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    重庆时时彩2000: 半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用.pdf

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    半胱氨酸 蛋白酶 抑制剂 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201310164671.7

    申请日:

    2013.05.07

    公开号:

    CN103911426A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20130507|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12N15/11; C07K16/38; G01N33/68 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 上海良润生物医药科技有限公司
    发明人: 王弢; 秦勇; 渠香云
    地址: 200131 上海市外高桥保税区港澳路271号1幢4层全部位
    优先权:
    专利代理机构: 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 代理人: 赵荣之
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310164671.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.04.27|||2014.08.27|||2014.07.09

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(CystatinS)的新用途,具体为CystatinS在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用;本发明还公开了诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂,并将捕获剂用于制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的试剂盒,制得的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点,能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

    2.  根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述CST4基因截短片段是以SEQ ID NO.2、5所示核苷酸序列为上游引物,SEQ ID NO.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列,所述SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3配对,所述SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6配对。

    3.  根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述CST4基因编码的Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

    4.  根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。

    5.  肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂,其特征在于:所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

    6.  根据权利要求5所述的捕获剂,其特征在于:所述捕获剂为识别Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽的特异性抗体。

    7.  根据权利要求5所述的捕获剂,其特征在于:所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段的特异引物和探针。

    8.  根据权利要求7所述的捕获剂,其特征在于:所述特异引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

    9.  含有权利要求5-8任一项所述捕获剂的试剂或试剂盒。

    10.  根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒,其上游引物如SEQ ID NO.5,下游引物SEQ ID NO.6所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;或,
    所述试剂盒为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。

    11.  根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于:所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体,所述显色底物为四甲基联苯胺。

