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    重庆时时彩改开奖: 结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC及其制备方法和应用.pdf

    关 键 词:
    结核 分枝杆菌 特异性 重组 蛋白 OTC 及其 制备 方法 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410171898.9

    申请日:

    2014.04.25

    公开号:

    CN103911356A

    公开日:

    2014.07.09

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 9/10申请公布日:20140709|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 9/10申请日:20140425|||公开
    IPC分类号: C12N9/10; C12N15/54; C12N15/70; G01N33/53; C12R1/32(2006.01)N 主分类号: C12N9/10
    申请人: 中国人民解放军第三〇九医院
    发明人: 吴雪琼; 阳幼荣; 张俊仙; 赵卫国; 冯金栋; 梁艳
    地址: 100091 北京市海淀区黑山扈甲17号
    优先权:
    专利代理机构: 北京市广友专利事务所有限责任公司 11237 代理人: 耿小强
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410171898.9

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.04.05|||2014.08.06|||2014.07.09

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC及其制备方法和应用,属于结核病医学免疫学检测领域。该结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC的核苷酸序列如序列表中序列1所示,利用基因工程技术制备,并应用该蛋白作为检测抗原组成的血液或尿液结核抗体化学发光酶免疫检测试剂盒。与目前商品化的抗体检测试剂盒相比,本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白,在结核病血清或尿液抗体检测方面均具有灵敏度高、特异性强、两种样本互补、并与其它抗原具有互补性的优点,可用于检测血清、尿液等体液标本中特异的抗结核抗体。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC,其特征在于:所述的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

    2.  如权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC的制备方法,包括如下步骤:
    (1)在OTC上游引物添加Nhe I酶切位点,在下游引物添加EcoR I酶切位点,将PCR扩增产物用Nhe I和EcoR I双酶切后,插入用Nhe I和EcoR I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中;转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中;经过质粒提取,经T7和T7t双向测序验证,获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒OTC/pET30aSETB;
    (2)将OTC大肠杆菌基因工程株经过诱导、表达、纯化,SDS-PAGE电泳、鉴定及ELISA分析,获得与实际设计相符的纯化重组蛋白。

    3.  如权利要求2所述的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC的制备方法,其特征在于:所述的上游引物为:
    5'-CTAGCTAGCATGATCAGGCATTTCCTGCG-3'
    所述的下游引物为:
    5’-CCGGAATTCTTATGAGCGCTCCAGCAGCCA-3'。

    4.  如权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC在制备结核抗体检测试剂盒中的应用。

    5.  如权利要求4所述的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC在制备结核抗体检测试剂盒中的应用,其特征在于:所述的试剂盒为血液或尿液结核抗体化学发光酶免疫检测试剂盒。

