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    重庆时时彩技巧代理: 用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法及其应用.pdf

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    用于 评价 扶正 注射液 化学成分 方法 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201310008395.5

    申请日:

    2013.01.09

    公开号:

    CN103913533A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20130109|||公开
    IPC分类号: G01N30/88; G01N30/06 主分类号: G01N30/88
    申请人: 丽珠集团利民制药厂; 中山大学
    发明人: 苏薇薇; 王锦旭; 童欣; 曹晖; 李沛波; 彭维; 王永刚
    地址: 512028 广东省韶关市工业西路89号
    优先权:
    专利代理机构: 北京泛华伟业知识产权代理有限公司 11280 代理人: 刘丹妮
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310008395.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.08.24|||2014.08.06|||2014.07.09

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法,该方法包括以下步骤:(1)制备参芪扶正注射液的供试品;(2)制备差异样品;(3)测定差异样品的指纹图谱;(4)测定差异样品的药效;(5)进行谱效关系分析,以评价共有峰的药效活性。通过采用本发明的方法,发明人得知参芪扶正注射液指纹图谱的9号峰、11号峰、12号峰、15号峰、20号峰为活性成分,5号峰和/或13号峰为负相关成分,有利于对中药药品质量、安全性和有效性进行控制。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
    (1)制备供试品:取每ml含0.5~1g党参和0.5~1g黄芪的参芪扶正注射液作为供试品;
    (2)制备差异样品:使用高速逆流色谱法分离所述供试品,分别收集90~125min、125~183min、183~210min的分离液体和管路液体,分别作为第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品,然后按照四因素九水平均匀设计表勾兑所述第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品,得到差异样品1~9;
    (3)测定差异样品的指纹图谱:采用高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术对步骤(2)所得的差异样品1~9分别进行指纹图谱测定,并确定23个共有峰;
    (4)测定差异样品的药效:将差异样品1~9分别稀释至适当浓度后,向经环磷酰胺处理的小鼠分别进行注射,然后测定包括脾脏指数、外周血白细胞数、骨髓细胞数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清IL-2水平的药效学指标;
    (5)谱效关系分析:采用包括灰色关联分析、多元线性回归分析和主成分分析的方法,分析步骤(3)所得的指纹图谱与步骤(4)所得的各药效学指标之间的关系,以评价共有峰的药效活性。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中,高速逆流色谱法的溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水,将溶剂静置分层,取上相为固定相,下相为流动相,六通阀接法为正接正转,转速为800~900rpm,以1.5~2ml/min的流速将流动相泵入,建立动态平衡后上样步骤(1)所得的供试品,再进行所述的收集;优选地,所述转速为900rpm,泵入流动相的流速为2ml/min;更优选地,所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比为4:1:5。

    3.  根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在步骤(1)中,取每ml含党参、黄芪各0.5g的参芪扶正注射液,经0.45μm微孔滤膜滤过,取 续滤液,作为供试品;优选地,步骤(2)中的上样之前,将250ml的所述供试品浓缩至20ml,旋蒸至干后以5ml所述溶剂体系溶解,然后进行上样。

    4.  根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其特征在于,所述四因素九水平均匀设计表的九个水平分别为0、12.5%、25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、100%。

    5.  根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(3)中,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以DionexPolar Advantage C18(3μm,50mm×3.0mm)为前处理柱,以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5μm,150mm×3.0mm)为分析柱,柱温为30℃;优选地,采用在线前处理模式,将所述差异样品1~9分别从进样器进样后,由预处理流动相通过装载泵带入前处理柱,并于进样后1.2min切换至前处理柱与分析柱相连的状态,由分析泵用分析流动相将前处理后的差异样品正冲入分析柱进行分离分析;更优选地,所述预处理流动相为2%乙腈;所述分析流动相为作为流动相A的乙腈和作为流动相B的水。

    6.  根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其特征在于,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件还包括:采用二极管陈列检测器和蒸发光散射检测器相互串联的方式进行图谱采集;优选地,在0~33min时采用二极管阵列检测器进行检测,在33~40min采用蒸发光散射检测器进行检测;更优选地,所述二极管阵列检测器的检测波长在0~23.5min时为266nm,在23.5~33min时为208nm;更优选地,在蒸发光散射检测器的检测中,N2的压力为3.5bar,漂移管温度为60℃,增益值为10。

    7.  根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其特征在于,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术按照以下条件进行梯度洗脱:

    优选梯度洗脱的流速为0.6ml/min;更优选地,梯度洗脱的理论板数按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷峰计算不低于3000。

    8.  根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(4)中,所述小鼠为Balb/c小鼠。

    9.  根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(5)中,所述灰色关联分析包括如下步骤:
    1)将各差异样品的药效学指标组成参考数列,将各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列;
    2)对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理;优选采用均值化方法进行处理;
    3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列,计算各共有峰与药效之间的关联度;
    4)对步骤3)所得关联度进行排序,以评价共有峰的药效活性。

    10.  根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其特征在于,共有峰药效活性的评价结果为:9号峰、11号峰、12号峰、15号峰、20号峰为活性成分;所述9号峰为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,11号峰为异微凸剑叶莎醇-7,2`-二-O-葡萄糖苷,12号峰为鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷,15号峰为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷,20号峰为黄芪甲苷;优选地,5号峰为负相关成分,所述5号峰为5-羟甲基糠醛;更优选地,13号峰也为负相关成分,所述13号峰为党参炔苷。

    说明书

    说明书用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法及其应用
    技术领域
    本发明涉及一种评价中药化学成分的方法,具体涉及一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法,以及该方法的应用。 
    背景技术
    党参(Radix Codonopsis)药性平和,用途广,具有多方面的药理活性,不仅对消化、心血管系统有作用,还能调节免疫系统功能,增强机体的抵抗力,毒性甚微?;栖危≧adix Astragalus)是补气主药,能明显增加巨噬细胞的吞噬功能,与党参合用,能使巨噬细胞吞噬有害物质的作用增强。 
    参芪扶正注射液是由党参、黄芪经提取制成的纯中药制剂,以益气扶正为主。党参和黄芪两种药物的性味及归经一致,功效基本相同,两者相加,起到君臣佐使、相使的协同作用,明显增强了临床疗效。 
    然而,在参芪扶正注射液的现行质量标准中,原质量标准指纹图谱中仅关注了S峰(毛蕊异黄酮苷)和极性较大的水溶性成分,以及关注了含量测定项下的黄芪甲苷含量,难以评估参芪扶正注射液中的各活性成分,及其负相关成分,不利于对产品的安全性和有效性进行标准控制。 
    因此,在参芪扶正注射液的生产过程中,还需要寻求一种能够有效评价和筛选其活性成分以及负相关成分的有效方法。 
    发明内容
    因此,本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷,提供了一种能够较为全面地评价参芪扶正注射液化学成分的方法以及该方法的应用,以帮助建立更为合理、有效的中药质量控制模式。 
    本发明提供了一种用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法,该方法包括以下步骤: 
    (1)制备供试品:取每ml含0.5~1g党参和0.5~1g黄芪的参芪扶正注射液作为供试品; 
    (2)制备差异样品:使用高速逆流色谱法(HSCCC)分离所述供试品,分别收集90~125min、125~183min、183~210min的分离液体和管路液体,分别作为第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品,然后按照四因素九水平均匀设计表勾兑所述第一部分样品、第二部分样品、第三部分样品和第四部分样品,得到差异样品1~9;换言之,从90min开始收集第一部分样品,从125min开始收集第二部分样品,从183min开始收集第三部分样品,至210min。所述管路液体是指在收集完第三部分样品之后,管路中剩余的溶有供试品的流动相。 
    (3)测定差异样品的指纹图谱:采用高效液相色谱法(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)-蒸发光散射检测器(ELSD)联用技术对步骤(2)所得的差异样品1~9分别进行指纹图谱测定,并确定23个共有峰; 
    (4)测定差异样品的药效:将差异样品1~9分别稀释至适当浓度后,向经环磷酰胺处理的小鼠分别进行注射,然后测定包括脾脏指数、外周血白细胞数、骨髓细胞数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力和血清IL-2水平的药效学指标; 
    (5)谱效关系分析:采用包括灰色关联分析、多元线性回归分析和主成分分析的方法,分析步骤(3)所得的指纹图谱与步骤(4)所得的各药效学指标之间的关系,以评价共有峰(及其所代表的化学物质)的药效活性。 
    所述灰色关联分析,在本领域通常是指根据各比较数列构成的曲线与参考数列构成的曲线之间的几何相似程度来确定比较数列与参考数列间的关联度。几何形状越接近,关联程度越大。在本发明中,发明人将各药效学指标处理为参考数列,将各差异样品的各共有峰面积处理为比较数列,用于计算各共有峰与药效学指标之间的关联度,并进行排序。 
    所述多元线性回归分析,在本领域通常是指自变量为多个且因变量为一个时的线性回归分析。 
    所述主成分分析,在本领域通常是指将原来众多具有一定相关性指标,重新组合成一组新的互相无关的综合指标来代替原来指标的一种统计分析方法。 
    另外,在确定了23个共有峰之后,还可依据差异样品1~9的23个共有峰的峰面积进行聚类分析,用于辅助后续的谱效关系分析。 
    根据本发明的方法,其中,步骤(2)中,高速逆流色谱法的溶剂体系 为乙酸乙酯-正丁醇-水,将溶剂静置分层,取上相为固定相,下相为流动相,六通阀接法为正接正转,转速为800~900rpm,以1.5~2ml/min的流速将流动相泵入,建立动态平衡后上样步骤(1)所得的供试品,再进行所述的收集。作为优选,所述转速可以为900rpm,泵入流动相的流速可以为2ml/min。作为更优选,所述乙酸乙酯-正丁醇-水的体积比可以为4:1:5。 
    根据本发明的方法,其中,在步骤(1)中,取每ml含党参、黄芪各0.5g的参芪扶正注射液,经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品。作为优选,在步骤(2)中的上样之前,将250ml的所述供试品浓缩至20ml,旋蒸至干后以5ml所述溶剂体系溶解,然后进行上样。 
    根据本发明的方法,其中,所述四因素九水平均匀设计表的九个水平分别为0、12.5%、25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、100%。更具体的,所述四因素九水平均匀设计表可以如下表1: 
    表1四因素九水平均匀设计表(差异样品勾兑方案) 