    说明书

    说明书半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用
    技术领域
    本发明属于医学检测领域,涉及半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用。
    背景技术
    随着对肿瘤发病机理研究的不断深入,发现Cystatin家族作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂,在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示,Cystatin家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升,例如Cystatin C在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升,stefin A在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加,Cystatin F在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加,很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与,先诱导其表达量增加,再激活机体本身的应激机制,导致Cystatin的表达量上升以抑制过里量的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展呈正相关,例如在胶质瘤中,Cystatin C的低表达意味着疾病的晚期,患者的生存期较短,且易于复发,这可能是到了肿瘤的后期阶段,会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控,以促进肿瘤的进一步恶化。
    半胱氨酸蛋白酶抑制剂S(Cystatin S)是人类Cystatin家族成员,由CST4基因编码的含141个氨基酸的蛋白质,分子量为16.4Kda。Cystatin S分子中含有两个二硫键,为典型的分泌蛋白,分布于体液和分泌物中,如眼泪、唾液、血清、血浆等。据文献报道,CST4在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织,在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致,且表达率随细胞系的分化程度降低而降低。临床资料分析表明,CST4的表达与浸润深度、远处转移以及肿瘤分期(TNM分析)相关;生存分析表明,CST4表达阳性患者的5年生存率显著高于无表达组;Cox回归分析表明,CST4是一个独立预后因子;从而提示CST4可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止,CST4可用于胃癌的疗效评估、转移复发监控未见报道,同时也未见CST4与其他疾病如胰腺癌、食管癌、肝癌和胃肠间质瘤等相关的报道。
    发明内容
    有鉴于此,本发明的目的在于提供CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用;本发明的目的之二在于提供肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂;本发明的目的之三在于提供含有上述捕获剂的试剂盒。
    为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
    1.CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽在制备诊断和预示肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物中的应用,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
    优选的,所述CST4基因截短片段是以SEQ ID N O.2、5所示核苷酸序列为上游引物,SEQ ID N O.3、6所示核苷酸序列为下游引物扩增所得的核苷酸序列,所述SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3配对,所述SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6配对。
    优选的,所述CST4基因编码的Cystatin S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
    优选的,所述诊断和预示为诊断、疗效评估或转移复发监控。
    2.肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌标志物的捕获剂,所述标志物为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽,所述CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
    优选的,所述捕获剂为识别Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽的特异性抗体。
    优选的,所述捕获剂为检测CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因的截短片段的特异引物和探针。
    优选的,所述特异引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示,所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
    3.含有所述捕获剂的试剂或试剂盒。
    优选的,所述试剂盒为CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段实时定量检测试剂盒,其上游引物如SEQ ID NO.5,下游引物SEQ ID NO.6所示,探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;或,
    所述试剂盒为Cystatin S酶联免疫检测检测试剂盒,包括包被有单克隆抗体的固相载体、生物素标记的多克隆抗体和显色底物。
    更优选的,所述单克隆抗体为鼠抗人Cystatin S单克隆抗体,所述多克隆抗体为兔抗人Cystatin S多克隆抗体,所述显色底物为四甲基联苯胺。
    本发明的有益效果在于:本发明公开了CST4基因、CST4基因的mRNA、CST4基因的cDNA、CST4基因截短片段、CST4基因编码的Cystatin S蛋白或Cystatin S多肽作为检测肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的标志物,并公开了检测上述标志物的捕获剂,将捕获剂与常规试剂组成检测试剂盒,获得的试剂盒具有灵敏度高、特异性好等优点,能够用于肝癌、胃肠间质瘤、胰腺癌、食管癌或胃癌的早期诊断,利用试剂盒的诊断结果可早于临床症状,同时还可以用于治疗过程的疗效评估和治疗后的转移复发监控。
    附图说明
    为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图:
    图1为重组质粒结构图。
    图2为CST4基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
    图3为CST4 基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
    图4为CST4 基因的mRNA绝对定量检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
    图5为CST4基因的 mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
    图6为CST4基因的 mRNA绝对定量检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
    图7为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S蛋白的标准曲线。
    图8为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胰腺癌ROC曲线。
    图9为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测食管癌ROC曲线。
    图10为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测肝癌ROC曲线。
    图11为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胃肠间质瘤ROC曲线。
    图12为Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胃癌ROC曲线。
    具体实施方式
    下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
    本发明使用的试剂如下:Taq DNA聚合酶购自罗氏公司(货号为:12032953001);尿嘧啶-DNA 糖基化酶(UDG)购自NEB公司;dNTPs购自TAKARA公司;引物和探针由上海英潍捷基生物技术有限公司合成;Cystatin S单克隆抗体购自美国R&D公司(货号为:MAB1296);兔抗人Cystatin S多克隆抗体(货号为:11542-RP02)、Cystatin S蛋白标准品(货号11542-H08H)购自北京义翘神州生物技术有限公司。
    实施例1  制备重组质粒标准品
    重组质粒标准品制备,按照分子克隆实验指南(第三版,J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译,科学出版社,2002年)中的步骤及条件制备:
    根据报道的CST4基因序列设计扩增CST4基因截短片段的引物(CST4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示),具体如下:
    上游引物:5’- ctgcctctgaggagaccatggc-3’(SEQ ID NO.2);
    下游引物:5’- ggcgatgctactgtttaattgcag-3’(SEQ ID NO.3)。
    以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物,人cDNA为模板进行PCR扩增,PCR反应体系:上、下游引物终浓度为250nM,Taq DNA聚合酶终浓度为1U/反应;dNTPs终浓度为250 nM,其他试剂参照试剂盒说明书进行。PCR反应条件为:37℃,2分钟;95℃预变性5分钟;95℃变性10秒,60℃退火并延伸30秒,进行45个循环,获得如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。将扩增获得的序列连入pMD18-T载体中,得含CST4基因截短片段的重组质粒,结构如图1所示。将含CST4基因的重组质粒转入DH5α,筛选阳性克隆,然后提取重组质粒,作为标准品S。将重组质粒分别稀释至浓度为106copy/μL、105copy/μL、104copy/μL、2000copy/μL、500 copy/μL、250copy/μL和62.5copy/μL,并分别命名为标准品S1、标准品S2、标准品S3、标准品S4、标准品S5、标准品S6和标准品S7。
    实施例2  构建CST4 荧光定量PCR检测试剂盒
    根据CST4基因序列设计定量检测CST4基因、CST4基因的cDNA、CST4基因的mRNA或CST4基因截短片段的引物和探针,具体如下:
    上游引物为:5’-aacaaggccaccgaagatga-3’(SEQ ID NO.5);下游引物为:5’-ccacctctacgtcgaagaagta-3’(SEQ ID NO.6);探针为:FAM-cccaaaggtctgctccctggctcgca-TAMRA(SEQ ID NO.7)。同时以人B2M基因为内控,并设计内控基因的检测引物和探针:上游引物为:5’-actgaattcacccccactga-3’(SEQ ID NO.8);下游引物为:5’-cctccatgatgctgcttaca-3’(SEQ ID NO.9);探针为:FAM –tatgcctgccgtgtgaaccatgtgac- TAMRA(SEQ ID NO.10)。然后利用设计的引物和探针与其他常规试剂组成CST4荧光定量检测试剂盒,试剂盒成分如表1所示。
    表1、CST4荧光定量PCR检测试剂盒