    说明书

    说明书结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC及其制备方法和应用
    技术领域
    本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC及其制备方法和应用,具体涉及应用基因工程技术制备的一种结核分枝杆菌特异性的重组蛋白OTC及其制备方法,并应用该蛋白作为检测抗原组成的血液或尿液结核抗体化学发光酶免疫检测试剂盒,属于结核病医学免疫学检测技术领域。
    背景技术
    在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一,1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势,尤其是结核菌耐药问题、与人免疫缺陷病毒(HIV)合并感染使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万,每年新增结核病人800~1000万,每年死亡人数约200万。
    中国的结核病疫情相当严重,是全球22个结核病高负担国家之一,结核病人数位居世界第二,仅次于印度。根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示,我国15岁及以上人群肺结核患病率459/10万(结核病人数约597万/13亿),其中传染性肺结核患病率66/10万(传染性肺结核病人数约86万/13亿),由此可见,菌阴肺结核占85.6%。结核病死亡在传染病中居第一位。结核病也是AIDS感染者死亡的主要原因,根据1996年WHO统计每3个死亡的AIDS患者中就有一例死于合并结核,45-85%HIV死亡者是由于结核病诊断延误所致。
    早期诊断、发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。结核病的诊断方法有很多种,临床上常用的有胸部影像学检查、细菌学检查、血清学诊断、细胞因子检测、分子诊断等,但是每种方法都有一定的局限性,仍有大量的菌阴肺结核未能获得早期、快速的诊断。血清学检测因其简单、价廉、无需精密仪器,在基层医院就可以开展等优点,目前国内临床上常用于结核病的辅助诊断,尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核病具有实用价值,但其灵敏度或特异性仍不能满足临床诊断的需求。为了提高血清学检测的灵敏度,目前检测的标本也有采用胸水、脑脊液、腹水,以提高结核性胸膜炎、结核性脑膜炎、结核性腹膜炎诊断的灵敏度。但目前国内外尚未见专门用于检测尿液标本中抗结核抗体的试剂盒。目前已发现不同结核病患者标本对不同结核分枝杆菌抗原产生不同水平的抗体,而同一个患者在疾病的不同阶段对不同抗原的免疫反应也不 同,使得每一位患者血清识别抗原的种类、数目和水平都有很大的差异,抗原识别的个体差异是人类结核病体液免疫的主要特性。因此,本发明拟制备一种新的结核分枝杆菌重组蛋白抗原OTC,应用化学发光酶免疫分析法检测血液或尿液中的抗结核OTC抗体水平,与其它血清抗体检测起互补作用,从而提高抗结核抗体检测的灵敏度,提高结核病人的发现率。此外,尿液标本来源方便,避免抽血化验给患者的痛苦,填补了国际空白。
    发明内容
    本发明的目的是为克服已有技术的不足,提供一种新型结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC及其制备方法,并应用该蛋白作为结核病抗体检测抗原制备血清或尿液结核OTC抗体化学发光酶免疫检测试剂盒,可与其它血清抗体检测起互补作用,以提高抗结核抗体检测的灵敏度。应用于结核病的快速诊断时,尿液标本来源方便,避免抽血化验给患者的痛苦。
    一种结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC,它的核苷酸序列(DNA序列)如序列表中序列1所示。
    OTC(ornithine carbamoyltransferase)蛋白抗原是一种鸟氨酸氨基甲酰转移酶,蛋白分子量为33025.2Da,参与鸟氨酸的生物合成。它存在于结核分枝杆菌培养滤液、细胞壁和细胞裂解液中,在活动性肺结核患者血液和尿液中高表达。重组OTC蛋白可被活动性结核病患者IgG抗体识别,而健康人IgG不能识别。因此,重组OTC蛋白用于血清或尿结核抗体检测,可与其它血清抗体检测起互补作用,以提高抗结核抗体检测的灵敏度,实现结核病患者的早期发现。
    本发明提出的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC,是通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。
    本发明提出上述重组蛋白OTC的制备(构建)方法,包括如下步骤:
    (1)OTC蛋白的克?。和ü蚬こ碳际踅锌寺?。
    在OTC上游引物添加Nhe I酶切位点,在下游引物添加EcoR I酶切位点,将PCR扩增产物用Nhe I和EcoR I双酶切后,插入用Nhe I和EcoR I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中;转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中;经过质粒提取,经T7和T7t双向测序验证,获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒OTC/pET30aSETB,其核苷酸序列如序列表中序列2所示,表明已成功构建了OTC蛋白重组表达质粒。
