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    重庆时时彩杀号澳客网: 嗜碱性粒细胞分析系统和方法.pdf

    关 键 词:
    碱性 粒细胞 分析 系统 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201280028245.4

    申请日:

    2012.04.26

    公开号:

    CN103917868A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 31/00申请日:20120426|||公开
    IPC分类号: G01N31/00 主分类号: G01N31/00
    申请人: 雅培制药有限公司
    发明人: 吴炯; 迈克尔·R.·布尔; 贾科莫·瓦卡
    地址: 美国伊利诺伊州
    优先权: 2011.05.04 US 61/482,549
    专利代理机构: 北京弘权知识产权代理事务所(普通合伙) 11363 代理人: 郭放;荣文英
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201280028245.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.08.24|||2014.08.06|||2014.07.09

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供用于分析血液样本、且更具体来说用于进行嗜碱性粒细胞分析的系统和方法。在一个实施方案中,所述系统和方法包括:(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本;并且接着(b)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分嗜碱性粒细胞与其它WBC子群体。在一个实施方案中,所述系统和方法包括基于光散射与荧光测量结果的组合进行所述血液样本的嗜碱性粒细胞聚类分析。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种用于对已用荧光染料染色的血液样本进行嗜碱性粒细胞分析的血液学分析仪,其中所述荧光染料是细胞膜可透性和核酸结合性的,所述分析仪包括:
    激发源,其被定位来激发所述血液样本内的粒子;
    多个检测器,包括(1)轴向光损失检测器,其被定位来测量所激发血液样本的轴向光损失;(2)中等角度散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的中等角度散射;(3)侧向散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的90°侧向散射;以及(4)荧光检测器,其被定位来测量从所激发血液样本发射的荧光;以及
    处理器,其被配置成
    (a)接收来自所述多个检测器的(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°侧向散射以及(4)荧光的测量结果,并且
    (b)基于所有四种测量结果来进行所述血液样本的嗜碱性粒细胞聚类分析。

    2.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述嗜碱性粒细胞聚类分析包括所接收的测量结果的粗略聚类。

    3.  如权利要求2所述的血液学分析仪,其中所述嗜碱性粒细胞聚类分析包括利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素来对所接收的测量结果进行精细聚类。

    4.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述侧向散射检测器是偏振侧向散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的90°偏振侧向散射。

    5.  如权利要求4所述的血液学分析仪,其中所述处理器进一步被配置成基于(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振侧向散射以及(4)荧光的所述测量结果来区分所述血液样本内的嗜碱性粒细胞与所述血液样本内的淋巴细胞。

    6.  如权利要求4所述的血液学分析仪,其进一步包括:
    去偏振侧向散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的90°去偏振侧向散射。

    7.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述处理器进一步被配置成基于(1)轴向光损失、(2)中等角度散射以及(3)90°侧向散射的所述测量结果来区分所述血液样本内的嗜碱性粒细胞与所述血液样本内的嗜中性粒细胞、单核细胞以及嗜酸性粒细胞。

    8.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述处理器进一步被配置成基于(1)轴向 光损失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振侧向散射以及(4)荧光的所述测量结果来区分所述血液样本内的嗜碱性粒细胞与所述血液样本内的嗜中性粒细胞、单核细胞以及嗜酸性粒细胞。

    9.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述处理器进一步被配置成预筛查所接收的测量结果以排除对不满足所述荧光阈值的任何粒子的考虑。

    10.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述轴向光损失检测器测量在0°散射下的轴向光损失。

    11.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述中等角度散射检测器测量在约3°至约15°下的光角度散射。

    12.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述多个检测器包括一个或多个光电倍增管。

    13.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其中所述激发源是激光器。

    14.  如权利要求1所述的血液学分析仪,其进一步包括:
    孵育子系统,其用于以试剂稀释所述血液样本。

    15.  如权利要求14所述的血液学分析仪,其中所述试剂包括所述荧光染料和溶解剂。

    16.  如权利要求14所述的血液学分析仪,其中所述试剂包括(a)至少一种表面活性剂;(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐;(c)至少一种抗微生物剂;以及(d)所述荧光染料。

    17.  如权利要求14所述的血液学分析仪,其中所述孵育子系统被配置成在小于约30秒的时期以所述试剂孵育所述血液样本。

    18.  如权利要求14所述的血液学分析仪,其中所述孵育子系统被配置成在范围从约30℃至约50℃的温度下以所述试剂孵育所述血液样本。

    19.  如权利要求14所述的血液学分析仪,其中所述孵育子系统被配置成在约40℃的温度下以所述试剂孵育所述血液样本。

    20.  一种用自动血液学分析仪进行嗜碱性粒细胞分析的方法,所述方法包括:
    (a)用试剂稀释全血样本,其中所述试剂包括红细胞(RBC)溶解剂和细胞膜可透性核酸结合荧光染料;
    (b)在范围从约30℃至约50℃的温度下在小于约30秒的孵育期孵育步骤(a)的所稀释血液样本;
    (c)将来自步骤(b)的所孵育样本递送至所述血液学分析仪中的流动池;
    (d)当所孵育样本横穿过所述流动池时,用激发源激发来自步骤(c)的所孵育样本;
    (e)收集来自所激发样本的多个光散射信号和荧光发射信号;以及
    (f)基于步骤(e)中收集的所有信号进行嗜碱性粒细胞聚类分析。