    注:表1中的CP值为扩增曲线的交叉点(crossing point),也称为Ct值。
    (1)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胰腺癌
    利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胰腺穿刺活检组织中的CST4基因的 mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胰腺癌20例,胰腺炎20例,检测体系为:上、下游引物终浓度分别为250nM,Taq DNA聚合酶终浓度1U/反应,UDG为0.5U/反应,dNTP终浓度250 nM,探针终浓度250 nM,使用Roche LightCycler?480的荧光定量PCR仪进行检测。将检测结果作受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,结果如图2所示。ROC曲线分析表明,曲线下面积为0.833,被检分析物的量值(cutoff值)为1346copy时,灵敏度为81.7%,特异性为79.9%。
    应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测,检测患者胰腺组织样本中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,26例CST4基因的mRNA表达量大于1346copy,为胰腺癌患者;74例CST4基因的mRNA表达量小于1346copy,为非胰腺癌患者。
    (2)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断食管癌
    利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测食管组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中食管癌20例,食管炎20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图3)。结果表明,曲线下面积为0.861,cutoff值1159copy时,诊断灵敏度为81.7%,特异性为84.6%。
    应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测,检测患者食管组织中CST4 基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,31例CST4基因的mRNA表达量大于1159copy,为食管癌患者;69例CST4基因的mRNA表达量小于1159copy,为非食管癌患者。
    (3)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断肝癌
    利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测肝组织样本中CST4 基因mRNA的表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中肝癌20例,肝炎20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图4)。结果表明,曲线下面积为0.88,cutoff值1543copy时,诊断灵敏度为78.3%,特异性为89.9%。
    应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测,检测患者肝组织中CST4基因 mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,34例CST4基因的mRNA表达量大于1543copy,为肝癌患者;66例CST4基因的mRNA表达量小于1543copy,为非肝癌患者。
    (4)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胃肠道间质瘤
    利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胃肠道间叶组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胃肠道间质瘤20例,胃肠道20例,检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图5)。结果表明,曲线下面积为0.887,cutoff值1439copy时,诊断灵敏度为86.7%,特异性为88.9%。
    应用:利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测,检测患者胃肠道间叶组织中CST4基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,13例CST4基因的mRNA表达量大于1439copy,为胃肠道间质瘤患者;87例CST4基因的mRNA表达量小于1439copy,为非胃肠道间质瘤患者。
    (5)利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒诊断胃癌
    利用CST4荧光定量PCR检测试剂盒检测胃癌组织样本中CST4基因的mRNA表达量,样本来源于上海肿瘤医院,其中胃癌20例(腺癌15例,鳞癌4例,腺鳞癌1例),胃炎20例(萎缩性胃炎14例,浅表性胃炎4例,肥厚性胃炎2例),检测条件与胰腺癌相同,将检测结果绘制ROC曲线(图6)。结果表明,曲线下面积为0.933,cutoff值1443copy时,诊断灵敏度为88.3%,特异性为96.9%。
    应用:使用CST4荧光定量PCR检测试剂盒对100例疑似胃癌患者进行检测,检测患者胃组织样本中CST4 基因mRNA的表达量。结果显示,100例被检组织样本中,27例CST4基因的mRNA表达量大于1443copy,为胃癌患者;73例CST4基因的mRNA表达量小于1443copy,为非胃癌患者。
    由此可知,CST4基因的mRNA可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物,根据CST4基因的mRNA表达量可以判断是否患病。同理CST4基因的其他形式如CST4基因、CST4基因的cDNA或CST4基因截短片段均可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物。
    实施例3  建立Cystatin S酶联免疫检测反应体系及其优化
    用浓度为5μg/mL鼠抗人Cystatin S单克隆抗体包被ELISA板,于4℃条件下包被过夜,洗板;然后用质量分数为2%的BSA室温封闭2小时,洗板;将浓度分别为0pg/mL,50pg/mL,100pg/mL,200pg/mL,400 pg/mL,800 pg/mL,1600 pg/mL的Cystatin S蛋白标准品(编码Cystatin S蛋白的氨基酸如SEQ ID NO.11所示)和样品加入封闭板中,于37℃反应1小时,洗板;然后用浓度为0.5μg/mL HRP标记的兔抗人Cystatin S多克隆抗体杂交,在37℃条件下反应1小时,洗板后与四甲基联苯胺(TMB)反应2-3分钟,最后用浓度为2M 的硫酸终止反应,并于450nm条件下检测OD值,然后以Cystatin S蛋白标准品浓度为横坐标,OD值为纵坐标绘制标准曲线(图7)。结果显示,Cystatin S酶联免疫检测的线性范围为50pg/mL-1600pg/mL,在线性范围内标准品线性相关系数r≥0.990,回收率在90%~110%范围内。
    检测体系优化,比对由美国R&D、英国Abcam和美国NOVUS BIOLOGICALS提供的Cystatin S单克隆抗体,美国R&D公司和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S蛋白标准品和美国R&D、英国Abcam和北京义翘神州生物技术有限公司生产的Cystatin S多克隆抗体对检测体系的影响。结果表明,Cystatin S单克隆抗体优选R&D公司提供的产品,最佳工作浓度为5μg/mL;Cystatin S蛋白标准品和Cystatin S多克隆抗体优选北京义翘神州生物技术有限公司提供的产品,最佳工作浓度为0. 5μg/mL,在最佳条件下,可实现背景OD值<0.1,能够有效区分阴性组与阳性组,且具有统计学意义。