    (2)OTC重组蛋白的鉴定:OTC大肠杆菌基因工程株经过诱导、表达、纯化,SDS-PAGE电泳、鉴定,及ELISA分析,表明获得的纯化的重组蛋白与实际设计 的大小相符,并具有很好的抗原性。
    在步骤(1)中,扩增OTC基因的一对引物为:
    上游引物(含限制性内切酶Nhe I位点)
    5'-CTAGCTAGCATGATCAGGCATTTCCTGCG-3'
    下游引物(含限制性内切酶EcoR I位点)
    5’-CCGGAATTCTTATGAGCGCTCCAGCAGCCA-3'
    本发明的结核分枝杆菌特异性重组蛋白OTC可应用于制备结核抗体诊断或检测试剂盒,即将该蛋白作为检测抗原组成的血液或尿液结核抗体化学发光酶免疫检测试剂盒,研究结果表明,应用化学发光酶免疫分析法检测血液或尿液中的抗结核抗体水平,两种标本抗体检测起互补作用,可提高抗结核抗体检测的灵敏度,提高结核病人的发现率。此外,尿液标本来源方便,避免抽血化验给患者的痛苦。
    本发明的特点及效果:
    本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌重组蛋白OTC,作为结核病抗体检测的抗原,用于检测结核病患者血清或尿液中的抗体水平。
    本发明人研究证明应用结核分枝杆菌OTC重组蛋白抗原检测结核病患者血清或尿液中结核抗体的灵敏度和特异性分别为28.6%、90.7%和30.4%、94.4%,两种样本联合检测的灵敏度和特异性为50.0%和85.2%。
    本发明结核分枝杆菌重组蛋白OTC抗原可大规模生产,且成本相对较低。
    本发明的重组蛋白可作为新型结核抗体检测的联合抗原之一,用于检测尿、血清、胸水等体液样品中特异的抗结核抗体,从而用于结核病临床辅助诊断。
    与目前商品化的抗体检测试剂盒相比,本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白,在结核病血清或尿液抗体检测方面均具有灵敏度高、特异性强、两种样本互补、并与其它抗原具有互补性的优点,可用于检测血清、尿液等体液标本中特异的抗结核抗体。
    附图说明
    图1为OTC/pET30aSETB大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后SDS-PAGE结果。
    图2为OTC/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE结果。
    具体实施方式
    本发明提出的结核分枝杆菌特异性抗原重组蛋白及其制备方法和应用结合实施例及附图详细说明如下。
    结核分枝杆菌特异性抗原重组蛋白OTC,是通过基因工程技术将其克隆、表达、 纯化。
    所述的重组蛋白OTC的制备方法,包括:重组蛋白OTC的克?。和ü蚬こ碳际踅锌寺?。在OTC上游引物添加Nhe I酶切位点,在下游引物添加EcoR I酶切位点,将PCR扩增产物用Nhe I和EcoR I双酶切后,插入用Nhe I和EcoR I双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中。经过质粒提取,经T7和T7t双向测序验证,获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒OTC/pET30aSETB,其核苷酸序列如序列表中序列2所示,表明已成功构建了OTC蛋白重组表达质粒。
    实施例1
    一、通过基因工程技术克隆OTC蛋白编码基因:
    1、依据序列表中的序列1设计与合成扩增OTC基因的一对引物
    上游引物(含限制性内切酶Nhe I位点)
    5'-CTAGCTAGCATGATCAGGCATTTCCTGCG-3'
    下游引物(含限制性内切酶EcoR I位点)
    5’-CCGGAATTCTTATGAGCGCTCCAGCAGCCA-3'
    扩增片段:942bp
    2、PCR扩增OTC基因
    用上下游引物,在Taq plus I DNA聚合酶的作用下,以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,扩增OTC基因。PCR反应程序:95℃5min;94℃1min,65℃1min,72℃2min,循环30次;最后72℃延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定942bp的扩增DNA片段。
    3、回收目的基因片段:
    琼脂糖凝胶电泳结束后,在长波紫外线照射下,用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块,放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段,定量后,贮存于-20℃备用。
    4.重组质粒的构建:
    用限制性内切酶Nhe I和EcoR I双酶切纯化后的PCR产物,用Nhe I和EcoR I双酶切表达载体pET30aSETB质粒DNA,于1%琼脂糖凝胶电泳,切取OTC基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段,用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后,OTC基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合,10μl反应体系如下:


    混匀后置于16℃连接过夜,75℃灭活10min,冰浴后直接进行转化。
    5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备:
    挑取大肠杆菌DH5α(或BL21)单菌落接种于5ml LB培养液中,置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜;次晨按1/100转种于100ml LB培养液中,置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h,待菌浓度OD600为0.6~0.8时,放入用冰预冷的大离心管中,4℃、4000rpm、离心10min,弃上清;20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀,冰浴30min;于4℃、6000rpm、离心10min,弃上清;用4ml0.1mol/LCaCl2重悬菌沉淀,置4℃冰箱放置过夜;次晨加入1ml无菌甘油,吹打混合均匀,每100μl分装于一个1.5ml的离心管中,置-70℃保存备用。
    6.连接产物的转化:
    次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中,冰浴0.5h;放入42℃水浴箱热休克90s,迅速取出冰浴2min;加入LB培养液400μl,37℃恒温摇床培养1h;加入X-Gal60μl,IPTG4μl,混匀,取出200-400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板,放37℃恒温培养箱培育14h。
    7.质粒的提?。?
    根据蓝白斑筛选,随机挑取白色菌落6个,分别接种于5ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜;根据《分子克隆》碱裂解方法,小量提取质粒。
    (1)质粒小量提取试剂的配制
    溶液Ⅰ:50mmol/L葡萄糖
            25mmol/L Tris·CL(pH8.0)
            10mmol/L EDTA(pH8.0)
            在101bf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟;储存于4℃备用。
    溶液Ⅱ:0.2mmol/L NaOH,1%SDS  临用前配制
    溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾  60ml
            冰乙酸        11.5ml
            去离子水      28.5ml
            贮存于4℃,备用。
    (2)小量提取质粒
    分别取约3.0ml菌液置离心管中,于12,000rpm离心1min,弃上清;细菌沉淀重悬于200μl溶液Ⅰ中,冰浴10min;加400μl新配制的溶液Ⅱ,冰浴5min;加300μl溶液Ⅲ,冰浴10min;于4℃12,000rpm离心10min;上清液移入干净的离心管中,加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次;加2倍体积的无水乙醇充分混合,于-20℃放置2h沉淀DNA;于4℃12,000rpm离心10min,弃上清;用1ml70%乙醇洗涤沉淀一次,室温充分干燥;将沉淀溶于20μl TE缓冲液中,加入无DNA酶的胰RNA酶,使其终浓度为20μg/ml,于37℃水浴30min,消化RNA;取2μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量,置-20℃储存备用。
    8.鉴定重组质粒:
    (1)PCR扩增鉴定:以挑选的菌落质粒DNA为模板,以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳,阳性重组质粒命名为OTC/pET30aSETB。
    (2)序列测定:直接挑选一个克隆进行T7和T7t双向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致,其核苷酸序列如下,在序列表中如序列2所示,其中,GCTAGC为Nhe I,GAATTC为EcoR I。
    GGGGGGGGGGACATTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCATGATCAGGCATTTCCTGCGCGACGACGATCTGTCCCCGGCCGAACAGGCCGAGGTGCTCGAGCTCGCGGCCGAGCTGAAGAAAGACCCGGTTAGCCGTCGTCCCCTGCAAGGGCCGCGCGGGGTGGCGGTCATCTTCGACAAGAACTCCACCCGCACCCGGTTCTCCTTCGAGCTGGGCATCGCGCAGCTGGGCGGGCATGCCGTCGTCGTCGACAGCGGCAGCACCCAGCTGGGCCGCGACGAAACCCTGCAGGACACCGCAAAGGTGTTGTCCCGCTACGTCGATGCCATCGTCTGGCGAACCTTCGGCCAAGAGCGGCTGGACGCCATGGCGTCGGTCGCGACGGTGCCCGTGATCAACGCGCTCTCCGATGAGTTCCATCCGTGTCAGGTGTTGGCCGACCTGCAGACCATCGCCGAACGCAAGGGGGCGCTGCGCGGCCTGAGGTTGTCCTACTTCGGCGACGGCGCCAACAACATGGCCCACTCGCTGCTGCTCGGCGGGGTCACCGCGGGTATCCACGTCACCGTCGCGGCTCCCGAGGGCTTCCTGCCCGACCCGTCGGTGCGGGCCGCGGCCGAGCGCCGCGCCCAGGATACCGGCGCCTCAGTGACTGTGACCGCTGACGCC CACGCGGCCGCCGCCGGCGCCGACGTTCTGGTCACCGACACCTGGACGTCGATGGGCCAGGAAAACGACGGGTTGGACCGAGTGAAGCCGTTTCGGCCGTTTCAGCTCAACTCGCGACTTCTGGCGCTGGCCGACTCGGATGCCATCGTGTTGCATTGCCTGCCGGCCCATCGCGGCGACGAGATCACCGACGCGGTGATGGACGGGCCGGCCAGCGCGGTGTGGGACGAGGCCGAAAACCGGCTGCACGCGCAGAAGGCGCTGCTGGTGTGGCTGCTGGAGCGCTCATAAGAATTCGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAAGCGAGGGCT
    二、OTC工程菌的诱导表达及鉴定
    将OTC大肠杆菌工程菌接种于5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃恒温振荡器培养过夜,然后按1%转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中,置37℃恒温振荡器培养至OD600为0.6-0.8时,加入IPTG,诱导3-4hr。
    将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本,混悬后,置100℃沸水浴5min,于12000rpm离心10min,取上清液40μl进行13%SDS-PAGE,电泳条件为:积层胶恒流10mA,分离胶恒压15mA,待溴酚蓝电泳至凝胶底部,停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h;用脱色液脱色至条带清晰。OTC/pET30aSETB菌体在相对分子质量34.6kDa位置附近有浓重的表达条带出现,诱导3-4小时表达量最多,结果见图1。
    图1为OTC/pET30aSETB大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后SDS-PAGE结果,其中,
    1:蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A,97.2,66.4,44.3,29.0,20.1,14.3kDa);
    2:基因工程菌诱导前;
    3:基因工程菌诱导后1小时;
    4:基因工程菌诱导后2小时;
    5:基因工程菌诱导后3小时;
    6:基因工程菌诱导后4小时。
    三、OTC重组蛋白的纯化
    将诱导菌超声破碎后,采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化OTC融合蛋白,13%SDS-PAGE电泳可见纯化的34.6kDa蛋白呈一条带,结果见图2。
    图2为OTC/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE结果,其中:
    1:蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A,97.2,66.4,44.3,29.0,20.1,14.3kDa);
    2:基因工程菌诱导前;
    3:基因工程菌诱导后;
    4:基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的上清(可溶性部分)样品;