    根据本发明的方法,其中,在步骤(3)中,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件包括:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以DionexPolar Advantage C18(3μm,50mm×3.0mm)为前处理柱,以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5μm,150mm×3.0mm)为分析柱,柱温为30℃。作为优选,可以采用在线前处理模式,将所述差异样品1~9分别从进样器进样后,由预处理流动相通过装载泵带入前处理柱,并于进样后1.2min切换至前处理柱与分析柱相连的 状态,由分析泵用分析流动相将前处理后的差异样品正冲(与前处理柱同向)入分析柱进行分离分析。作为更优选,所述预处理流动相为2%乙腈;所述分析流动相为作为流动相A的乙腈和作为流动相B的水。 
    根据本发明的方法,其中,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术的条件还包括:采用二极管陈列检测器和蒸发光散射检测器相互串联的方式进行图谱采集;优选地,在0~33min时采用二极管阵列检测器进行检测,在33~40min采用蒸发光散射检测器进行检测;更优选地,所述二极管阵列检测器的检测波长在0~23.5min时为266nm,在23.5~33min时为208nm;更优选地,在蒸发光散射检测器的检测中,N2的压力为3.5bar,漂移管温度为60℃,增益(Gain)值为10。 
    根据本发明的方法,其中,所述高效液相色谱法-二极管阵列检测器-蒸发光散射检测器联用技术按照以下条件进行梯度洗脱: 