    21.  如权利要求20所述的方法,其中所述嗜碱性粒细胞聚类分析包括所收集的信号的粗略聚类。

    22.  如权利要求21所述的血液学分析仪,其中所述嗜碱性粒细胞聚类分析进一步包括利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素来对所收集的信号进行精细聚类。

    23.  如权利要求20所述的方法,其中所述试剂包括(a)至少一种表面活性剂;(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐;(c)至少一种抗微生物剂;以及(d)至少一种荧光染料。

    24.  如权利要求20所述的方法,其中所述激发源的波长是约350nm至约700nm。

    25.  如权利要求20所述的方法,其中所述激发源的波长是约488nm。

    26.  如权利要求20所述的方法,其中所述多个光散射信号包括:(1)轴向光损失、(2)中等角度散射以及(3)90°侧向散射。

    27.  如权利要求20所述的方法,其中所述多个光散射信号包括:(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振侧向散射以及(4)90°去偏振侧向散射。

    28.  一种用于对已用荧光染料染色的血液样本进行嗜碱性粒细胞分析的血液学分析仪,其中所述荧光染料是细胞膜可透性和核酸结合性的,所述分析仪包括:
    激发源,其被定位来激发所述血液样本内的粒子;
    多个检测器,包括被定位来测量所激发血液样本的光散射和从所激发血液样本发射的荧光的检测器;以及
    处理器,其被配置成
    (a)接收来自所述多个检测器的光散射和荧光的测量结果,并且
    (b)进行所述血液样本的多维嗜碱性粒细胞聚类分析。