    固相载体的确定:对美国Corning、德国Greiner、美国Thermo 和丹麦Nunc 4个不同厂家生产的酶标板进行了比较,结果表明,美国corning公司(货号为:9018)和thermo(货号为:468667)公司的酶标板符合背景OD值<0.1,且信噪比较高。
    包被液的选择:根据抗体包被于固相载体所需要的缓冲体系,ELISA常用包被液为缓冲盐溶液,分别用磷酸盐缓冲液(pH7.5)和碳酸盐缓冲液(pH9.6)检测包被液对反应体系的影响,结果显示碳酸盐缓冲液(pH9.6)可满足空白组OD值<0.1,有效区分空白组、阴性组和阳性组,信噪比较高。
    稀释剂的选择:实验对比了2种商品化稀释剂(购自天津博美科生物技术有限公司(货号BMKF017-1)和上海西唐生物科技有限公司(货号C0901))和1种自制稀释剂的稀释效果,主要从?;さ鞍啄芰?,自身稳定性两方面评价稀释剂的稀释效果。结果显示自制稀释剂效果最佳,自制稀释剂各组分的浓度如下:3mM EDTA、质量分数为0.5% 的BSA、1×PBS、质量分数为0.05% 的Tween-20和质量分数为0.02% 的硫柳汞(pH6.0)。
    稳定剂的选择:使用3种稳定剂(具体如下:稳定剂Ⅰ:质量分数为3%的蔗糖,体积分数为8%的甘油和质量分数为1.3%的NaCl;稳定剂Ⅱ:质量分数为3%的蔗糖,体积分数为8%的甘油,质量分数为0.1%的EDTA和质量分数为1.3%的NaCl,稳定剂Ⅲ:体积分数为68.8%的PBS,体积分数为30%的胎牛血清和质量分数为0.2%的硫柳汞)分别稀释单克隆抗体、蛋白标准品和多克隆抗体至浓度为0.5mg/mL、0.16ng/mL和50μg/mL,使用时按体积比为1:100稀释,并于第0天、第7天和第14天进行检测OD值。结果显示,稳定剂Ⅲ效果最佳,具体组分为:体积分数为68.8%的PBS、体积分数为30%胎牛血清和质量分数为0.2%硫柳汞。
    通过以上成分确定检测体系的主要组分,建立成Cystatin S酶联免疫检测体系。
    实施例4  Cystatin S酶联免疫检测试剂盒
    根据实施例3中建立Cystatin S酶联免疫检测体系构建Cystatin S酶联免疫检测试剂盒,具体组分如表2所示:
      表2. Cystatin S酶联免疫检测试剂盒组分
    组份规格(96测试)包装备注①酶标板12条×8孔不透明铝箔纸真空包装已包被Cystatin S单克隆抗(浓度为5μg/mL)②酶标抗体100μL/管1mL黄盖离心管Cystatin S多克隆抗体(浓度为5μg/mL)③标准品100μL/管1mL蓝盖离心管含浓度为160ng/mL的Cystatin S蛋白,体积分数为68.8%的PBS,质量分数为0.02%硫柳汞及体积分数为30%胎牛血清④稀释液25mL/瓶无色澄清含浓度为3mM EDTA、质量分数为0.5% 的BSA、1×PBS、质量分数为0.05% 的Tween-20和质量分数为0.02% 的硫柳汞(pH6.0)⑤洗涤浓缩液20mL/瓶 无色澄清25×PBST储备液(含质量分数为3.75%的Tween-20)⑥TMB底物溶液A5.5mL/瓶棕色不透明管,避光保存浓度为0.4g/L 的TMB⑦TMB底物溶液B5.5mL/瓶棕色不透明管,避光保存质量分数为0.02% 的H2O2⑧终止液11mL/瓶无色透明浓度为2M的硫酸⑨封膜3张用于孵育时贴在板条上防止液体蒸发⑩质控品500μL/管1mL白盖离心管浓度为200pg/mL的Cystatin S蛋白
    评价Cystatin S酶联免疫检测试剂盒:使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测Cystatin S蛋白,将Cystatin S蛋白在浓度为160pg/mL和80pg/mL两个水平重复检测10次,检测结果显示变异系数CV≤10%;用3个批号试剂盒检测同一样本,表明3个批号试剂盒的批间变异系数CV≤15%。对试剂盒稳定性进行研究显示,在4℃条件下保存8个月、开封后在4℃条件下保存2个月,在0-4℃运输7天均能保持稳定。
    实施例5  Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胰腺癌
    (1)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断胰腺癌
    从上海肿瘤医院收集100例胰腺癌患者术前血清,同时血站收集245例正常献血人员血清,每例血清1 mL。使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒分别检测胰腺癌患者和正常人血清中的Cystatin S浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图8)。结果显示区分胰腺癌患者与健康人的cutoff值为139.58pg/mL,曲线下面积为0.845,诊断灵敏度为79.6%,特异性为85.7%,阳性预测值为80.2%,阴性预测值为83.3%,整体符合率为82.6%。
    应用:利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胰腺癌患者进行检测,检测患者血清中Cystatin S蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,12例Cystatin S蛋白表达量大于139.58pg/mL,为胰腺癌患者;88例Cystatin S蛋白表达量小于139.58pg/mL,为非胰腺癌患者,与临床诊断结果一致。
    (2)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌的疗效
    取上海肿瘤医院的10例胰腺癌患者放射治疗前血清,检测血清中Cystatin S蛋白浓度,治疗后再检测Cystatin S浓度。根据Cystatin S浓度变化评估胰腺癌的疗效,评价标准为:Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;Cystatin S浓度下降至139.58pg/mL以下,判断为治疗效果显著,如表3所示。同时,医生根据临床症状评估疗效,结果如表3所示。
    表3、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胰腺癌疗效结果
    患者编号治疗前后浓度变化百分比临床评价1升高3%有效2降低58%改善3降低17%无效4降低28%无效5升高5%无效6降低70%改善7降低29%无效8降低94%有效9降低33%改善10降低66%改善
    由表3可知,Cystatin S酶联免疫检测试剂盒的检测结果为10例胰腺癌患者中,其中1例患者对放疗有效,5例患者对放疗无效,其余4例患者放疗后改善作用,与临床结果对比符合率达80%。
    (3)Cystatin S血清检测试剂盒监控胰腺癌的转移复发
    对6例来自上海肿瘤医院的疗程结束后的胰腺癌患者进行跟踪随访,治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中Cystatin S浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,检测四次。根据检测结果判断是否转移复发,判断标准为:如果Cystatin S浓度大于cutoff值则发生了转移复发,如果Cystatin S浓度小于cutoff则未发生转移复发,即无进展生存,结果如表4所示。9个月时,医生根据临床症状评价胰腺癌患者是否发生转移复发,结果如表4所示。
    表4、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控胰腺癌转移复发结果