    作为优选,梯度洗脱的流速可以为0.6ml/min。作为更优选,梯度洗脱的理论板数按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷峰计算可不低于3000。 
    根据本发明的方法,其中,在步骤(4)中,所述小鼠为Balb/c小鼠。 
    根据本发明的方法,其中,在步骤(5)中,所述灰色关联分析(GRA)包括如下步骤: 
    1)将各差异样品的药效学指标组成参考数列,将各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列; 
    2)对所述参考数列和比较数列进行无量纲化处理;优选采用均值化方法进行处理; 
    3)根据步骤2)所得无量纲化的参考数列和比较数列,计算各共有峰 与药效之间的关联度; 
    4)对步骤3)所得关联度进行排序,以评价共有峰的药效活性。 
    更具体地,在计算关联度的过程中,可以按照本领域技术人员常用的下式计算关联系数: 
    ξi(k)=minimink|y(k)-xi(k)|+ρmaximaxk|y(k)-xi(k)||y(k)-xi(k)|+ρmaximaxk|y(k)-xi(k)|]]>
    其中,y(k)表示参考数列,xi(k)表示比较数列,ρ为分辨系数,通常取0.5。 
    然后再按照下式计算关联度: 
    ri=1nΣk=1nξi(k),k=1,2,Λ,n]]>
    所述均值化方法,在本领域通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时,保留了各变量取值差异程度上的信息,也保留了数据的可比性。 
    根据本发明的方法,其中,在步骤(5)中,所述多元线性回归分析包括如下步骤:以指纹图谱的数据为自变量,以药效学指标为因变量,并均进行无量纲化处理,可优选采用均值化方法,然后分别计算各个自变量对因变量的相关系数,例如Pearson相关系数,再采用选自包括逐步回归法(Stepwise)、强迫引入法(Enter)、强迫剔除法(Remove)、向后引入法(Backward)和向前剔除法(Forward)中的一种或多种方法,优选采用逐步回归法和/或向前剔除法,分别建立多元线性回归方程,以评价共有峰的药效活性。作为优选,所述多元线性回归分析在SPSS16.0中,通过分析(Analyze)项目下的回归(Regression)中的线性(Linear)??槭迪?。 
    根据本发明的方法,其中,在步骤(5)中,所述主成分分析包括:以指纹图谱的数据为自变量,以药效学指标为因变量,并均进行无量纲化处理,然后将原先具有一定相关性的自变量重新组合成一组新的相互无关的自变量作为主成分,用主成分对因变量进行回归分析,以评价共有峰的药效活性。作为优选,所述主成分分析在SPSS16.0中,通过分析(Analyze)项目下的数据简化(Data Reduction)中的因子分析(Factor Analysis)??槭迪?。 
    根据本发明的方法,其中,共有峰药效活性的评价结果为:9号峰、11号峰、12号峰、15号峰、20号峰为活性成分;所述9号峰为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,11号峰为异微凸剑叶莎醇-7,2`-二-O-葡萄糖苷,12号峰为鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷,15号峰为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷,20号峰为黄芪甲苷。作为优选,5号峰为负相关成分,所述5号峰为5-羟甲基糠醛。作为更优选,13号峰也为负相关成分,所述13号峰为党参炔苷。 
    本发明还提供了上述方法在评价参芪扶正注射液的化学成分中的应用。作为优选,所述评价参芪扶正注射液的化学成分用于筛选参芪扶正注射液的活性成分和负相关成分。 
    本发明还提供了一种参芪扶正注射液的质量控制方法,所述质量控制方法包括按照本发明的上述方法评价参芪扶正注射液的化学成分的步骤。 
    由于参芪扶正注射液是已经上市的中药注射剂成品,临床疗效显著,其药材来源为GAP认证基地,且已经过化学物质基础研究。本发明创造性地以高速逆流色谱法将参芪扶正注射液分离成若干个有效成分群,再根据均匀试验设计进行组合、配比、勾兑,得到可供指纹谱效学研究的参芪扶正注射液差异样品。 
    本发明的谱效关系分析从数学的观点来看,其实质是研究多个自变量与一个因变量间的关系程度。本发明通过采用灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析等统计学方法,对参芪扶正注射液差异样品的指纹图谱信息与药效信息进行相关性处理,以三种统计学方法之间相互结合、相互补充,较为全面地反映了中药谱效之间的关系,明确中药当中与药效关系最为密切的化学成分,为建立更为合理的中药质量控制模式提供依据。 
    采用本发明的方法对参芪扶正注射液的化学成分进行评价的结果显示,毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、异微凸剑叶莎醇-7,2`-二-O-葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷、9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷和黄芪甲苷对药效具有正相关作用且贡献较大,为参芪扶正注射液主要药效成分(活性成分)。同时还发现5-羟甲基糠醛对药效起负相关作用,即5-羟甲基糠醛本身及其降解产物都可能导致药物不良反应的发生,这预示着5-羟甲基糠醛极可能属于参芪扶正注射液中无药效甚至是影响药效的杂质成分(负相关成分),需要进行监控,以确保产品安全性和有效性。这样,本发明为参芪扶正注射液的质量控制提供了更为全面和准确的谱效基础。 
    本发明将中药的指纹图谱和其生物活性(药效)相互结合,通过合适的分析方法明确中药的生物活性物质基础,并可将之列为药材质量控制中的重点监控对象。 
    事实上,本发明的方法也可在其他中药或者药材的化学成分评价、筛选和质量控制中加以推广应用。其应用方法大致可归纳如下: 
    1.建立尽可能反映待研究中药或药材中全化学物质的指纹图谱方法,并采用合适的提取精制手段,得到足够多的、且化学信息具有显著的差异的样品进行指纹图谱分析,获取其指纹特征信息; 
    2.选择能反映待研究中药或药材的药效的指标,要求能反映中药特征及临床适应症、灵敏度高、能反映化学组分群变化,并对化学信息具有显著的差异的样品进行药效实验,获取其药效信息; 
    3.通过将中药或药材的指纹图谱与其药效相结合,运用计算机辅助技术分析指纹图谱中所反映的各化学物质对药效的贡献程度,明确中药的生物活性(药效)物质基础。 
    附图说明
    以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中: 
    图1示出了HSCCC采用乙酸乙酯-乙醇-水4:1:6作为溶剂体系时,所得HPLC-DAD-ELSD图谱的对比。 
    图2示出了HSCCC采用乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5作为溶剂体系时,所得HPLC-DAD-ELSD图谱的对比。 
    图3示出了SFI的HSCCC色谱图及样品收集的时间节点,其中A:90~125min;B:125~155min;C:155~183min;D:183~210min;E:210~270min;F:管路液体。 
    图4A和4B示出了HSCCC收集的六个部分样品的HPLC-DAD-ELSD图谱。 
    图5A和5B示出了HSCCC连续七日收集共8组、每组四个部分的样品的HPLC-DAD-ELSD图谱的重复性比较。 
    图6A和6B示出了HSCCC收集四个部分样品的HPLC-DAD-ELSD的参照图谱。 
    图7示出了有机溶剂残留测定的专属性试验GC图谱,其中A为混合对照品;B为乙酸乙酯;C为乙醇;D为乙酸丁酯;E为正丁醇;F为空白 溶剂;G为阴性溶液。 
    图8示出了本发明测得的差异样品1~9的指纹图谱。 
    图9示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对脾脏指数的作用(其中:*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图10示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对外周血细胞数的作用(其中,*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图11示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对骨髓细胞数的作用(其中,*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图12示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对脾淋巴细胞增殖能力的作用(其中,*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图13示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对脾NK细胞活性的作用(其中,*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图14示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对腹腔巨噬细胞吞噬能力的作用(其中,*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图15示出了各组(主要是rhG-CSF阳性组和差异样品1~9组)对血清IL-2水平的作用(其中,*P<0.05and**P<0.01vs.正常组,#P<0.05and##P<0.01vs.模型组(n=10))。 
    图16示出了通过本发明的方法得到的参芪扶正注射液的药效指纹图谱。 
    具体实施方式
    下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。 
    本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的, 但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚,在上下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。 
    本发明在具体的实施方式中可采用的试验材料和仪器的相关信息如下: 
    1.动物 
    Balb/c小鼠,近交系,SPF级,120只,雌雄各半,体重18g左右,购自广东省医学动物实验中心,实验动物质量合格证明号No.0097913。动物饲养于中山大学南校区时珍堂SPF级动物房(许可证号码:SYXK(粤)2004-0020),经中山大学生命科学学院动物伦理委员会批准,饲养一周后进行实验,地点为中山大学南校区曾宪梓堂南院607室,实验过程中采取适当的方法减轻对动物的伤害。 
    2.细胞株、药物、供试品 
    细胞株:小鼠淋巴瘤细胞YAC-1(TCM28),用于鼠源NK细胞活性检测,购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。 
    药物:注射用环磷酰胺Cy(山西普德药业有限公司,国药准字H14023686,批号20091102,规格0.2g/支×10);重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF(瑞白,山东齐鲁制药有限公司,国药准字S20033040,批号20100213,规格每支1.2×107IU/200μg);氯化钠注射液(NS)(广东利泰制药股份有限公司,国药准字H20043472,批号11081252,规格500ml)。 
    供试品:参芪扶正注射液SFI(批号SQPX100101,每ml含党参、黄芪各0.5g)。 
    3.试剂 
    伴刀豆球蛋白A,ConA(Sigma C2010,来源自Canavalia ensiformis,Type IV,冻干粉,规格25mg);脂多糖LPS(Sigma L2880,来源自Escherichiacoli055:B5,冻干粉,规格100mg);3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝MTT(Sigma M2128,规格1g);台盼蓝Trypan Blue(Sigma T6146,规格5g);可溶性淀粉Soluble Starch(Sigma S9765,规格100g);肝素钠Heparin Sodium Salt(Sigma H4784,来源自porcine intestinal mucosa,规格1g);结晶紫Crystal Violet(Sigma C0775,规格5g);中性红Neutral Red(Sigma N7005,规格5g);二甲基亚砜DMSO(Sigma D4540,规格100ml);RPMI1640Medium powder(Gibco,31800-014,规格1L);胎牛血清FBS(TBD,规格100ml)。 
    Na2HPO4·12H2O(20091014)、NaCl(20091130)、KH2PO4(20090911)、 KCl(20080412),N,N-二甲基甲酰胺DMF(20090425)购自广州光华化学厂有限公司;三羟甲基氨基甲烷Tris(20090826,北京鼎国生物科技有限公司);NH4Cl(20060206),无水乙醇(20110901),正丁醇(20110901),乙酸乙酯(20110902)购自广州化学试剂厂;乙酸丁酯(080710,天津富宇精细化工有限公司);NaHCO3(20091115,天津广成化学试剂有限公司);无水乙醇20100325、冰醋酸20100221(天津大茂化学试剂厂);乙腈(Burdick&Jackson,Honeywell)为色谱纯,水为超纯水,其余化学试剂均为分析纯。 
    试剂盒:小鼠白细胞介素-2(IL-2)酶联免疫分析(ELISA,美国R&D公司)。 
    4.仪器 
    双梯度高效液相色谱仪(Ultimate3000DGLC,Dionex,Thermo Fisher)配备双三元低压梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、切换阀、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器;高速逆流色谱仪(TBE300A,上海同田生物技术有限公司)配备脉冲泵、恒温循环器、紫外检测仪;气相色谱仪(6890N,Agilent Technologies)配备自动进样器、FID检测器、氢气发生器;旋转蒸发仪(N-1000,日本EYELA公司);台式高速冷冻离心机(5430R,德国Eppendorf公司);微孔板恒温振荡器(MB100-2A,杭州奥盛仪器有限公司);洗板机(Wellwash4MK2,美国Thermo公司);移液器(Research Plus10、100、200、1000μl,德国Eppendorf公司);十万分之一电子天平(BP211D,瑞士Sartorius公司);电热恒温水浴锅(HWS24,上海一恒科学仪器有限公司);超纯水器(美国Millipore公司);倒置显微镜(AE21,加拿大Motic公司);全自动倒置荧光显微镜(Axio observer Z1,德国蔡司Zeiss公司);超净工作台(AIR TECH,国产);CO2细胞培养箱(美国Thermo公司);高压灭菌锅(HVE-50,日本HIRAYMA公司);多功能酶标仪(Infinite M200,瑞士Tecan公司);分液漏斗、烧杯、锥形瓶、茄形瓶、滴管、移液管等玻璃仪器。 
    色谱柱型号:XB-C18,5μm,4.6×10mm,Ultimate;Acclaim PA,3μm,3.0×50mm,Dionex;ZORBAX Eclipse Plus C18,3.5μm,3.0×150mm,Agilent;DB-WAX,Length30m,I.D.0.250mm narrow bore,Film0.25μm,Temperature Limits20-250℃(260℃),J&W Scientific。 
    实施例1:HSCCC分离条件的筛选
    1.实验方法 
    HSCCC溶剂体系的筛?。喝〔诬畏稣⑸湟篠FI经0.45μm滤膜滤过后以HPLC-DAD-ELSD直接进样75μl,测得共有峰面积A1;另取SFI5ml置于已平衡的溶剂体系(不同比例的乙酸乙酯-乙醇-水和乙酸乙酯-正丁醇-水)中充分振荡,静置后取水相(下层溶液)旋蒸回收溶剂至干,以水超声溶解并定容至5ml,经0.45μm滤膜滤过后直接进样75μl,测得共有峰面积A2,计算分配系数K值。 
    HSCCC收集时间的筛?。号渲凭秆〉娜芗撂逑?,通过进样分离,将分离后的各部分样品通过HPLC-DAD-ELSD进样分析,最终确定HSCCC分离方法。 
    2.实验过程及结果 
    (1)HSCCC溶剂体系的筛选 
    利用分液漏斗对SFI进行液液萃取,筛选乙酸乙酯-乙醇-水和乙酸乙酯-正丁醇-水这两种HSCCC溶剂体系,测定各自的分配系数K值,结果见图1~2和表2~3。 
    表2乙酸乙酯-乙醇-水4:1:6的各共有峰的分配系数K值 

    表3乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5的各共有峰的分配系数K值 

    从表2中可以看到,各共有峰的K值大部分都分布在0.5以内,从K值分布大致可分为0~0.5和1~3.5两个部分,无法达到预期分离目的。另外,发明人还尝试了乙酸乙酯-乙醇-水的不同比例体系(4:0.5:6和4:1.5:6),但均无法对K值分布进行改善,故改用正丁醇代替乙醇进行筛选。 
    将乙醇替换为正丁醇加入溶剂体系后,发明人首先尝试了乙酸乙酯-正丁醇-水的1:4:5和2:3:5两个溶剂体系,K值分布均不理想,因而改为乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5,从表3的K值分布可以看出,大致分为0~0.5、0.5~1.5、1.5~3、3~+∞四个部分,因此,发明人选择采用该溶剂体系上机进行HSCCC实验。 
    (2)HSCCC收集时间的筛选 
    经过对HSCCC溶剂体系的筛选,发明人将HSCCC的条件确定为: 
    溶剂体系:乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5,上相为固定相,下相为流动相;上样量:250ml SFI浓缩至20ml上样,旋蒸至干后以5ml溶剂体系溶解备用;流速:1.5~2ml/min,可优选2ml/min;六通阀接法:正接正转;转速:800~900rpm,可优选900rpm;检测波长:254nm。 
    然后确定样品收集的时间节点(手动收集),进样后分为六个部分收集,见图3,分别是:A:90~125min;B:125~155min;C:155~183min;D:183~210min;E:210~270min;F:管路液体。收集各部分后回收溶剂至干,分别加入10ml水溶解,以HPLC-DAD-ELSD检测分析,以确定合适的时间节点,结果见图4和表4。 
    表4参芪扶正注射液HSCCC六个部分的共有峰分布 