    说明书

    说明书嗜碱性粒细胞分析系统和方法
    相关申请的交叉引用
    本申请根据美国法典35篇119条(e)款要求题为用于检测和分析嗜碱性粒细胞的方法(Method For Detecting and Analyzing Basophils)并在2011年5月4日提交的美国临时专利申请号61/482,549的权益,所述临时专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文。
    本申请还涉及2012年4月26日提交的、代理人案卷号为ADDV-016(11040USO1),题为“白细胞分析系统和方法(WHITE BLOOD CELL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD)”的申请号xx/xxx,xxx;和2012年4月26日提交的、代理人案卷号为ADDV-017(11041USO1),题为“有核红细胞分析系统和方法(NUCLEATED RED BLOOD CELL ANALYSIS SYSTEM AND METHOD)”的申请号xx/xxx,xxx,这些申请的全部公开内容以引用的方式整体并入本文。
    技术领域
    本发明涉及血液学系统和方法。更具体来说,本发明涉及用于分析血液样本以鉴定、分类和/或定量血液样本中的嗜碱性粒细胞的系统和方法。
    背景技术
    嗜碱性粒细胞是白细胞(WBC)子群体,其占正常血液样本的总WBC计数的1%或以下。嗜碱性粒细胞是WBC的最不常见的子群体。在临床上,嗜碱性粒细胞主要涉及于某些炎症性和过敏性反应中。嗜碱性粒细胞排放免疫系统介质(如组胺、血清素和肝素)以协助血液流动并且防止血液凝结。
    在传统上,嗜碱性粒细胞是通过检查含有血液样本涂抹物的显微镜载片来手动鉴定和计数。然而,手动复查载片的精确度和准确度是可疑的,因为相对于其它WBC子群体,嗜碱性粒细胞的浓度是如此之低。此外,对训练有素的医学技术人员的需要以及他们的相关劳动力成本使得手动复查载片的商业可行性甚至更小。
    替代性嗜碱性粒细胞检测技术包括在流式细胞分析系统中使用抗体。发现例如像CD203c、CD63和FCεR1的众多抗体对嗜碱性粒细胞表面抗原具有敏感性和特异性。然而,嗜碱性粒细胞抗体测定的成本、漫长的样本制备和测量过程以及对具有流式细胞术经验的执业医学技术人员的需要使得流式细胞术测定方法对于大多数医院和实验室而言并不普及。
    反而,嗜碱性粒细胞最通常被报道为在自动五部分差异血液学分析仪上的“最佳猜 测”估计值。实际上,开发准确且高效的嗜碱性粒细胞测定已成为一个挑战,因为:(1)各血液样本在小于1分钟内进行分析,包括样本抽吸、样本-试剂相互作用和孵育以及样本测量,所述时间是不足以进行嗜碱性粒细胞鉴定的时期;(2)大多数血液样本中的嗜碱性粒细胞事件数小于1%;(3)嗜碱性粒细胞与淋巴细胞共有类似的光学散射特征,因此使错误鉴定的可能性增加;并且(4)针对嗜碱性粒细胞特定设计的测定将极大增加系统的复杂度和成本。
    发明内容
    本文提供用于分析血液样本、且更具体来说用于进行嗜碱性粒细胞分析的系统和方法。在一个实施方案中,所述系统和方法包括:(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本;并且接着(b)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分嗜碱性粒细胞与其它WBC子群体。在一个实施方案中,所述系统和方法包括基于光散射与荧光测量结果的组合进行血液样本的嗜碱性粒细胞聚类分析。
    附图说明
    并入本文的附图构成说明书的一部分。附图连同本书面描述一起进一步用于说明提供的系统和方法的原理,并且使得相关领域技术人员能够制造和使用提供的系统和方法。在附图中,相同参考数字指示相同或功能上类似的元件。
    图1是示出血液学仪器的示意图。
    图2A是第一血液样本(样本1)的90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
    图2B是样本1的轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
    图3A是第二血液样本(样本2)的90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
    图3B是样本2的轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
    图4是样本1的荧光对中等角度散射的细胞图,其显示淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。
    图5是样本2的荧光对中等角度散射的细胞图,其显示淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。
    图6A是样本1的90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
    图6B是样本1的轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
    图6C是样本1的荧光对中等角度散射的细胞图。
    图7A是样本2的90°偏振侧向散射对中等角度散射的细胞图。