    患者编号6周pg/mL3个月pg/mL6个月pg/mL9个月pg/mL临床评价1121.36136.28138.79127.66无进展生存2169.78178.33196.57216.48转移复发3106.09102.13114.71115.67无进展生存4159.38166.45175.68209.47转移复发5116.45128.34115.47119.88无进展生存6129.68124.39119.48126.46无进展生存
    由表4可知,对6例胰腺癌患者转移复发监控发现,有2例出现了转移复发,其余4例无进展生存,与临床评价结果相同。因此利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测血清Cystatin S浓度变化,可监控胰腺癌转移复发,使用该试剂盒监控可早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
    实施例6  Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断和预示食管癌
    (1)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断食管癌
    从上海肿瘤医院收集100例食管癌患者术前血清,同时从血站收集245例健康献血人员血清;每例血清1mL。使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测食管癌患者和健康人血清中的Cystatin S浓度,根据检测结果绘制ROC曲线(图9)。结果显示,区分食管癌与健康人的cutoff值为149.66pg/mL,曲线下面积为0.883,诊断灵敏度为83.6%,特异性为86.3%,阳性预测值为82.6%,阴性预测值为82.6%,整体符合率为81.8%。
    应用:利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒对100例疑似食管癌患者进行检测,检测患者血清中Cystatin S蛋白浓度。结果显示,100例被检组织样本中,11例Cystatin S蛋白浓度大于149.66pg/mL,为食管癌患者;89例Cystatin S蛋白浓度小于149.66pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
    (2)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估食管癌疗效
    从上海肿瘤医院收集10例食管癌患者血清,化疗前检测Cystatin S浓度,治疗结束后再检测Cystatin S浓度。根据Cystatin S浓度变化对食管癌进行疗效评估,评价标准为:Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;Cystatin S浓度下降至149.66pg/mL以下,判断为治疗效果显著,10名食管癌患者的疗效评估结果如表5所示。同时医生根据临床症状评价食管癌的疗效,结果如表5所示。
    表5、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估食管癌疗效结果
    患者编号治疗前后浓度变化百分比临床评价1升高5%无效2降低48%有效3降低16%无效4降低30%无效5升高7%无效6降低67%改善7降低28%无效8降低91%有效9降低34%无效10降低69%无效
    由表5可知,试剂盒检测结果是10名食管癌患者中,其中有7名患者对化疗无效,1名患者对化疗有效,其余2名患者化疗后病情得到改善,与临床判断对比符合率达80 %。
    (3)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发
    对6例来自上海肿瘤医院的经化疗结束的食管癌患者进行跟踪随访,治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中Cystatin S浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,检测四次。根据检测结果判断是否发生转移复发,判断标准为:如果Cystatin S浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发,如果Cystatin S浓度小于cutoff值,表明未发生转移复发,为无进展生存,结果如表6所示。9个月时,医生根据临床症状判断食管癌患者是否发生转移复发,结果如表6所示。
    表6、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控食管癌转移复发结果
    患者编号6周pg/mL3个月pg/mL6个月pg/mL9个月pg/mL临床评价1123.36126.28137.79125.66无进展生存2169.18178.23196.37216.48转移复发3106.19102.33114.51115.77无进展生存4159.38166.45175.68209.47转移复发5116.45128.35115.46119.87无进展生存6129.69124.38119.47126.46无进展生存
    由表6可知,试剂盒检测结果是6例食管癌患者中有2例出现了转移复发,其余4例无进展生存,与临床评价结果一致。因此可以利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测血清Cystatin S浓度变化来监控食管癌转移复发,并且利用试剂盒监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
    实施例7 Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断和预示肝癌
    (1)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断肝癌
    从上海肿瘤医院收集100例肝癌患者的术前血清,同时从血站收集245例献血人员血清,每例血清1mL。使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测肝癌患者和健康人血清中Cystatin S浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图10)。结果表明,肝癌与正常人的cutoff值为169.38pg/mL,曲线下面积为0.857,诊断灵敏度为77.8%,特异性为89.2%,阳性预测值为80.9%,阴性预测值为85.4%,整体符合率为84.3%。
    应用:利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒对100例疑似肝癌患者进行检测,检测血清中Cystatin S蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,29例Cystatin S蛋白浓度大于169.38pg/mL,为肝癌患者;71例Cystatin S蛋白浓度小于169.38pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
    (2)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效
    取10例上海肿瘤医院的肝癌患者放疗前血清,检测Cystatin S浓度,治疗结束后再取血清检测Cystatin S浓度。根据治疗前后Cystatin S的浓度变化,评价肝癌疗效,评价标准为:Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为有效;Cystatin S浓度下降至169.38pg/mL以下,判断为治疗效果显著,其检测结果如表7所示。同时,医生根据临床症状评价肝癌疗效,结果如表7所示。
    表7、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估肝癌疗效结果