    发明人根据表4的结果,可确定HSCCC分离的各部分的时间节点,即将A作为第一部分、B和C合为第二部分、D作为第三部分、E和F合为第四部分,分别是:90~125min(12个成分)、125~183min(4个成分)、183~210min(4个成分)和管路液体(6个成分),进样分离时间为210min,每天试验时间为8h。 
    实施例2:差异样品的制备
    1.实验方法: 
    (1)HSCCC方法的重复性考察:采用实施例1中所筛选的HSCCC的分离条件(条件如下述a)收集四个部分的液体,重复操作七次,进行HPLC-DAD-ELSD指纹图谱分析(条件如下述b),以中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2009版)考察HSCCC方法的重复性。 
    A.溶剂体系:乙酸乙酯-正丁醇-水4:1:5,静置后,取上相为固定相,下相为流动相;上样量:250ml SFI浓缩至20ml,旋蒸至干后以5ml溶剂体系溶解备用;流速:2ml/min;六通阀接法:正接正转;转速:900rpm;检测波长:254nm;样品收集:90~125min、125~183min、183~210min和管路液体。 
    B.运用Dionex Ultimate3000DGLC双梯度高效液相色谱仪,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以DionexPolar Advantage C18(3μm,50mm×3.0mm)为前处理柱,以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.5μm,150mm×3.0mm)为分析柱,柱温30℃。运用在线前处理模式,样品从进样器进样后,由预处理流动相(2%乙腈)通过装载泵带入前处理柱,并于上样后1.2min将阀切换至使前处理柱与分析柱相接状态,分析泵用分析流动相将被测组分正冲(与前处理柱同向)入分析柱分离分析。采用二极管阵列检测器(DAD)-蒸发光散射检测器(ELSD)串联的方式进行图谱采集,0~33min采用DAD检测,其中检测波长0~23.5min为266nm,于23.5min后将波长切换为208nm;33~40min采用ELSD检测,N2的压力为3.5bar,漂移管温度为60℃,增益Gain值为10。分析流动相以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按下表5进行梯度洗脱,流速为0.6ml/min,理论板数按毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于3000。 
    表5DGLC-DAD-ELSD的流动相洗脱梯度 

    (2)气相色谱法GC-FID测定有机溶剂残留 
    参照《中华人民共和国药典》2010年版第二部附录ⅧP的方法,采用Agilent6890N NetworkGC System,建立检测方法并进行方法学验证,检测收集的四个部分液体的乙酸乙酯、乙醇、正丁醇等有机溶剂的残留,以确保安全性。 
    2.实验过程及结果 
    (1)HSCCC方法的重复性考察 
    采用已确定的HSCCC条件和收集样品的时间节点,连续七日,每日进样收集所述四个部分样品,分别进行HPLC-DAD-ELSD检测分析(共8组样品,分别为七日收集的七组样品(以下记为S1~S7)以及混合该七日样品而得到的第八组混合样品(以下记为混合)),以中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2009版)考察HSCCC方法的重复性,结果见图5和6,以及表6~13。从以下结果中可看出,HSCCC连续七日所收集样品的重复性良好。 
    表6HSCCC收集的第一部分样品的重复性的相似度评价(DAD检测) 

    表7HSCCC收集的第一部分样品的重复性的相似度评价(ELSD检测) 

    表8HSCCC收集的第二部分样品的重复性的相似度评价(DAD检测) 

    表9HSCCC收集的第二部分样品的重复性的相似度评价(ELSD检测) 

    表10HSCCC收集的第三部分样品的重复性的相似度评价(DAD检测) 

    表11HSCCC收集的第三部分样品的重复性的相似度评价(ELSD检测) 

    表12HSCCC收集的第四部分样品的重复性的相似度评价(DAD检测) 

    表13HSCCC收集的第四部分样品的重复性的相似度评价(ELSD检测) 

    (2)气相色谱法GC-FID测定有机溶剂残留 
    由于HSCCC制备差异样品的过程中涉及乙酸乙酯、正丁醇、乙醇的使用,可能会对药效实验的结果产生影响。为这些消除有机溶剂的影响,确保药效实验药物的安全性,发明人对四个部分样品进行有机溶剂残留测定。 
    A.GC-FID条件 
    进样量:1μl(直接进样,进样针为10μl)。 
    进样前准备:进样前以异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺、供试品溶液先后洗涤3次,排气泡6次;进样后以异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺先后各洗涤3次;选择后进样口,载气为N2,流速为1.0ml/min,进样口温度为250℃,分流比为50:1; 
    采用程序升温方法:起始温度40℃,保持5min,以15℃/min升至120℃,保持10min,再以50℃/min升至220℃,保持2min,分析时长为24.33min; FID检测器温度为280℃,H2流速为30ml/min,空气流速为300ml/min; 
    积分方法:最小峰面积10000;积分时间0~9min。 
    B.溶液配制 
    供试品溶液:分别量取S1、S2、S3、混合的四部分样品各5ml,旋蒸至干后以N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至5ml,待测备用。 
    对照品溶液: 
    分别精密称取乙酸乙酯634.84mg、乙醇627.00mg、正丁醇630.03mg置于不同的25ml量瓶中,以N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度,即得乙酸乙酯25.39mg/ml、乙醇25.08mg/ml、正丁醇25.20mg/ml的对照品溶液母液。 
    精密称取乙酸丁酯2.50275g置于50ml量瓶中,以N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度,即得乙酸丁酯50.055mg/ml的内标溶液母液。 
    分别量取乙酸乙酯、乙醇、正丁醇各1ml、乙酸丁酯0.5ml置于同一5ml量瓶中,即得乙酸乙酯5.078mg/ml、乙醇5.016mg/ml、正丁醇5.040mg/ml、乙酸丁酯5.006mg/ml的混合对照品溶液。 
    阴性溶液:量取SFI50ml,旋蒸至干后以N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至50ml,待测备用。 
    检测限:分别取乙酸乙酯、乙醇、正丁醇母液稀释10000倍和50000倍,即得乙酸乙酯、乙醇、正丁醇2.5μg/ml和0.5μg/ml的对照品溶液,测定方法的检测限。 
    线性系列标准溶液:取母液依次稀释制备成乙酸乙酯、乙醇、正丁醇的浓度分别为5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml、40μg/ml、8μg/ml的系列标准溶液,加入内标浓度均为5mg/ml,进行测定,得到乙酸乙酯、乙醇和正丁醇的线性回归方程和相关系数r。 
    回收率试验:分别量取乙酸乙酯、乙醇、正丁醇各2ml、各1.5ml、各1ml置于不同的10ml量瓶中,依次加入2ml阴性溶液、1ml内标溶液,以N,N-二甲基甲酰胺定容至刻度,平行三份,共九份进行测定。 
    C.方法学验证 
    结果表明,本方法专属性(见图7)、线性、检测限、精密度、回收率试验(见表14)结果良好,方法可靠。 
    表14有机溶剂残留测定的线性、检测限、精密度和回收率试验 

    (4)结果测定 
    《中国药典》2010年版二部对乙酸乙酯、乙醇、正丁醇的残留限度为0.5%,从表15中结果可以看到,各组各部分的有机溶剂残留均小于0.02%,未超过残留限度,可以作为样品应用于药效动物实验中。 
    表15HSCCC收集的四个部分的有机溶剂残留测定结果 

    (3)差异样品的勾兑和制备 
    采用本发明确定的HSCCC分离条件的收集四部分样品,以四因素(A、B、C、D)九水平的均匀设计表进行勾兑,九个水平分别为0、12.5%、25%、37.5%、50%、62.5%、75%、87.5%、100%。其中,前文中的表1以10ml差异样品的制备为例说明了勾兑过程,得到差异样品1~9。其中差异样品5的剂量等同于参芪扶正注射液药效学研究中的中剂量(5g/kg)。 
    实施例3差异样品的指纹图谱的测定
    按照与实施例2中的HPLC-DAD-ELSD图谱测定相同的条件和操作,分别对实施例2所制备的差异样品1~9进行指纹图谱测定,所得指纹图谱及峰面积见图8和表16。 
    表16差异样品1~9的指纹特征 

    续表16: 