    图7B是样本2的轴向光损失对中等角度散射的细胞图。
    图7C是样本2的荧光对中等角度散射的细胞图。
    图8是显示通过手动门控分析的嗜碱性粒细胞百分比与通过流式细胞术(或“流动式细胞测量术”)测定的嗜碱性粒细胞百分比的相互关系的图。
    图9是显示通过聚类分析的嗜碱性粒细胞百分比与通过流式细胞术(或“流动式细胞测量术”)测定的嗜碱性粒细胞百分比的相互关系的图。
    具体实施方式
    本文提供用于分析血液样本、且更具体来说用于进行嗜碱性粒细胞分析以鉴定、分类和计数血液样本中的嗜碱性粒细胞的系统和方法。在一个实施方案中,所述系统和方法大体上包括:(a)用专有细胞膜可透性荧光染料染色血液样本;并且接着(b)使用光散射和荧光发射的测量结果来区分嗜碱性粒细胞与其它白细胞(WBC)子群体。更具体来说,示例性实施方案包括一种血液学分析仪,所述血液学分析仪具有:激发源,其被定位来激发所述血液样本内的粒子;多个检测器,其被定位来测量光散射和荧光发射;以及处理器,其被配置为(a)接收光散射和荧光发射的测量结果并且(b)基于所接收的测量结果进行所述血液样本的嗜碱性粒细胞聚类分析。嗜碱性粒细胞聚类分析可包括所接收的测量结果的“粗略”聚类,接着是所接收的测量结果的“精细”聚类。精细聚类可利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素。
    在一个实施方案中,所述系统和方法包括借助于荧光染色和荧光触发策略来筛查含核事件与非含核事件的对比。因此,来自如溶解抗性红细胞(rstRBC)的未溶解红细胞(RBC)和RBC片段的干扰在随后分析之前被大致上消除?;痪浠八?,本文所述的系统和方法利用至少一种荧光染料和荧光触发系统来筛查含核事件,由此准确而可靠地鉴定和定量WBC(和WBC子群体)。接着,使用光散射信息与荧光信息的组合来进一步分离WBC子群体,并且具体来说嗜碱性粒细胞。所公开的系统和方法由此确保对嗜碱性粒细胞的准确计数和区别。
    (1)用于分析的多个光学通道和至少一个荧光通道的使用。
    在一个实施方案中,借助于多角度偏振散射分离技术(MAPSS)进行血液样本分析,其中荧光信息得以增强。至少一个光电二极管或至少一个光电倍增管或至少一个光电二极管与至少一个光电倍增管两者是检测由穿过流动池的各血细胞散射的光所需的。两个或更多个光电二极管用于测量度量约0°散射的轴向光损失(ALL)信号和度量低角度(例如 约3°至约15°)散射的中等角度散射(IAS)信号。两个或更多个光电倍增管用于检测90°偏振侧向散射(PSS)信号和90°去偏振侧向散射(DSS)信号。对适当波长范围内的荧光(FL1)测量来说,取决于对光源波长的选择而需要其它光电倍增管。因此,在系统上捕获的每一事件展现多方面的信息,如ALL、IAS(一个或多个通道)、PSS、DSS和荧光(一个或多个通道)。来自这些检测通道的信息用于进一步分析血细胞。
    图1是示出适于血液学分析(包括流式细胞术)的装置的发光和检测光学器件的示意图。现参照图1,装置10包括光源12、用于光束弯曲的前镜14和后镜16、含有第一圆柱形透镜20和第二圆柱形透镜22的光束扩展器???8、聚焦透镜24、精细光束调整器26、流动池28、前向散射透镜30、靶心检测器32、第一光电倍增管34、第二光电倍增管36和第三光电倍增管38。靶心检测器32具有用于0°光散射的内部检测器32a和用于7°光散射的外部检测器32b。
    在随后论述中,光源优选是激光器。在替代性实施方案中,选择在约350nm至约700nm之间的波长下发射光的激光器;举例而言,在一个实施方案中,使用在约488nm下发射光的激光器。光源12可为可商购自Coherent,Inc.,Santa Clara,CA的垂直偏振气冷Coherent Cube激光器??墒褂貌ǔぴ?50nm至700nm的范围内的激光器。激光器的操作条件大致上与当前与“CELL-DYN”自动血液学分析仪一起使用的激光器的操作条件类似。然而,也可使用其它光源;例如像灯(例如汞灯、氙灯)。
    关于流动池、透镜、聚焦透镜、精细光束调整机构和激光聚焦透镜的其它细节可见于以引用的方式并入本文的美国专利号5,631,165中,尤其在第41栏第32行至第43栏第11行。图1中所示的前向光路系统包括球面平凸透镜30和位于透镜的后聚焦平面中的两元件光电二极管检测器32。在这个构造中,两元件光电二极管检测器32内的每个点映射来自穿过流动池28移动的细胞的光的一个特定收集角。检测器32可为能够检测轴向光损失(ALL)和中等角度前向散射(IAS)的靶心检测器。美国专利号5,631,165在第43栏第12-52行描述这个检测器的各种替代物。
    第一光电倍增管34(PMT1)测量去偏振侧向散射(DSS)。第二光电倍增管36(PMT2)测量偏振侧向散射(PSS),并且视所选荧光染料和所用光源而定,第三光电倍增管38(PMT3)测量自约360nm至约750nm的荧光发射。在一个实施方案中,PMT3测量自约440nm至约680nm、或更具体来说自约500nm至约550nm的荧光发射。光电倍增管在广泛波长范围内收集荧光信号以增加信号强度。侧向散射和荧光发射由二向色光束分离器40和42导向这些光电倍增管,所述二向色光束分离器在所需波长下高效传输和反射以使得能够进行高效检测。美国专利号5,631,165在第43栏第53行至第44栏第4行描述关于光电倍增管的各种其它细节。