    由表7可知,试剂盒检测10名患者的结果为,6名患者治疗后无效,3名患者治疗后病情得到改善,只有1名患者治疗有效,与临床判断相比符合率达90 %。
    (3) Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发
    对6例放疗结束后的肝癌患者进行跟踪随访(患者来自上海肿瘤医院),治疗后六周首次取采集患者血清,检测血清中Cystatin S浓度,以后每三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果Cystatin S浓度大于cutoff值表明出现了转移复发,如果Cystatin S浓度小于cutoff值表明未出现转移复发,即无进展生存,其检测结果见表8。9个月时,医生根据患者临床症状评价肝癌患者是否发生转移复发,结果如表8所示。
    表8、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控肝癌转移复发结果
    患者编号6周pg/mL3个月pg/mL6个月pg/mL9个月pg/mL临床评价1129.36139.28137.79126.66无进展生存2169.78178.33196.27216.38转移复发3116.09122.13134.71125.67无进展生存4159.98166.85175.78209.67转移复发5136.45138.34125.47139.88无进展生存6129.68121.39112.48121.49无进展生存
    由表8可知,试剂盒检测结果为10例患者中有2例出现了转移复发,其余4例未出现转移复发,为无进展生存,与临床评价一致。因此,Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测血清Cystatin S浓度变化可对肝癌转移复发进行监控,其结果监控结果早于临床症状和体征发现肝癌患者复发转移,为医生提前进行干预提供指导。
    实施例8  Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胃肠道间质瘤
    (1)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断胃肠道间质瘤
    从上海肿瘤医院收集100例胃肠道间质瘤(GIST)患者的术前血清,同时从血站收集245例献血人员血清,每例血清 1 mL。使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测胃肠道间质瘤患者和健康人血清中Cystatin S浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图11)。结果显示,区分GIST与正常人的cutoff值为149.29pg/mL,曲线下面积为0.898,诊断灵敏度为75%,特异性为95.1%,阳性预测值为86.2%,阴性预测值为90.3%,整体符合率为89.3%。
    应用:利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胃肠道间质瘤患者进行检测,检测血清中Cystatin S蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,8例Cystatin S蛋白浓度大于149.29pg/mL,为胃肠道间质瘤患者;92例Cystatin S蛋白浓度小于149.29pg/mL,为非食管癌患者,与临床诊断结果一致。
    (2) Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胃肠道间质瘤疗效
    从上海肿瘤医院取10例胃肠道间质瘤患者的治疗前血清,用伊马替尼治疗后再取患者血清,然后检测治疗前和治疗后血清中Cystatin S浓度,并根据血清中Cystatin S浓度变化评估伊马替尼对胃肠道间质瘤的疗效。评价标准为:Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于90%,判断为治疗有效;Cystatin S浓度下降至149.29pg/mL以下,判断为治疗效果显著(表9)。同时,医生根据临床症状评估胃肠道间质瘤的疗效,结果如表9所示。
    表9、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胃肠道间质瘤疗效结果
    患者编号治疗前后浓度变化百分比临床评价1升高7%无效2降低58%改善3降低17%无效4降低28%有效5升高5%无效6降低70%改善7降低48%改善8降低94%有效9降低33%无效10降低66%改善
    由表9可知,试剂盒检测结果是10例胃肠道间质瘤患者中,其中6例患者治疗无效,其中1例患者治疗有效,其余3例患者治疗后病情得到改善,与临床判断结果对比符合率达80 %。
    (3)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤的转移复发
    对6例经伊马替尼治疗结束后的胃肠道间质瘤患者进行术后监控(患者来自上海肿瘤医院),治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中Cystatin S浓度,以后每隔三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果Cystatin S浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发;如果Cystatin S浓度小于cutoff值表明未发生转移复发,为无进展生存,结果见表10。9个月时,医生根据临床症状判断胃肠道间质瘤患者是否发生转移复发,结果如图10所示。
    表10、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控胃肠道间质瘤转移复发结果
    患者编号6周pg/mL3个月pg/mL6个月pg/mL9个月pg/mL临床评价1131.36146.28128.79127.66无进展生存2169.78178.33196.57216.48转移复发3106.09102.13114.71115.67无进展生存4159.38166.45175.68209.47转移复发5116.45128.34115.47119.88无进展生存6139.68124.39119.48126.46无进展生存
    由表10可知,试剂盒检测结果是被检的6例患者中,其中2例有转移复发,其余4例无进展生存。因此利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测血清中Cystatin S浓度变化,可监控胃肠道间质瘤转移复发,监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
    实施例9  Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断和预示胃癌
    (1)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒诊断胃癌
    从上海肿瘤医院收集100例胃癌患者的术前血清,同时从血站收集245例健康献血人员血清,每例血清 1 mL。使用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒分别检测胃癌患者和健康人血清中Cystatin S浓度,然后根据检测结果绘制ROC曲线(图12)。结果显示,区分胃癌患者与健康人的cutoff值为96.0125pg/mL,曲线下面积为0.845,诊断灵敏度为76%,特异性为85.3%。
    应用:利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒对100例疑似胃癌患者进行检测,检测血清中Cystatin S蛋白浓度。结果显示,100例被检样本中,23例Cystatin S蛋白浓度大于96.0125pg/mL,为胃癌患者;77例Cystatin S蛋白浓度小于96.0125pg/mL,为非胃癌患者,与临床诊断结果一致。
    (2) Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胃癌疗效
    从上海肿瘤医院取10例胃癌患者的治疗前血清,经化疗后再取患者血清,然后检测治疗前和治疗后血清中Cystatin S浓度,并根据血清中Cystatin S浓度评估化疗对胃癌疗效(表11)。评价标准为:Cystatin S浓度与治疗前相比下降小于50%,判断为治疗无效;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于或等于50%,判断为病情改善;Cystatin S浓度与治疗前相比下降大于或等于90%,判断为治疗有效;Cystatin S浓度下降至96.0125pg/mL以下,判断为治疗效果显著。同时,医生根据临床结果评价胃癌的疗效,结果如表11所示。
    表11、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒评估胃癌疗效结果
    患者编号治疗前后浓度变化百分比临床评价1升高4.2%无效2降低60.9%无效3降低18.8%无效4降低25.7%有效5升高8.9%无效6降低71.8%改善7降低23.3%无效8降低90.6%有效9降低29.7%无效10降低63.7%改善
    由表11可知,试剂盒评估结果是10例胃癌患者中,其中6例治疗无效,其中1例治疗有效,其余3例治疗后病情得到改善,与临床判断结果相比符合率达80 %。
    (3)Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控胃癌的转移复发
    对6例来自上海肿瘤医院的经化疗结束后的胃癌患者进行术后监控,并对患者进行跟踪随访。治疗后六周首次采集患者血清,检测血清中Cystatin S浓度,以后每隔三个月检测一次,跟踪九个月,共检测四次。然后根据检测结果判断是否发生转移复发,评价标准为:如果Cystatin S浓度大于cutoff值,表明发生了转移复发;如果Cystatin S浓度小于cutoff值,表明未发生转移复发,为无进展生存,结果见表12。9个月时,医生根据临床症状评价胃癌患者是否发生转移复发,结果如表12所示。
    表12、Cystatin S酶联免疫检测试剂盒监控胃癌转移复发结果
    患者编号6周pg/mL3个月pg/mL6个月pg/mL9个月pg/mL临床评价196.3679.2877.7986.66无进展生存2169.08168.33196.67216.68转移复发364.0974.1383.7195.47无进展生存4153.98165.85176.78259.67转移复发563.4566.3473.4764.88无进展生存672.6873.3984.4875.49无进展生存
    由表12可知,试剂盒检测结果是6例患者中2例患者发生了转移复发,其余4例患者无进展生存,与临床评价一致。因此,利用Cystatin S酶联免疫检测试剂盒检测血清中Cystatin S浓度变化,结果可监控胃肠道间质瘤转移复发,监控结果早于临床症状和体征发现,为医生提前进行干预提供指导。
    综上所述,Cystatin S蛋白可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物,根据其表达量变化判断是否患病。而检测过程中抗体结合位点一般为Cystatin S蛋白的抗原表位或Cystatin S蛋白多肽,因此,Cystatin S蛋白的抗原表位或Cystatin S蛋白的多肽也可以作为胰腺癌、肝癌、食管癌、胃肠道间质瘤或胃癌的标志物。
    最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
    <110>  王弢
    <120>  半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用
    <160>  11
     