    发明人还对上述差异样品进行了聚类分析:根据上述HPLC-DAD-ELSD指纹图谱,分别得到的差异样品1~9的23个共有峰的峰面积,将其导入SPSS16.0中进行聚类分析,聚类方法采用最近距离法Nearest neighbor,距离计算方法采用欧氏距离Euclidean distance。结果表明,当聚类重新标定距离(Rescaled Distance Cluster Combine)为5时,差异样品1~9可分为七类:差异样品1和2为一类,差异样品7和8为一类,其余差异样品自成一类。 
    实施例4:差异样品的药效学指标测定
    1.实验方法 
    (1)药物溶液配制: 
    Cy(8mg/ml):分别精密称取320.5mg和321.2mg至两个50ml离心管中,分别以NS定容至40ml刻度处,4℃保存。 
    rhG-CSF(2.5μg/ml):取一支含200μg的药液以NS稀释并转移至50ml离心管中,以NS定容至40ml刻度处;取20ml至另一50ml离心管中,以NS将两个离心管分别定容至40ml刻度处,总体积为80ml,4℃避光保存。 
    差异样品1~9已稀释至合适浓度,例如将原10ml的各差异样品均稀释10倍,经0.22μm滤膜滤过后直接腹腔注射给药。 
    (2)试剂溶液配制: 
    RPMI1640完全培养液:1×1Lpowder;20%FBS;2gNaHCO3;100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素;加超纯水至1000ml,搅拌溶解后调节pH至7.4,0.22μm滤膜滤过,取续滤液分装至250ml蓝盖瓶,4℃保存。 
    PBS缓冲液:NaCl8.0g;KCl0.2g;Na2HPO4·12H2O3.58g;KH2PO40.2g;加超纯水至1000ml,搅拌溶解后调节pH至7.4,分装至250ml蓝盖瓶,121℃高压灭菌,冷却至室温后4℃保存。 
    0.747%Tris-NH4Cl溶液:Tris1.03g;NH4Cl3.735g;加超纯水至500ml,搅拌溶解后调节pH至7.4,0.22μm滤膜滤过,取续滤液分装至250ml蓝盖瓶,4℃保存。 
    1%结晶紫溶液:精密称取100.3mg至15ml离心管中,以超纯水稀释至10ml刻度处,超声溶解后,4℃保存。 
    2%冰醋酸水溶液:取冰醋酸30ml,加超纯水至1500ml,4℃保存。 
    白细胞稀释液:每100ml稀释液滴加1%结晶紫溶液100μl。 
    0.4%台盼蓝溶液:精密称取400.9mg至100ml烧杯中,加入PBS100ml,搅拌溶解后0.22μm滤膜滤过,取续滤液分装至100ml蓝盖瓶,4℃保存。 
    0.09%中性红溶液:精密称取451.1mg至1000ml烧杯中,加入PBS500ml,搅拌溶解后0.22μm滤膜滤过,取续滤液分装至250ml蓝盖瓶,4℃保存。 
    50%冰醋酸乙醇溶液:取冰醋酸100ml至250ml蓝盖瓶中,加入无水乙醇100ml,摇匀即得,4℃保存。 
    5U/ml肝素钠缓冲液:精密称取240.7mg至1000ml烧杯中,加入PBS720ml,搅拌溶解后0.22μm滤膜滤过,取续滤液分装至250ml蓝盖瓶,4℃保存。 
    2%可溶性淀粉溶液:称取2g加入少量超纯水,搅拌至糊状后,加入沸水至100ml,电炉上加热至微沸,待澄清后冷却至室温,室温保存。 
    200U/ml肝素钠溶液:精密称取57.5mg至50ml离心管中,以NS稀释至50ml刻度处,涡旋溶解后4℃保存,用于浸泡0.5mlEP管和采血管,起到抗凝作用。 
    0.5mg/ml ConA溶液:精密称取5.1mg至50ml烧杯中,加入PBS10.2ml,超声溶解,0.22μm滤膜滤过,取续滤液至15ml离心管,4℃保存。 
    1.2mg/ml LPS溶液:精密称取10.2mg至50ml烧杯中,加入PBS8.5ml,超声溶解,0.22μm滤膜滤过,取续滤液至15ml离心管,4℃保存。 
    5mg/ml MTT溶液:精密称取250.1mg至50ml烧杯中,加入PBS50ml,超声溶解,0.22μm滤膜滤过,取续滤液至50ml离心管,4℃避光保存。 
    (3)模型建立及给药方案 
    120只Balb/c小鼠被随机分为12个试验组,分别为空白对照组、模型组、 rhG-CSF阳性对照组、差异样品1~9组,具体如下: 
    (a)空白对照组:按0.2ml/20g的剂量,腹腔注射生理盐水,每日一次,连续十日。 
    (b)模型组:按0.2ml/20g的剂量,腹腔注射生理盐水,每日一次,连续十日;于第4至6日按1.6mg/20g的剂量腹腔注射Cy。 
    (c)rhG-CSF阳性对照组:按0.2ml/20g的剂量,腹腔注射rhG-CSF,每日一次,连续十日;于第4至6日按1.6mg/20g的剂量腹腔注射Cy。 
    (d)各差异样品(1~9)组:按0.2ml/20g的剂量,腹腔注射各差异样品,每日一次,连续十日;于第4至6日按1.6mg/20g的剂量腹腔注射Cy。 
    (4)各药效学指标测定方法 
    (a)外周血白细胞与骨髓细胞计数 
    于给药过程中第0天、第3天、第6天和第10天(Day0、Day3、Day6、Day10)进行眼眶静脉取血,至抗凝EP管中,以白细胞稀释液稀释40倍后采用血球计数板进行计数。 
    十日给药结束后4h,取小鼠一侧股骨,除去肌肉等其他组织后,以7号针头用10ml2%醋酸水溶液冲洗出骨髓细胞,经4.5号针头滤过后摇匀,采用血球计数板进行计数。 
    (b)脾细胞与腹腔巨噬细胞的制备 
    给药结束后4h,无菌取脾,称重,计算脾脏指数。将脾脏置于200目不锈钢滤网中,轻轻研磨,以PBS冲洗滤网,转移至15ml离心管中,200×g离心10min后弃上清;以5ml0.747%Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞,200×g离心10min后弃上清;以PBS洗涤三遍后重悬于RPMI1640完全培养液中,0.4%台盼蓝溶液计数,稀释至5×106/ml,即得脾淋巴细胞悬液。 
    给药第7天,腹腔注射1ml2%可溶性淀粉溶液,用以诱导腹腔巨噬细胞分化。给药结束后4h,往腹部注入5U/ml肝素钠缓冲液,轻揉腹部2min后回收腹腔液,转移至15ml离心管中,200×g离心10min后弃上清;以PBS洗涤三遍后重悬于RPMI1640完全培养液中,0.4%台盼蓝溶液计数,稀释至2.5×106/ml,即得腹腔巨噬细胞悬液。 
    (c)脾淋巴细胞增殖能力试验 
    将脾淋巴细胞悬液以每孔5×105的细胞密度添加至96孔U底细胞培养板中,包括试验孔、对照孔和空白孔,三复孔,随后向试验孔添加1μg ConA或2μg LPS,每孔总体积为200μl,无血清的RPMI1640培养液作为空白对照,在37℃、5%CO2的环境下培养48h。培养结束后,向每孔添加20μl MTT,继续培养4h。培养结束进行200×g离心5min后,小心吸去上清液,向每孔添加150μl DMSO,800rpm振荡5min,于酶标仪570nm(检测波长)和630nm (校正波长)检测各孔吸光度(A),计算脾淋巴细胞增殖比率。 
    (d)脾NK细胞活性试验 
    脾淋巴细胞悬液作为脾NK细胞活性试验的效应细胞,YAC-1作为靶细胞,以效靶比50:1的比例添加效应细胞(每孔5×105)和靶细胞,包括空白孔、试验孔、效应细胞孔和靶细胞孔,三复孔,每孔总体积为200μl,无血清的RPMI1640培养液作为空白对照,在37℃、5%CO2的环境下共培养24h。MTT试验方法参见(c),于酶标仪570nm(检测波长)和630nm(校正波长)检测各孔吸光度(A),计算脾NK细胞杀伤活性。 
    (e)腹腔巨噬细胞吞噬能力试验 
    腹腔巨噬细胞悬液以每孔2.5×105的细胞密度添加至96孔U底细胞培养板中,包括试验孔、对照孔和空白孔,三复孔,每孔总体积为100μl,无血清的RPMI1640培养液作为空白对照,在37℃、5%CO2的环境下培养过夜。隔日以PBS冲洗去未贴壁的细胞,随后向试验孔添加6μg LPS,每孔总体积为200μl,在37℃、5%CO2的环境下培养24h。培养结束后,小心吸去培养液,向每孔添加200μl0.09%中性红溶液,室温孵育30min后,弃上清液再以PBS洗涤两次后甩干,被吞噬的中性红以50%冰醋酸乙醇溶液溶解,于酶标仪540nm(检测波长)和630nm(校正波长)检测各孔吸光度(A),计算腹腔巨噬细胞吞噬比率。 
    (f)血清IL-2水平试验 
    给药结束后,小鼠脱颈处死后摘眼球取全血,室温放置1h后4℃、1000×g离心20min,取血清保存于-20℃。血清IL-2水平的测定按照EILSA试剂盒说明书操作。 
    2.实验过程和结果 
    (1)脾脏指数 
    实验结果(见表17、图9)表明:Cy对小鼠脾脏造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品2、3、5、6、7、8、9组均对小鼠脾脏损伤有改善作用(P<0.01),表明差异样品对Cy导致的脾脏萎缩具有明显的疗效,但差异样品1~9各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表17脾脏指数测定结果 

    注:*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (2)外周血白细胞计数 
    实验结果(见表18、图10)表明:Cy严重降低了小鼠外周血白细胞水平(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品2~9组均对小鼠外周血白细胞水平的下降有改善作用(P<0.01),但差异样品各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表18外周血白细胞计数结果 