    当通过使用浸渍(immersion)收集系统测量荧光时,在光电倍增管34、36和38处的灵敏性得以增强。浸渍收集系统是借助于折射率匹配层使第一透镜30光学连接于流动池28,从而使得能够在宽泛角度上收集光的收集系统。美国专利号5,631,165在第44栏第5-31行描述这个光学系统的各种其它细节。
    聚光器44是一种用于高分辨率显微术中的具有足够用于受衍射限制的成像的像差校正的光学透镜系统。美国专利号5,631,165在第44栏第32-60行描述这个光学系统的各种其它细节。
    图1中所示的其它部件(即狭缝46、场透镜48和第二狭缝50)的功能描述于美国专利号5,631,165第44栏第63行至第45栏第26行中。插入光电倍增管的光路中以改变所检测光的波长或偏振化或波长与偏振化两者的光学滤光片52或56和偏光器52或56也描述于美国专利号5,631,165第44栏第63行至第45栏第26行中。适用于本文中的光学滤光片包括带通滤光片和长通滤光片。
    光电倍增管34、36和38检测侧向散射(在轴近似垂直于入射激光光束的锥体中散射的光)或荧光(在与入射激光光束的波长不同的波长下自细胞发射的光)。
    尽管以上参考美国专利号5,631,165的所选部分,但美国专利号5,631,165以引用的方式整体并入本文。
    (2)荧光染料的使用。
    WBC在其核中含有相对较高浓度的DNA。当适当设计时,可使用荧光染料在WBC的不同子群体之间进行区别。举例而言,尽管具有类似的光散射征象(signature,特征),但淋巴细胞和嗜碱性粒细胞具有不同的荧光征象。此外,成熟RBC不含有DNA。因此,可选择荧光染料以在血细胞群体之间进行区别。染料的目的在于易于穿透到活细胞中,以高亲和力结合DNA,并且在染料由适当光源激发时以足够斯托克斯位移(Stokes shift)发射强的荧光。染料在可见波段中的峰吸收可大致上匹配光源波长(在50nm光源波长内、更优选在25nm光源波长内)以适当激发染料并且获得最佳结果。
    所选荧光染料优?。?)能够结合核酸,2)能够穿透WBC和nRBC的细胞膜,3)当经受光源时可在所选波长下激发,4)在由光源激发后发射荧光,并且5)在液体中具有生物稳定性和可溶性。染料可选自由以下组成的组:吖啶橙(acridine orange)、SYBR11、SYBR绿系列染料、碘化己锭(hexidium iodide)、SYTO11、SYTO12、SYTO13、SYTO14、SYTO16、SYTO21、RNA选择性SYTO、SYTO24、SYTO25及其任何等效物。染料用于“活化”WBC和nRBC,基于血液学分析仪中配置的荧光触发器来“筛出”未溶解 RBC和RBC的片段,并且在WBC的子群体之间进行区别。染料通常以约0.1ng/mL至约0.1mg/mL的浓度存在。尽管各种染料可用,但所选染料通常与血液学分析仪的激发源配对以便使用单一专有染料在意图受鉴定、定量和/或分析的nRBC和所有WBC子群体中进行染色并且激发荧光发射。因此,单一(即专有)染料可用于同时在所有其它WBC子群体之中鉴定、定量和分析嗜碱性粒细胞。
    在一个实施方案中,以试剂形式,以足以进行染色并且活化多达每微升1,000×103个细胞的量、与以下各物组合提供荧光染料:1)至少一种表面活性剂;2)至少一种缓冲剂;3)至少一种盐;以及/或4)至少抗微生物剂。如“TRITON”X-100或皂素(saponin)的至少一种表面活性剂用于破坏RBC的膜,并且减小RBC的片段的大小。至少一种表面活性剂通常以约0.001%至约5%的浓度存在。如来自“TRIADINE”或“PROCLIN”家族的抗微生物剂的至少一种抗微生物剂用于防止试剂受微生物污染。至少一种抗微生物剂的浓度应足以持续所需保存期限来保存试剂。如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或4-(2-羟乙基)-l-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)的至少一种缓冲剂用于调整反应混合物的pH以控制RBC的溶解和保存WBC。至少一种缓冲剂通常以约0.01%至约3%的浓度存在。pH通常在约3至约12的范围内。如NaCl或Na2SO4的至少一种盐用于调整重量克分子渗透浓度(osmolality,重量摩尔渗透浓度)以增加溶解效应和/或使WBC保存最佳化。至少一种盐可以约0.01%至约3%的浓度存在。在某些情况下,至少一种缓冲剂可充当至少一种盐,或至少一种盐可充当至少一种缓冲剂。
    一般说来,较低重量克分子渗透浓度或低张性用于加速RBC溶解。重量克分子渗透浓度通常在约20mOsm至约250mOsm的范围内??稍谝栽?体积份样本对约35体积份试剂的比率混合血液样本与试剂之后,使RBC在高于室温的温度(例如在约30℃至约50℃之间,如约40℃)下历经相对较短的时期(例如小于约25秒、小于约17秒、或甚至小于约9秒)发生溶解。
    通常用如上所述的多个光学通道和至少一个荧光通道收集散射和荧光分析数据。
    (3)荧光触发器的使用。
    在由光源激发荧光染料后,血细胞发射不同量级的荧光信号。荧光信号的量级差异由细胞内部的核酸(即DNA)的量产生。DNA的量越大,荧光信号较高的可能性越大。此外,穿透细胞膜的功效、染料大小、染料与DNA之间的结合动力学、染料与DNA之间的亲和力及其它因素也会影响荧光信号。成熟RBC发射最小荧光信号,因为在成熟RBC内不存在DNA。未溶解RBC或RBC片段不发射荧光,但其可发射极弱的自体荧光。嗜碱性粒细胞也已显示具有不同于淋巴细胞的荧光发射特性。
