燥,制得二氧化钛纳米材料,备用;
    (2)铜掺杂二氧化钛[email protected]的制备
    将1 g 二氧化钛纳米材料加到40 mL、10 mol·L-1 的NaOH溶液中,搅拌2~3 h,装入聚四氟乙烯的反应釜中, 120~140℃加热18 ~ 24 h,取出、冷却至室温,用8~12 mL、0.1 mol·L-1 HCl溶液搅拌处理,超纯水洗涤至中性,60℃下干燥,得到处理过的二氧化钛纳米材料;
    将乙二胺(en)和Cu(OH)2以化学计量比2:1的比例混合制得Cu(en)2(OH)2溶液,将0.8 g上述处理过的二氧化钛纳米材料加到50 mL 制得的Cu(en)2(OH)2溶液中,搅拌1~2 h,得到蓝色物质,离心分离,用水清洗数次后,在400~500℃下煅烧得到黄色粉末铜掺杂二氧化钛[email protected];
    (3)双功能标记物的制备
    将0.25 g [email protected]、0.5 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷、80 mL甲苯,在氮气?;は?,120℃搅拌回流4~6 h,用甲苯和超纯水各清洗2~4次,50~60℃下干燥,制得氨基功能化铜掺杂二氧化钛[email protected],即双功能标记物;
    所述的双功能标记物,其功能一是利用二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应产生的信号用方波伏安法对分析物进行检测;二是利用二氧化钛上的铜离子催化H2O2产生的信号,采用计时电流法对分析物进行检测;
    (4)双功能标记物-二抗孵化物[email protected]的制备
    将1 mg双功能标记物和0.5 mL、质量分数为2.5%的戊二醛混合,振荡1~2 h,离心,倾倒上层溶液,加入0.4~0.6 mL、pH7.0~7.8的PBS溶液,超声使其分散均匀;加入3~5 μL分析物的二抗(Ab2),振荡10~12 h后离心分离,用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1 mL,制得双功能标记物-二抗孵化物[email protected],置于4℃冰箱中备用。

    2.  一种双功能标记物构建的免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
    (1)将3~5 μL、1.5~2.5 mg·mL-1超声处理分散均匀的石墨烯,滴涂在玻碳工作电极表面,自然晾干;
    (2)分别将3~5 μL的8~12 μg·mL-1 分析物的一抗Ab1滴涂在(1)中得到的工作电极表面, 4℃冰箱中干燥;
    (3)滴涂2~4 μL、80~120 μg·mL-1的牛血清白蛋白于(2)中得到的工作电极表面,置于4℃冰箱中直至干燥,超纯水清洗后,置于4℃冰箱中晾干;
    (4)取3~5 μL权利要求1制备的双功能标记物-二抗孵化物[email protected],滴涂于电极表面上,置于4 ℃冰箱中晾干,制得一种双功能标记物构建的免疫传感器。

    3.  根据权利要求2所述的制备方法制备的免疫传感器,其特征在于,用于分析物的检测,包括如下步骤:
    (1)用方波伏安法对分析物进行检测
    1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、pH 4.0~6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
    2)扫描电压范围从-0.4 ~ 0.4 V,电势阶跃为5 mV,频率25 Hz,振幅25 mV;
    3)二氧化钛上的铜离子发生氧化还原反应在0.0 V附近产生信号,根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系,绘制工作曲线;
    (2)用计时电流法对分析物进行检测
    1)使用电化学工作站对三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的免疫传感器为工作电极,在10 mL、pH 4.0~6.0的PBS缓冲溶液中进行测试;
    2)在0.0~-0.5 V的检测电压下,每隔40秒加入10 μL 5.0 mmol·L-1  H2O2,记录电流变化;
    3)二氧化钛上的铜离子对H2O2具有催化作用,能将H2O2催化转变为H2O,同时产生电流变化,根据所得电流强度与分析物浓度之间的线性关系,绘制工作曲线。

    4.  根据权利要求1和权利要求3所述的分析物,其特征在于,所述分析物选自以下之一:癌胚抗原(CEA),甲胎蛋白(AFP),免疫球蛋白E(IgE),免疫球蛋白G(IgG),α-L-岩藻糖苷酶 (AFU),前列腺特异性抗原(PSA),CA15-3,CA125,CA19-9, CA724,CA242,人绒毛膜促性腺激素(HCG),乳腺癌易感基因(BRCA1),鳞状细胞癌抗原(SCC)、细胞角蛋白19片断(Cyfra21-1),组织多肽抗原(TPA),神经元特异性烯醇化酶(NSE)。

    关 键 词:
    一种 功能 标记 构建 免疫 传感器 制备 方法 及其 应用
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