    注:*P<0.05和**P<0.01vs.正常组,#P<0.05和##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (3)骨髓细胞计数 
    实验结果(见表19、图11)表明:Cy对小鼠骨髓细胞造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品2、3、4、5、6、8、9组均对小鼠骨髓细胞损伤有改善作用(P<0.01),但差异样品各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表19骨髓细胞计数结果 

    注:*P<0.05 and **P<0.01vs.正常组,#P<0.05 and ##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (4)经ConA/LPS诱导的脾淋巴细胞增殖能力 
    实验结果(见表20、图12)表明:Cy对小鼠脾淋巴细胞增殖能力造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品各组均对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的降低有改善作用(P<0.01),但差异样品各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表20脾淋巴细胞增殖能力测定结果 

    注:*P<0.05 and **P<0.01vs.正常组,#P<0.05 and ##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (5)脾NK细胞杀伤活性 
    实验结果(见表21、图13)表明:Cy对小鼠脾NK细胞增杀伤活性造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品2~9组均对小鼠脾NK细胞杀伤活性的降低有改善作用(P<0.01),其中差异样品6、9组已恢复至正常组水平(P>0.05)。 
    表21脾NK细胞杀伤活性测定结果 


    注:*P<0.05 and **P<0.01vs.正常组,#P<0.05 and ##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (6)腹腔巨噬细胞吞噬能力 
    实验结果(见表22、图14)表明:Cy对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品各组均对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的降低有改善作用(P<0.05),但差异样品各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表22腹腔巨噬细胞吞噬能力测定结果 

    注:*P<0.05 and **P<0.01vs.正常组,#P<0.05 and ##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    (7)血清IL-2水平 
    实验结果(见表23、图15)表明:Cy对小鼠血清IL-2水平造成严重损伤(P<0.01),而rhG-CSF、差异样品3、5、6、7、8、9组均对小鼠血清IL-2水平的降低有改善作用(P<0.05),但差异样品各组均未恢复到正常组水平(P<0.01)。 
    表23血清IL-2水平测定结果 

    注:*P<0.05 and **P<0.01vs.正常组,#P<0.05 and ##P<0.01vs.模型组(n=10)。 
    发明人测定了各样品在脾脏指数、外周血白细胞数、骨髓细胞数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力、血清IL-2水平中的药效活性,模型成立,正常组、rhG-CSF组均与模型组的差异具有统计学意义。同时,发明人发现各差异样品之间具有药效的差异,有助于进行谱效综合分析、筛选和评价各活性成分。 
    实施例5:谱效关系分析
    本实施例说明了采用灰色关联分析、多元线性回归分析和主成分分析等方法进行综合分析,揭示多个自变量与一个因变量之间的关系,用于明确中药的药效物质基础。差异样品1~9的指纹特征、峰面积及药效作用见表25。 
    表24差异样品1~9的指纹特征及其药效作用 

    续表24: 

    续表24: 

    1.实验方法 
    (1)灰色关联分析 
    灰色关联分析(GRA)的基本步骤包括: 
    1)以各差异样品的药效学指标组成参考数列,以各差异样品的指纹图谱中的各共有峰峰面积组成比较数列; 
    2)对参考数列和比较数列进行无量纲化处理;优选采用均值化方法进行处理; 
    3)根据无量纲化的参考数列和比较数列,计算各共有峰与药效之间的关联度; 
    4)对步骤3)所得关联度进行排序。 
    更具体地,在计算关联度的过程中,可以按照本领域技术人员常用的下式计算关联系数: 
    ξi(k)=minimink|y(k)-xi(k)|+ρmaximaxk|y(k)-xi(k)||y(k)-xi(k)|+ρmaximaxk|y(k)-xi(k)|]]>
    其中,y(k)表示参考数列,xi(k)表示比较数列,ρ为分辨系数,通常取0.5。 
    然后再按照下式计算关联度: 
    ri=1nΣk=1nξi(k),]]>k=1,2,Λ,n 
    所述均值化方法,在本领域通常是指将每一变量值除以该变量的平均值。该方法在消除量纲和数量级影响的同时,保留了各变量取值差异程度上的信息,也保留了数据的可比性。 
    (二)多元线性回归分析 
    多元线性回归分析(MLRA)的基本步骤包括:对原始数据进行无量纲化处理,分别计算各个自变量对因变量的相关系数,再采用选自逐步回归法Stepwise、强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward中的一种或多种方法,分别建立多元线性回归方程。 
    该分析方法可在SPSS 16.0中,通过Analyze项目下Regression中的Linear??橹惺迪?。 
    (三)主成分分析 
    主成分分析(PCA)的基本步骤包括:对原始数据进行无量纲化处理,将原来众多具有一定相关性的指标重新组合成一组新的相互无关的主成分,用主成分作为新的自变量对因变量进行回归分析。 
    该分析方法可在SPSS 16.0中,通过Analysis项目下Data Reduction中Factor Analysis??槭迪?。 
    2.实验过程和结果 
    由于三种计算方法都涉及原始数据的无量纲化处理,故在进行谱效分析之前,首先对表24的原始数据进行均值化的无量纲化处理,结果见表25。 
    表25均值化无量纲化处理后的差异样品1~9的指纹特征及其药效作用 

    续表25: 

    续表25: 

    (1)脾脏指数 
    A.灰色关联分析 
    从表26可得,各个自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下: 
    P11>P15>P20>P12>P4>P10>P1>P2>P6>P8>P3>P7>P18>P9>P19>P13>P5>P16>P17>P23>P22>P21>P14。 
    其中P11、P15、P20、P12所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.8, 这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.65所对应的化学物质(P4>......>P19)对药效也起着一定的协同作用。 
    关联度小于0.65所对应的化学物质(P13>......>P14)与药效的关系最小,但是在差异样品制备中P13与P5同为第三部分,P16、P17与P23、P22、P21、P14(含量极低)同为第四部分,当中存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表26差异样品脾脏指数的灰色关联分析结果 

    续表26: 

    B.多元线性回归分析 
    从表27中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P15、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    Y=0.631+0.369XP12(P=0.029<0.05) 
    该回归方程显示,随着P12峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P12所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表27差异样品脾脏指数的多元线性回归分析结果 

    续表27: 

    C.主成分分析 
    由于差异样品中存在严重的共线性现象,导致多元线性回归分析的参数估计不稳定,故需要从23个自变量中提取主成分,把原来彼此相关的自变量变为不相关的自变量,重新进行回归分析,再求出原自变量的参数值,通过比较各个原自变量的参数值的大小来考察其对因变量的贡献程度。主成分提取的过程如下: 
    从共同度Communalities得到,共有峰15在因子分析后,能被因子变量解释的方差为72.4%,损失较大。除此之外,主成分几乎包含了各个原始变量至少90%的信息。总方差解释部分Total Variance Explained显示了保留2个主成分为宜,集中了原始变量的95.97%。因子载荷矩阵Component Matrix给出了标准化原始变量用公因子线性表示的近似表达式,提取2个公因子时的因子模型可表示为: 
    P1=0.997F1-0.031F2 
    P2=0.997F1+0.012F2 
    ...... 
    P23=-0.980F1+0.113F2 
    通过计算因子得分矩阵Component Score Coefficient Matrix,可得因子得分函数: 
    F1=0.060P1+......-0.059P23 
    F2=-0.006P1+......+0.021P23 
    SPSS16.0根据因子得分函数自动计算9个样本的2个因子得分,并作为新变量保存为FAC1_1、FAC2_1,从而可以采用主成分作为自变量对因变量 进行回归处理(表28)。采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-脾脏指数进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.118XFAC1_1+0.114XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表29): 
    Y=1.000+0.006396XP1+0.007308XP2+0.004454XP3+0.007422XP4-0.021248X P5+0.007422XP6+0.005712XP7+0.006852XP8+0.020984XP9+0.007194XP10+0.020538XP11+0.018762XP12-0.020186XP13-0.00434XP14+0.013478XP15-0.005826XP16-0.004226XP17+0.008786XP18+0.008326XP19+0.01901XP20-0.003656XP21-0.003314X P22-0.004568XP23
    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,如P9、P11、P12、P15、P20的系数为正且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效的贡献较大,而P5、P13的系数为负且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效可能起负相关关系。另外其他自变量的系数绝对值相对较小,说明其对应的化学物质对药效的贡献较小。 
    表28差异样品主成分分析因子得分及其药效作用 

    表29差异样品脾脏指数主成分分析结果 

    续表29: 

    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与脾脏指数这一指标之间的关系: 
    P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物,P20为黄芪甲苷。P5、P13对药效可能起负相关关系。 
    (2)外周血白细胞数 
    A.灰色关联分析 
    从表30结果可得,各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下: 
    P11>P15>P20>P12>P4>P3>P10>P6>P8>P2>P1>P13>P7>P18>P19>P5>P9>P16>P17>P23>P22>P21>P14。 
    由于外周血白细胞数这一指标与体内整体状况有关,较为复杂,受多因素调控,多种物质均可影响其水平,其中P11、P15、P20、P12、P4、P3、P10、P6、P8、P2、P1、P13、P7、P18、P19所对应的化学物质与药效间的关联度在0.65~0.8之间,这提示这些物质与药效的关系较为密切,但关联度未达高值,这些化学物质可能对该指标具有协同作用。 
    关联度小于0.65所对应的化学物质(P5>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表30差异样品外周血白细胞数的灰色关联分析结果 