    因此,本文提供的系统和方法使用荧光触发器来收集和分析WBC和WBC子群体。在一个实施方案中,在区别嗜碱性粒细胞/淋巴细胞之前,在来自RBC的信号与来自WBC(和nRBC(当存在时))的信号之间设置荧光触发器。收集的光学和荧光信息可接着用于区分(或区别)WBC子群体。举例而言,二维细胞图可用于鉴定和区分粒子。
    如本文所用,表述“荧光信息”意指从血液学分析仪的荧光通道收集的数据。如本文所用,表述“荧光通道”意指设置在用于测量自样本发射的荧光的量的适当的波段下的检测装置,如光电倍增管。
    实施例
    图2A是含有约1.6%嗜碱性粒细胞的第一血液样本(样本1)的90°偏振侧向散射(PSS)对中等角度散射(IAS)的细胞图。图2B是样本1的轴向光损失(ALL)对IAS的细胞图。通过手动门控使嗜碱性粒细胞100与其余WBC子群体分离。图3A是含有约0.2%嗜碱性粒细胞的第二血液样本(样本2)的PSS对IAS的细胞图。图3B是样本2的ALL对IAS的细胞图。通过手动门控使嗜碱性粒细胞100与其余WBC子群体分离。图2A、2B、3A和3B示出可借助于小角度侧向散射(即IAS,3°-15°)和前向散射(即ALL,0°-2°)分离嗜碱性粒细胞。
    图4是样本1的荧光(FL1)对IAS的细胞图。仅淋巴细胞200、嗜碱性粒细胞100和残余单核细胞300显示于该细胞图中。图5是样本2的FL1对IAS的细胞图。仅淋巴细胞200、嗜碱性粒细胞100和残余单核细胞300显示于该细胞图中。图4和5示出荧光染料染色使得能够在一个或多个荧光维度中进一步分离嗜碱性粒细胞与WBC子群体(例如淋巴细胞)。这种分离是不同WBC子群体之间可能的膜效能、DNA含量和染色效率变化的结果。举例而言,在40℃的温度下持续25秒时间用含有吖啶橙(3μg/mL)的WBC试剂处理WBC导致淋巴细胞的FL1信号通常较高,并且嗜碱性粒细胞的FL1信号较低。因此,可用这样的WBC试剂进一步促进对嗜碱性粒细胞的鉴定和定量?;痪浠八?,当WBC试剂导致嗜碱性粒细胞在与由淋巴细胞(或其它WBC子群体)发射的量级不同的量级下发射荧光时,可借助于荧光发射信号分离嗜碱性粒细胞与淋巴细胞。
    参照图6A-6C和7A-7C显示其它结果。举例而言,图6A、6B、6C显示使用多个维度(即超过两个维度(例如五个维度))分离样本1的嗜碱性粒细胞。更具体来说,图6A是样本1的PSS对IAS的细胞图。图6B是样本1的ALL对IAS的细胞图。图6C是样本1的FL1对IAS的细胞图。通过聚类分析使嗜碱性粒细胞100与其余WBC分离。图7A、7B和7C显示使用多个维度(即超过两个维度(例如五个维度))分离样本2的嗜碱性粒细胞。更具体来说,图7A是样本2的PSS对IAS的细胞图。图7B是样本2的ALL对IAS的细胞图。图7C是样本2的FL1对IAS的细胞图。通过聚类分析使嗜碱性粒细胞100与其余WBC分离。
    还对嗜碱性粒细胞进行综合研究以评估本文所述的系统和方法。在根据本文所述的方法操作的原型分析仪上测量嗜碱性粒细胞百分比在0至约5%的范围内的总计56个血液样本。通过手动门控与聚类分析算法两者分析试样,以便获得嗜碱性粒细胞的浓度,即嗜碱性粒细胞的百分比(或者在本文中称为“BA%”)。在操作中,聚类分析算法应用初始“粗略”聚类,这会产生许多聚类。所述算法接着应用第二“精细”聚类步骤,所述步骤利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素。因此,在这个第二步骤中,聚类中的细胞数不用作决定因素,由此保留具有低细胞(如嗜碱性粒细胞)浓度的聚类。包括ALL、IAS、PSS、DSS和FL1的所有光学和荧光维度都被用于确定嗜碱性粒细胞聚类。
    通过使用双重抗体嗜碱性粒细胞组(CD45和FCεR1),用C6流式细胞仪测量同一组样本来获得参考值。在FL3通道中测量CD45且在FL4通道中测量FCεR1。这个研究的结果显示于图8和9中。更具体来说,图8是显示通过手动门控分析的嗜碱性粒细胞百分比与通过参考流式细胞仪测定的嗜碱性粒细胞百分比的相互关系的图。总计56个样本被测量并且包括在相互关系图中。图9是显示通过聚类分析的嗜碱性粒细胞百分比与通过参考流式细胞仪测定的嗜碱性粒细胞百分比的相互关系的图。总计56个样本被测量且包括在相互关系图中。相互关系如下:
    Y=0.9375X-0.0435;R2=0.9151(参见图8:手动门控对参考值)
    Y=1.0721X+0.0348;R2=0.9144(参见图9:随机聚类对参考值)
    如所示,在本文所述的方法与参考方法(即使用C6流式细胞仪)之间实现了出色的相互关系。也通过巴特查里亚(Bhattacharyya)距离定量评估了嗜碱性粒细胞与淋巴细胞之间的分离。对于56个样本,嗜碱性粒细胞与淋巴细胞之间的平均巴特查里亚距离是4.2±2.0,这表明嗜碱性粒细胞分析总体可靠。仅有七个样本(12.5%)显示次最佳分离(巴特查里亚距离<3.0,但全部>2.5)。
    表1比较参考值(即使用C6流式细胞仪)、手动门控分析、聚类分析和巴特查里亚距离的结果。
    表1
     样本1样本2BA%(参考值)1.600.19BA%(手动门控)1.680.25BA%(聚类分析)1.620.22BA-LY(巴特查里亚距离)4.265.27