    <210>  1
    <211>  736
    <212>  DNA
    <213> Homo sapiens(智人)
    <220> 
    <223>  CST4基因序列
    <400>  1
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    <223>  CST4基因上游引物
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    <210>  3
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    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
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    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  CST4基因截短序列
    <400>  4
    ctgcctctga ggagaccatg gcccggcctc tgtgtaccct gctactcctg atggctaccc   60
    tggctggggc tctggcctcg agctccaagg aggagaatag gataatccca ggtggcatct  120   
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    acaacaaggc caccgaagat gagtactaca gacgcccgct gcaggtgctg cgagccaggg  240   
    agcagacctt tgggggggtg aattacttct tcgacgtaga ggtgggccgc accatatgta  300   
    ccaagtccca gcccaacttg gacacctgtg ccttccatga acagccagaa ctgcagaaga  360   
    aacagttgtg ctctttcgag atctacgaag ttccctggga ggacagaatg tccctggtga  420   
    attccaggtg tcaagaagcc taggggtctg tgccaggcca gtcacaccga ccaccaccca  480   
    ctcccaccca ctgtagtgct cccacccctg gactggtggc ccccaccctg cgggaggcct  540   
    ccccatgtgc ctgtgccaag agacagacag agaaggctgc aggagtcctt tgttgctcag  600   
    cagggcgctc tgccctccct ccttccttct tgcttctaat agacctggta catggtacac  660   
    acacccccac ctcctgcaat taaacagtag catcgcc                           697
     