    续表30: 

    B.多元线性回归分析 
    从表31中的Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P10、P11、P12、P13、P18、P19所对应的化学物质与药效成正相关关系,P9、P14、P15、P16、P17、P20、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系。其中P9、P15、P20呈现负相关,但Pearson相关系数均较小,表明其对药效影响不大。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    Y=0.598+0.402XP4(P=0.003<0.01) 
    该回归方程表示,随着P4峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P4所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表31差异样品外周血白细胞数的多元线性回归分析结果 


    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-外周血白细胞数,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.256XFAC1_1-0.051XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表32): 
    Y=1.000+0.015666XP1+0.015258XP2+0.016226XP3+0.015207XP4+0.006109XP5+0.015207XP6+0.015972XP7+0.015462XP8-0.00877XP9+0.015309XP10+0.001002XP11+0.005502XP12+0.008413XP13-0.013931XP14-0.012823XP15-0.015921XP16-0.016328XP17+0.014288XP18+0.014185XP19-0.010666XP20-0.016583XP21-0.016736XP22-0.016175XP23
    表32差异样品外周血白细胞数主成分分析结果 

    续表32: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,由于外周血白细胞数这一指标与体内整体状况有关,受多因素调控,多种物质均可影响其水平,主成分分析结果与回归分析结果相似,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P10、P18、P19等水溶性成分(差异样品第一部分)对外周血白细胞数这一指标贡献较大,其余化学物质对药效影响甚小。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与外周血白细胞数这一指标之间的关系: 
    P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P10、P18、P19等水溶性成分(差异样品第一部分)对外周血白细胞数这一指标贡献较大,其中P3为腺嘌呤(又名维生素B4,主要用于参加DNA和RNA的合成,用于放射治疗、苯中毒和抗肿瘤等引起的白细胞减少症,用于急性粒细胞减少症、医药及生化研究)。其余 化学物质对药效影响甚小。 
    (3)骨髓细胞数 
    A.灰色关联分析 
    从表33结果可知,各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下: 
    P20>P11>P15>P12>P3>P4>P10>P8>P1>P2>P6>P7>P13>P18>P19>P5>P9>P17>P16>P23>P22>P21>P14。 
    其中P20、P11、P15、P12所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.75,这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.6所对应的化学物质(P13>......>P19)对药效也起着一定协同作用。 
    关联度小于0.6所对应的化学物质(P5>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表33差异样品骨髓细胞数的灰色关联分析结果 

    续表33: 

    B.多元线性回归分析 
    从表34中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P15、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    各化学物质与药效间的相关系数均小于0.6,呈弱相关关系,采用逐步回归法Stepwise不能得出相应的回归方程。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,以上几种方法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    综上所述,对于骨髓细胞数这一指标来说,不存在某个化学物质,其含量对药效起决定性作用。 
    表34差异样品骨髓细胞数的多元线性回归分析结果 

    续表34: 

    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-骨髓细胞数进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.148XFAC1_1+0.028XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表35): 
    Y=1.000+0.008712XP1+0.008936XP2+0.008116XP3+0.008964XP4-0.006528X P5+0.008964XP6+0.008544XP7+0.008824XP8+0.005392XP9+0.008908XP10+0.008972XP11+0.009964XP12-0.005196XP13-0.008088XP14+0.000692XP15-0.008572XP16-0.00806XP17+0.00918XP18+0.008948XP19+0.003836XP20-0.00792XP21-0.007836XP22-0.008144XP23
    表35差异样品骨髓细胞数主成分分析结果 

    续表35: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,各自变量绝对值均相对较小,说明其对应的化学物质单独对药效的贡献均较小,呈现弱相关关系,可能起到协同起效作用。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与骨髓细胞数这一指标之间的关系: 
    各共有峰所对应的化学物质与药效呈现弱相关关系,各自对药效的贡献均较小,说明可能各化学物质为协同作用,并不存在某个化学物质,其含量对药效起决定性作用。另外,Cy造成的骨髓抑制的恢复需要一定的时间,变化幅度较缓,结合参芪扶正注射液药效学研究的结果,可能给药时间过短导致药效不明显。 
    (4)脾淋巴细胞增殖能力 
    A.灰色关联分析 
    从表36结果可得各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度(ConA/LPS)排序如下: 
    ConA: 
    P11>P20>P15>P12>P10>P2>P9>P4>P6>P1>P8>P3>P7>P18>P19>P13>P5>P16>P17>P23>P22>P21>P14 
    LPS: 
    P11>P20>P15>P12>P4>P1>P8>P10>P3>P2>P9>P6>P7>P19>P18>P13>P5>P16>P17>P23>P22>P21>P14 
    其中P11、P20、P15、P12所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.8(P12的LPS关联度为0.7846,接近0.8),这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.6所对应的化学物质(P10>......>P13)对药效也起着一定协同作用。 
    关联度小于0.6所对应的化学物质(P5>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表36差异样品脾淋巴细胞增殖能力灰色关联分析结果 

    续表36: 

    B.多元线性回归分析 
    从表37中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P15、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    ConA:Y=0.527+0.473XP12(P=0.001<0.01) 
    LPS:Y=0.587+0.413XP12(P=0.001<0.01) 
    该回归方程表示,随着P12峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P12所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表37差异样品脾淋巴细胞增殖能力的多元线性回归分析结果 

    续表37: 

    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-脾淋巴细胞增殖能力进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    ConA:Y=1.000+0.146XFAC1_1+0.160XFAC2_1
    LPS:Y=1.000+0.124XFAC1_1+0.143XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表38): 
    ConA: 
    Y=1.000+0.0078XP1+0.00908XP2+0.005094XP3+0.00924XP4-0.029606XP5+0.00924XP6+0.00684XP7+0.00844XP8+0.029412XP9+0.00892XP10+0.028178XP11+0.02545XP12-0.028292XP13-0.004934XP14+0.019348XP15-0.007XP16-0.004774XP17+0.011174XP18+0.010548XP19+0.026818XP20-0.003974XP21-0.003494XP22-0.005254XP23
    LPS: 
    Y=1.000+0.006582XP1+0.007726XP2+0.00417XP3+0.007869XP4-0.026389XP5+0.007869XP6+0.005724XP7+0.007154XP8+0.026274XP9+0.007583XP10+0.02497XP11+0.022454XP12-0.025273XP13-0.004027XP14+0.017435XP15-0.005867XP16-0.0 03884XP17+0.009604XP18+0.009051XP19+0.024014XP20-0.003169XP21-0.00274XP22-0.004313XP23
    表38差异样品脾淋巴细胞增殖能力主成分分析结果 

    续表38: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,如P9、P11、P12、P15、P20的系数为正且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效的贡献较大,而P5、P13的系数为负且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效可能起负相关关系。另外其他自变量的系数绝对值相对较小,说明其对应的化学物质对药效的贡献较小。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与脾淋巴细胞增殖能力这一指标之间的关系: 
    P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物、P20为黄芪甲苷。P5、P13对药效可能起负相关关系。 
    (5)脾NK细胞杀伤活性 
    A.灰色关联分析 
    从表39可得,各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下: 
    P12>P11>P20>P15>P9>P10>P6>P4>P2>P1>P18>P8>P3>P7>P19>P13>P5>P16>P17>P23>P22>P21>P14。 
    其中P12、P11、P20、P15、P9所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.75(P9关联度为0.7466),这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.6所对应的化学物质(P10>......>P19)对药效也起着一定协同作用。 
    关联度小于0.6所对应的化学物质(P13>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表39差异样品脾NK细胞杀伤活性的灰色关联分析结果 

    续表39: 

    B.多元线性回归分析 
    从表40中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P15、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    Y=0.248+0.752XP12(P=0.002<0.01) 
    该回归方程表示,随着P12峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回 归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P12所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表40差异样品脾NK细胞杀伤活性的多元线性回归分析结果 

    续表40: 

    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-脾NK细胞杀伤活性进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.228XFAC1_1+0.250XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表41): 
    Y=1.000+0.01218XP1+0.01418XP2+0.007952XP3+0.01443XP4-0.046258XP5+0.01443XP6+0.01068XP7+0.01318XP8+0.045956XP9+0.01393XP10+0.044024XP11+0.03976XP12-0.044206XP13-0.007702XP14+0.030234XP15-0.01093XP16-0.007452XP17+0.017452XP18+0.016474XP19+0.041904XP20-0.006202XP21-0.005452XP22-0.008202XP23
    表41差异样品脾NK细胞杀伤活性主成分分析结果 