    通过最佳化WBC试剂以产生嗜碱性粒细胞和淋巴细胞的不同光学散射信号,以及利用荧光染料染色WBC以发射不同水平的荧光信号,实现了嗜碱性粒细胞与淋巴细胞的满意分离??赏ü疚乃龅姆椒ㄊ迪侄允燃钚粤O赴淖既范?。此外,本文所述的方法是快速、简单和划算的??捎蒙僦烈恢諻BC试剂在1分钟内,通常在30秒内鉴定和定量嗜碱性粒细胞。配制WBC试剂使得嗜碱性粒细胞能够在多个光学维度中和在至少一个荧光维度中被观察为单独群体。此外,鉴定和定量嗜碱性粒细胞可在单一测定中与鉴定和定量所有WBC子群体同时进行。
    其它实施方案
    在一个实施方案中,所述系统和方法包括:(a)通过适当选择表面活性剂、表面活性剂的浓度、适当选择WBC稳定剂、WBC稳定剂的浓度、反应混合物的最终pH和重量克分子渗透浓度来最佳化WBC试剂;(b)在所述WBC试剂中包括用于染色核的染料以染色WBC;以及(c)使用自动聚类算法分析在处理原始数据文件之后出现的嗜碱性粒细胞。原始数据文件可包括具有至少五个维度的信息;即ALL、IAS、PSS、DSS和FL1,以及时间标签和其它相关信息的事件。最佳化组分使得能够在至少一个光学维度中区别嗜碱性粒细胞与淋巴细胞。
    在另一实施方案中,提供一种用于对已用荧光染料染色的血液样本进行嗜碱性粒细胞分析的血液学分析仪,其中所述荧光染料是细胞膜可透性和核酸结合性的。所述分析仪包括被定位来激发血液样本内的粒子的激发源。
    在另一实施方案中,提供一种借助于自动血液学分析仪检测嗜碱性粒细胞的方法。所述方法包括以下步骤:(a)用至少一种白细胞试剂稀释全血样本;(b)在所选温度范围内持续足够时期孵育步骤(a)的所稀释样本以溶解红细胞,保存白细胞,并且使至少一种荧光染料染色白细胞;(c)以液流形式将步骤(b)的所孵育混合物递送至流动池;(d)当所述样本穿过所述流动池时借助于光源激发所述样本;(e)同时收集多个光学散射信号与至少一个荧光发射信号;以及(f)借助于步骤(e)中收集的光学散射信号和荧光发射信号鉴定和定量嗜碱性粒细胞。所述至少一种白细胞试剂可包含:(a)至少一种表面活性剂;(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐或至少一种缓冲剂和至少一种盐;(c)至少一种抗微生物剂;以及(d)至少一种荧光染料,其中配制所述至少一种白细胞试剂使得嗜碱性粒细胞能够在多个光学维度中和在至少一个荧光维度中被观察为单独群体??稍诎紫赴钜旆治銎诩?,在不使用仅指定用于检测和分析嗜碱性粒细胞的试剂下检测和分析嗜碱性粒细胞??山柚谛〗嵌炔嘞蛏⑸浜颓跋蛏⑸浞掷胧燃钚粤O赴肓馨拖赴?。当嗜碱性粒细胞在与由淋巴细胞发射的量级不同的量级下发射荧光时,可借助于荧光发射信号分离嗜碱性粒细胞与淋巴细胞??山柚诠庋畔⒂胗庑畔⒘秸叻治鍪燃钚粤O赴???赏ü褂枚喔龉庋畔⑽群椭辽僖桓鲇庑畔⑽?,借助于随机聚类区别 嗜碱性粒细胞。光源的波长可为约350nm至约700nm??赏ü斯馄虺ね斯馄谠?60nm至约700nm下收集荧光发射。鉴定和定量嗜碱性粒细胞可在单一测定中与鉴定和定量其余白细胞同时进行。
    在另一实施方案中,提供一种借助于自动血液学分析仪检测嗜碱性粒细胞的方法,所述方法包括以下步骤:(a)用至少一种白细胞试剂稀释全血样本;(b)在所选温度范围内持续足够时期孵育步骤(a)的所稀释样本以溶解红细胞,保存白细胞,并且使至少一种荧光染料染色白细胞;(c)以液流形式将步骤(b)的所孵育混合物递送至流动池;(d)当所述样本穿过所述流动池时借助于光源激发所述样本;(e)同时收集多个光学散射信号与至少一个荧光发射信号;以及(f)借助于步骤(e)中收集的光学散射信号和荧光发射信号鉴定和定量嗜碱性粒细胞。
    本文所述的系统和方法的一个特征包括借助于多角度偏振散射分离技术分离嗜碱性粒细胞与嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。嗜碱性粒细胞和其它三个白细胞子群体显示测量0°散射的轴向光损失通道(ALL)、测量3°-15°散射的中等角度散射通道(IAS)、90°偏振侧向散射通道(PSS)和90°去偏振侧向散射通道(DSS)的实质上不同信号。所述方法的另一特征涉及通过光学散射信息(如IAS信息、ALL信息和PSS信息)和荧光信息分离嗜碱性粒细胞与淋巴细胞。
    在另一实施方案中,提供一种用于对已用荧光染料染色的血液样本进行嗜碱性粒细胞分析的血液学分析仪,其中所述荧光染料是细胞膜可透性和核酸结合性的。所述分析仪包括被定位来激发血液样本内的粒子的激发源。所述激发源可为激光器。所述分析仪进一步包括多个检测器,包括:(1)轴向光损失检测器,其被定位来测量所激发血液样本的轴向光损失;(2)中等角度散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的中等角度散射;(3)侧向散射检测器,其被定位来测量所激发血液样本的90°侧向散射;以及(4)荧光检测器,其被定位来测量自所激发血液样本发射的荧光。轴向光损失检测器可测量在0°散射下的轴向光损失。中等角度散射检测器可测量在约3°至约15°下的光角度散射。多个检测器可包括一个或多个光电倍增管。所述分析仪进一步包括处理器,其被配置来:(a)接收来自多个检测器的(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°侧向散射以及(4)荧光的测量结果,并且(b)基于所有四种测量结果进行血液样本的嗜碱性粒细胞聚类分析。嗜碱性粒细胞聚类分析可包括所接收的测量结果的粗略聚类。嗜碱性粒细胞聚类分析可进一步包括利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素来对所接收的测量结果进行精细聚类。