    <210>  5
    <211>  20
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  CST4 mRNA绝对定量上游引物
    <400>  5
     aacaaggcca ccgaagatga  20
     
    <210>  6
    <211>  22
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  CST4 mRNA绝对定量下游引物
    <400>  6
    ccacctctac gtcgaagaag ta      22
     
    <210>  7
    <211>  26
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  CST4 mRNA绝对定量探针
    <400>  7
    cccaaaggtc tgctccctgg ctcgca  26
     
    <210>  8
    <211>  20
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  B2M基因上游引物
    <400>  8
    actgaattca cccccactga  20
     
    <210>  9
    <211>  20
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  B2M基因下游引物
    <400>  9
    cctccatgat gctgcttaca  20
     
    <210>  10
    <211>  26
    <212>  DNA
    <213>  人工序列
    <220> 
    <223>  B2M基因绝对定量探针
    <400>  10
    tatgcctgcc gtgtgaacca tgtgac  26
     
    <210>  11
    <211>  141
    <212>  PRT
    <213> Homo sapiens(智人)
    <220> 
    <223>  Cystatin S 氨基酸序列
    <400>  11
    Met  Ala  Arg  Pro  Leu  Cys  Thr  Leu  Leu  Leu  Leu  Met  Ala  Thr  Leu
    1                   5                       10                        15
    Ala  Gly  Ala  Leu  Ala  Ser  Ser  Ser  Lys  Glu  Glu  Asn  Arg  Ile  Ile
                    20                       25                        30
    Pro  Gly  Gly  Ile  Tyr  Asp  Ala  Asp  Leu  Asn  Asp  Glu  Trp  Val  Gln
                        35                       40                        45
    Arg  Ala  Leu  His  Phe  Ala  Ile  Ser  Glu  Tyr  Asn  Lys  Ala  Thr  Glu
                    50                       55                        60
    Asp  Glu  Tyr  Tyr  Arg  Arg  Pro  Leu  Gln  Val  Leu  Arg  Ala  Arg  Glu
                         65                      70                       75
    Gln  Thr  Phe  Gly  Gly  Val  Asn  Tyr  Phe  Phe  Asp  Val  Glu  Val  Gly
                     80                      85                       90
    Arg  Thr  Ile  Cys  Thr  Lys  Ser  Gln  Pro  Asn  Leu  Asp  Thr  Cys  Ala
                         95                     100                       105
    Phe  His  Glu  Gln  Pro  Glu  Leu  Gln  Lys  Lys  Gln  Leu  Cys  Ser  Phe
                    110                      115                      120
    Glu  Ile  Tyr  Glu  Val  Pro  Trp  Glu  Asp  Arg  Met  Ser  Leu  Val  Asn
                        125                      130                      135
    Ser  Arg  Cys  Gln  Glu  Ala 
                        140  141
     
     
     

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    本文标题:半胱氨酸蛋白酶抑制剂S的应用.pdf
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