    续表41: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,如P9、P11、P12、P15、P20的系数为正且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效的贡献较大,而P5、P13的系数为负且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效可能起负相关关系。另外其他自变量的系数绝对值相对较小,说明其对应的化学物质对药效的贡献较小。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与脾NK细胞杀伤活性这一指标之间的关系: 
    P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物,P20为黄芪甲苷。而P5、P13对药效可能起负相关关系。 
    (6)腹腔巨噬细胞吞噬能力 
    A.灰色关联分析 
    从表42中可得,各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下: 
    P11>P15>P20>P12>P3>P4>P8>P1>P10>P2>P13>P6>P9>P5>P7>P17>P19>P16>P18>P23>P22>P21>P14。 
    其中P11、P15、P20所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.8,这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.6所对应的化学物质(P12>......>P18)对药效也起着一定协同作用。 
    关联度小于0.6所对应的化学物质(P23>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为有效成分、无效成分或有害成分。 
    表42差异样品腹腔巨噬细胞吞噬能力的灰色关联分析结果 

    续表42: 

    B.多元线性回归分析 
    从表43中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P15、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    Y=0.818+0.181XP12(P<0.001) 
    该回归方程表示,随着P12峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P12所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表43差异样品腹腔巨噬细胞吞噬能力的多元线性回归结果 

    续表43: 

    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-腹腔巨噬细胞吞噬能力进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.055XFAC1_1+0.061XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表44): 
    Y=1.000+0.002934XP1+0.003422XP2+0.001903XP3+0.003483XP4-0.01128XP5+0.003483XP6+0.002568XP7+0.003178XP8+0.011212XP9+0.003361XP10+0.010721XP11+0.009673XP12-0.010785XP13-0.001842XP14+0.007391XP15-0.002629XP16-0.001781XP17+0.004221XP18+0.003983XP19+0.010229XP20-0.001476XP21-0.001293XP22-0.001964XP23
    表44差异样品腹腔巨噬细胞吞噬能力主成分分析结果 

    续表44: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,如P9、P11、P12、P15、P20的系数为正且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效的贡献较大,而P5、P13的系数为负且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效可能起负相关关系。另外其他自变量的系数绝对值相对较小,说明其对应的化学物质对药效的贡 献较小。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与腹腔巨噬细胞吞噬能力这一指标之间的关系: 
    P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物,P20为黄芪甲苷。P5、P13对药效可能起负相关关系。 
    (7)血清IL-2水平 
    A.灰色关联分析 
    从表45可得,各自变量所代表的化学物质与药效间的关联度排序如下:P12>P11>P20>P15>P9>P10>P6>P4>P2>P1>P8>P3>P7>P18>P19>P13>P16>P17>P5>P23>P22>P21>P14。 
    其中P12、P11、P20、P15、P9所对应的化学物质与药效间的关联度大于0.7,这提示该四种物质与药效的关系最为密切。 
    关联度大于0.6所对应的化学物质(P10>......>P19)对药效也起着一定协同作用。 
    关联度小于0.6所对应的化学物质(P13>......>P14)与药效的关系最小,但是当中仍存在一定的共线性现象,加之灰色关联分析是以绝对值来分析,需结合后续两种方法综合考虑才能确定哪些物质为无效成分或有害成分。 
    表45差异样品血清IL-2水平的灰色关联分析结果 

    续表45: 

    B.多元线性回归分析 
    从表46中Pearson相关系数分析结果可得,P1、P2、P3、P4、P6、P7、 P8、P9、P10、P11、P12、P18、P19、P20所对应的化学物质与药效成正相关关系,P5、P13、P14、P15、P16、P17、P21、P22、P23所对应的化学物质与药效成负相关关系,与灰色关联分析结果接近。 
    经逐步回归法Stepwise得到回归方程: 
    Y=0.333+0.667XP12(P=0.005<0.01) 
    该回归方程表示,随着P12峰面积的增大,药效也显著提高。 
    本研究除了采用逐步回归法外,还尝试采用强迫引入法Enter、强迫剔除法Remove、向后引入法Backward及向前剔除法Forward等方法分别建立回归方程。结果显示,强迫引入法、强迫剔除法和向后引入法所建立的方程,自变量间存在着明显的共线性,导致参数估计不稳定,故排除由这几种方法分析所得到的回归方程。 
    利用向前剔除法所建立的回归方程,与逐步回归法所得的结果相同,据此可以认为P12所对应的物质对药效具有较大贡献。 
    表46差异样品血清IL-2水平的多元线性回归分析结果 

    续表46: 

    C.主成分分析 
    采用主成分FAC1_1、FAC2_1作为自变量对因变量-血清IL-2水平进行回归处理,经强迫引入法Enter得到回归方程: 
    Y=1.000+0.219XFAC1_1+0.207XFAC2_1
    代入因子得分函数后可得(原自变量的参数值见表47): 
    Y=1.000+0.011898XP1+0.013554XP2+0.008367XP3+0.013761XP4-0.038634X P5+0.013761XP6+0.010656XP7+0.012726XP8+0.038112XP9+0.013347XP10+0.037449XP11+0.034281XP12-0.036663XP13-0.00816XP14+0.024369XP15-0.010863XP16-0.007953XP17+0.016233XP18+0.015393XP19+0.034485XP20-0.006918XP21-0.006297 XP22-0.008574XP23
    表47差异样品血清IL-2水平主成分分析结果 

    续表47: 

    各自变量的系数可视为权重系数,在一定程度上反映了各个自变量所对应的化学物质的相对重要性,如P9、P11、P12、P15、P20的系数为正且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效的贡献较大,而P5、P13的系数为负且绝对值相对较大,说明其对应的化学物质对药效可能起负相关关系。另外其他自变量的系数绝对值相对较小,说明其对应的化学物质对药效的贡献较小。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析、主成分分析相互结合,基本能够反映参芪扶正注射液指纹图谱与血清IL-2水平这一指标之间的关系: 
    P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物,P20为黄芪甲苷。P5、P13对药效可能起负相关关系。 
    通过灰色关联分析、多元线性回归分析以及主成分分析等多种统计分析方法的相互结合,能够较为全面地反映参芪扶正注射液的指纹图谱与其药效之间的关系,明确其中的生物活性物质基础。其中,灰色关联度直观地显示了各个化学物质与药效间的关系程度,多元线性回归分析则从正负两方面揭示化学物质对药效的影响,主成分回归分析通过降维的方法尽量减少因自变量间的共线性而对分析结果造成的影响。 
    对于脾脏指数、脾淋巴细胞增殖能力、脾NK细胞杀伤活性、腹腔巨噬细胞吞噬能力、血清IL-2水平等药效学指标,采用本发明的评价和筛选方法的结果显示,P9、P11、P12、P15、P20对药效具有正作用且贡献较大,是主要 活性成分,其中P9、P11、P12、P15属于黄酮类化合物,需要在质量控制过程中关注以确保产品有效性。 
    而对于P5和P13这两个可能对药效起负相关关系的成分。尤其是P5,代表化学物质5-羟甲基糠醛。由于参芪扶正注射液中党参、黄芪两味原料药材均含有糖类和糖苷类化学成分,尤其是党参含糖量较高,故本品在生产、存放,尤其是炮制、灭菌的过程中都不可避免地产生5-羟甲基糠醛,而经文献研究指出5-羟甲基糠醛本身及其降解产物都可能导致药物不良反应的发生,这预示着5-羟甲基糠醛可能属于参芪扶正注射液中无药效甚至是影响药效的杂质成分,需要进行监控,以确保产品安全性。 
    结合参芪扶正注射液指纹图谱共有峰的归属定性结果,P9为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,P11为异微凸剑叶莎醇-7,2`-二-O-葡萄糖苷,P12为鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷,P15为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷,P20为黄芪甲苷,P5为5-羟甲基糠醛,P13为党参炔苷,各个化学物质的结构式如下: 


    其中,A为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷,B为异微凸剑叶莎醇-7,2`-二-O-葡萄糖苷,C为鹰嘴豆芽素-7-葡萄糖苷,D为9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-木糖葡萄糖苷,E为黄芪甲苷,F为5-羟甲基糠醛,G为党参炔苷。 
    发明人发现,对于外周血白细胞数和骨髓细胞数这两个药效学指标来说,由于该两个指标为宏观性指标,与体内整体状况有关,受多因素调控,多种化学物质均可影响其水平,各化学物质与药效之间的相关性较弱,属于各化学物质的协同作用起效,并不存在单独某个化学物质,其含量对药效起决定性作用。 
    对于参芪扶正注射液的现行质量标准,原质量标准指纹图谱中只关注了S峰(毛蕊异黄酮苷)和极性较大的水溶性成分,以及关注了含量测定项下的黄芪甲苷含量,对于谱效分析得到的其他黄酮类有效成分(P11、P12、P15)并未关注。 
    通过采用本发明的方法对参芪扶正注射液的活性成分(或负相关成分)进行评价和筛选后,在质量控制过程中采用本发明建立的适用于谱效分析的指纹图谱方法,即药效指纹图谱,见图16,或者在原指纹图谱基础上加入208nm的检测。与此同时在质量控制过程中还需要特别关注5-羟甲基糠醛的含量,建议加入5-羟甲基糠醛的限量检查,最高限度不可超过药典规定的5%葡萄糖注射液的限量,以确保产品的安全性、有效性和质量均一性。 
    尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化??梢岳斫?,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。 

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