    5:基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的沉淀(不可溶性部分)样品;
    6:纯化后蛋白样品。
    实施例2
    将本发明实施例1所构建、纯化的OTC重组蛋白应用于结核病患者尿和血中结核抗体检测。以其作为化学发光免疫实验的诊断抗原,应用于临床标本的试验,获得了较好的诊断效果,与目前商品化的三个结核抗体检测试剂盒比较,显著地提高了结核病诊断的灵敏度。ELISA检测程序如下所示:
    1.实验标本:共选择103例血清标本,分为两组:
    (1)结核病组:临床上经影像学、实验室检查及抗结核治疗而确诊的活动性结核病患者56例,其中男33例,女23例,平均年龄40.8±19.1岁。包括肺结核、肺结核合并结核性胸膜炎、肺结核合并结核性脑膜炎、肺结核合并支气管结核、肺结核合并颈部淋巴结结核、肺结核合并腰椎结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎合并结核性胸膜炎等。
    (2)非结核对照组:临床上经影像学、实验室检查及治疗效果而确诊的非结核呼吸疾病患者54例,其中男34例,女20例,平均年龄58.5±20.7岁。包括肺炎、肺炎合并肺不张、肺炎合并脑脓肿、肺炎合并慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张合并感染、慢性支气管肺炎、肺脓肿、支气管哮喘、肺癌、支气管扩张合并感染、呼吸道感染、胸膜炎、肺间质纤维化等。
    2.实验仪器和试剂
    仪器:化学发光分析仪KPS-KM,北京科美东雅科技发展有限公司产品。
    试剂:OTC重组蛋白,3个商品化的结核抗体诊断试剂盒(分别为韩国SD标准诊断公司、上海奥普生物医药有限公司、北京现代高达生物技术有限责任公司),包被缓冲液(0.05mo1/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液,pH9.6),封闭液(PBS-10%小牛血清),洗涤液(PBST,PBS-0.05%吐温,pH7.4),样本稀释液(PBST-10%小牛血清, pH7.4),酶标第二抗体(HPR标记的羊抗人IgG),化学发光底物液(用前15分钟将A与B试剂按1:1配制)。
    3.实验方法
    (1)抗原包被:用包被缓冲液将重组蛋白抗原稀释至10μg/ml,每孔加100μl。每板留1个孔,只加包被缓冲液,作为空白对照。置4℃过夜。次日用PBST洗板3次,3分钟/次。
    (2)封闭:每孔加PBS-10%小牛血清200μl,置37℃孵育1小时。用PBST洗板3次,3分钟/次。
    (3)加待检样品:用PBST-10%小牛血清按1:10稀释待检样品,充分混匀后,每孔加100μl,做2个平行孔;同时做空白、阴性及阳性孔对照,置37℃孵育40分钟。用PBST洗板3次,3分钟/次。
    (4)加酶标二抗:用PBST-10%小牛血清新鲜稀释酶标第二抗体,充分混匀后,每孔加100μl,置37℃孵育40分钟。用PBST洗板6次,8分钟/次。
    (5)加底物液:每孔加100μl新鲜配制的化学发光底物液,立即放入化学发光分析检测仪,5分钟读取发光值。
    4.结果
    实验结果见表1和表2。OTC重组蛋白用作抗原检测血和尿中抗结核抗体的特异性(分别为90.7%、94.4%)明显高于上海奥普生物医药有限公司的结核抗体诊断试剂盒(为57.4%),与韩国SD标准诊断公司和北京现代高达生物技术有限责任公司的结核抗体诊断试剂盒(分别为90.7%、88.9%)相当。OTC重组蛋白检测血和尿中抗结核抗体的灵敏度(分别为28.6%、30.4%)明显高于韩国SD标准诊断公司(为12.5%)的结核抗体诊断试剂盒和传统的涂片和培养(为14.3%),略高于北京现代高达生物技术有限责任公司(为23.2%),显著低于上海奥普生物医药有限公司的结核抗体诊断试剂盒(为82.1%)。应用OTC重组蛋白同时检测血和尿中抗结核抗体的灵敏度和特异性分别为50.0%(28/56)和85.2%(8/54),两种标本同时检测可起互补作用,显著提高抗结核抗体检测的灵敏度,提高结核病人的发现率。本发明的重组蛋白用作抗原检测结核抗体无论是菌阳还是菌阴的活动性结核病患者均具有较高的检出率。结果表明:与现有商品化的结核抗体检测试剂盒和传统的涂片、培养相比,本发明所构建的结核分枝杆菌特异性重组蛋白,在对结核病诊断的灵敏度和特异性方面具有明显的优势。因此,本发明在结核病快速诊断方面具有广泛的应用前景。
    表1应用化学发光酶免疫方法检测结核和非结核血清或尿中抗结核抗体

    表2应用化学发光酶免疫方法检测结核血清或尿中抗结核抗体结果


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