    侧向散射检测器可为被定位来测量所激发血液样本的90°偏振侧向散射的偏振侧向散射检测器。因此,处理器可进一步被配置来基于(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振侧向散射以及(4)荧光的测量结果区分血液样本内的嗜碱性粒细胞与血液样本内的淋巴细胞。所述分析仪也可包括被定位来测量所激发血液样本的90°去偏振侧向散射的去偏振侧向散射 检测器。处理器可进一步被配置成基于(1)轴向光损失、(2)中等角度散射以及(3)90°侧向散射的测量结果区分血液样本内的嗜碱性粒细胞与血液样本内的嗜中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞。处理器可进一步被配置成预筛查所接收的测量结果以排除对不满足荧光阈值的任何粒子的考虑。
    血液学分析仪可进一步包括用于以试剂稀释血液样本的孵育子系统。试剂可包括荧光染料和溶解剂(lysing agent,裂解剂)。试剂可包括:(a)至少一种表面活性剂;(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐;(c)至少一种抗微生物剂;以及(d)荧光染料。孵育子系统可被配置成持续小于约30秒的时期以试剂孵育血液样本。孵育子系统可被配置成在范围从约30℃至约50℃的温度下以试剂孵育血液样本。孵育子系统可被配置成在约40℃的温度下以试剂孵育血液样本。
    在另一实施方案中,提供一种用自动血液学分析仪进行嗜碱性粒细胞分析的方法。所述方法包括:(a)用试剂稀释全血样本,其中所述试剂包括红细胞(RBC)溶解剂和细胞膜可透性核酸结合荧光染料;(b)在范围从约30℃至约50℃的温度下持续小于约30秒的孵育期孵育步骤(a)的所稀释血液样本;(c)将来自步骤(b)的所孵育样本递送至血液学分析仪中的流动池;(d)当所孵育样本横穿过所述流动池时,用激发源激发来自步骤(c)的所述孵育样本;(e)收集来自所述激发样本的多个光散射信号和荧光发射信号;以及(f)基于步骤(e)中收集的所有信号进行嗜碱性粒细胞聚类分析。嗜碱性粒细胞聚类分析可包括所收集信号的粗略聚类。嗜碱性粒细胞聚类分析可进一步包括利用多维可能性距离量度作为组合类似聚类的决定因素来对收集信号进行精细聚类。试剂可包括:(a)至少一种表面活性剂;(b)至少一种缓冲剂或至少一种盐;(c)至少一种抗微生物剂;以及(d)至少一种荧光染料。激发源的波长可为约350nm至约700nm。激发源的波长可为约488nm。多个光散射信号可包括:(1)轴向光损失、(2)中等角度散射以及(3)90°侧向散射。多个光散射信号可另外包括:(1)轴向光损失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振侧向散射以及(4)90°去偏振侧向散射。
    在一个实施方案中,本发明涉及一种或多种能够执行本文所述的功能性的计算机系统。举例而言,本文论述的任何方法/分析步骤都可在具有一个或多个处理器、数据通信基础结构(例如通信总线、交叉条或网络)、显示器接口和/或存储体或存储单元的计算机系统中实施。存储体或存储单元可包括具有在执行时使处理器执行本文所述的一个或多个功能的指令(例如控制逻辑或软件)的计算机可读存储介质。术语“计算机可读存储介质”、“计算机程序介质”和“计算机可用介质”用于泛指介质,如可移动存储驱动器、可移动存储单元、通过通信接口传输的数据和/或安装在硬盘驱动器中的硬盘。所述计算机程序产品向计算机系统提供计算机软件、指令和/或数据,所述计算机程序产品也用于将所述计算机系统从通用计算机转变成被编程以执行本文所述的特定功能的专用计算机。当 适当时,处理器、相关部件和等效系统以及子系统因此充当用于执行所选操作和功能的“装置”的实例。用于执行所选操作和功能的这类“装置”也用于将通用计算机转变成被编程来执行所述所选操作和功能的专用计算机。
    因此,所述系统和方法提供一种在自动血液学分析仪上检测和分析嗜碱性粒细胞的快速、简单、低成本方法。测定可在1分钟内进行,包括至多30秒的样本孵育和至多10秒的样本测量??墒褂靡恢职紫赴约晾慈芙夂煜赴⑶仪鸢紫赴?,包括白细胞的最不常见子群体,即嗜碱性粒细胞。
    结论
    已出于说明和描述目的提出本发明的以上描述。本篇描述不意图是详尽的或将本发明限于所公开的精确形式。鉴于以上教导,其它修改和变化可为可能的。选择和描述实施方案是为最佳地说明本发明的原理和它的实际应用,并且由此使得本领域其他技术人员能够最佳地利用如适于所考虑的特定用途的各种实施方案和各种修改形式中的发明内容。意图将随附权利要求解释为包括本发明的其它替代性实施方案;包括等效结构、部件、方法和装置。
    以上详述涉及说明一个或多个示例性实施方案的附图。其它实施方案是可能的??稍诓煌牙氡痉⒚鞯木窈头段露运鍪凳┓桨附行薷?。因此,详述不意图具有限制性。此外,概述和摘要章节可阐述本发明的一个或多个而非所有如由发明者所设想的示例性实施方案,并且因此不意图以任何方式限制本发明和随附的权利要求。

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