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    关 键 词:
    增强 磁性 颗粒 免疫测定 中的 表面 接触 排斥
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    摘要
    申请专利号:

    CN201280056497.8

    申请日:

    2012.11.16

    公开号:

    CN103930783A

    公开日:

    2014.07.16

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20121116|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; C12Q1/68 主分类号: G01N33/543
    申请人: 皇家飞利浦有限公司
    发明人: T·H·埃弗斯; M·福涅尔
    地址: 荷兰艾恩德霍芬
    优先权: 2011.12.01 EP 11191453.7; 2011.11.16 US 61/560,450
    专利代理机构: 永新专利商标代理有限公司 72002 代理人: 左路
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201280056497.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.11.02|||2014.12.17|||2014.07.16

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:样品容器,其用于测量样品中的靶分子;磁性颗粒,其中所述颗粒用第一结合分子和排斥表面结构功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子,其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关,并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。本发明的第二方面描述一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:至少两种类型的磁性颗粒的混合物,其中一种类型用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,并且第二类型用排斥表面结构功能化,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子。此外,本发明描述一种用于检测样品中的靶分子的存在或量的方法以及磁性颗粒在检测样品中的靶分子中的用途。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:
    (a)样品容器,其用于测量样品中的靶分子;
    (b)磁性颗粒,其中所述颗粒用以下功能化:
    (i)第一结合分子,其能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,和
    (ii)排斥表面结构,其直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;
    (c)传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子;
    其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关;并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。

    2.  一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:
    (a)样品容器,其用于测量样品中的靶分子;
    (b)至少两种类型的磁性颗粒的混合物,其中
    (i)一种类型用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,和
    (ii)第二种类型用排斥表面结构功能化,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及
    (c)传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子;
    其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关;并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。

    3.  权利要求1或2的装置,其中所述第一结合分子经由接头分子连接至所述颗粒,其中优选所述接头分子长于所述排斥表面结构。

    4.  权利要求3的装置,其中所述接头分子是或包含所述排斥表面结构。

    5.  权利要求1-3中任一项的装置,其中所述排斥表面结构进一步用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子。

    6.  权利要求1-5中任一项的装置,其中所述推送作用由表面相互作用增加至少1%来确定。

    7.  权利要求1-6中任一项的装置,其中所述排斥表面结构为带电结构或立体涂层。

    8.  权利要求7的装置,其中
    (i)所述带电结构向所述磁性颗粒赋予至少约25mV的ζ电势,和/或
    (ii)所述立体涂层赋予所述磁性颗粒半径的至少约105%的所述磁性颗粒的流体力学半径。

    9.  权利要求1-8中任一项的装置,其中所述第一结合分子为抗体或其片段、适体或互补核酸。

    10.  权利要求1-9中任一项的装置,其中所述带电结构是或包含选自以下的分子:核酸分子如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体,水凝胶以及聚合物。

    11.  权利要求3-9中任一项的装置,其中所述接头分子和/或排斥表面结构不被DNase和/或能切割双链核酸分子的限制性酶切割。

    12.  权利要求10或11的装置,其中所述核酸分子优选dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体的长度为约50-1000个核苷酸,优选约100核苷酸。

    13.  用于检测样品中的靶分子的存在或量的方法,其包括以下步骤:
    (a)使所述样品与权利要求1-12中任一项的装置中的连接至颗粒的第一结合分子接触;和
    (b)使所述样品与以下接触:
    i)第二结合分子,其能够连接至传感器表面,其中所述第一结合分子和/或所述第二结合分子能够特异性地结合所述靶分子;以及任选地
    ii)与所述传感器表面连接的靶类似物分子;其中所述靶分子能够干扰所述第一结合分子与所述靶类似物分子的结合,
    (c)检测结合至所述传感器表面的颗粒的数目;
    其中施用磁力以使所述颗??拷龃衅鞅砻?;并且其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关。

    14.  权利要求1-12中任一项所定义的磁性颗粒在检测样品中的靶分子中的用途。

    15.  权利要求1-12中任一项的装置、权利要求13的方法或者权利要求14的用途,其中所述靶分子为心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。

    说明书

    说明书增强磁性颗粒免疫测定中的表面接触的颗粒排斥
    技术领域
    本发明涉及一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:样品容器,其用于测量样品中的靶分子;磁性颗粒,其中所述颗粒用第一结合分子和排斥表面结构功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子,其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关,并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。本发明的第二方面描述一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:至少两种类型的磁性颗粒的混合物,其中一种类型用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,并且第二类型用排斥表面结构功能化,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子。此外,本发明描述一种用于检测样品中的靶分子的存在或量的方法以及磁性颗粒在检测样品中的靶分子中的用途。
    背景技术
    普遍和有效的健康护理的需求使得全世界的体外诊断倾向于集成的随时获取(random-access)和床边(point-of care)方案。这样的方案的实现是迫切的:测试需要为快速、灵敏、定量且精确的。而且,进行测试的平台必须是容易使用且紧凑的。
    亲和力测定使用生物分子从样品捕获特定靶分子并且使得能确定它们的浓度。通常,亲和力捕获通过将用捕获分子包覆的纳米或微米颗粒分散于样品液体中实现(Luchini et al.,2008,Nano Lett.,8(1),350-361)。因此,典型的基于亲和力的测定用于大量的应用,例如诊断测定、在研究中检测生物分子如蛋白、肽和核酸,其中使用亲和力分子如抗体,其通常特征在于对特定生物分子具有高结合亲和力。原则上,功能化的磁性颗粒被吸引至传感器表面,其中所述颗??梢约浣?,即通过捕获的分析物,或者直接结合表面上印刷的捕获探针如抗体。结合的颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接或反相关。通常,在这样的生物传感器应用中,颗??梢岳枚越咏砻娴目帕A槊舻娜魏渭际跫觳?;通常这样的技术基于光学检测,例如Bruls et al.,Lab Chip,2009,9.2504-3510所述,如检测散射光或受抑全内反射(FTIR)。US2009/0148863A1公开了基于功能化纳米颗粒的用于超低水平检测的组合物。所述的纳米颗粒表面可以包含第一单层组分,其适合于结合生物学部分。纳米颗粒表面还可以包含第二单层组分,其适合于辅助将第一单层组分暴露于表面。该文献致力于贵金属纳米颗粒,特别是Ag纳米颗粒。
    然而,现有技术中所述的此类亲和力测定的重要缺点在于具有结合的靶分子的功能化颗粒与表面的结合仍然非?;郝?,是限速的并且效率低下。这样的缓慢反应的一个原因在于颗粒与表面受限的相互作用。本申请的发明人观察到,在这样的测定中,如图2所示,当磁场关闭时,颗粒通??梢岳┥⒃独氡砻?,从而降低颗粒在表面附近花费以发生结合的时间。此外,使用更多的颗粒以产生能够将底层的颗粒向表面进一步推低的顶层颗粒云的不足之处在于降低了每颗粒的结合机会。
    因此,亟需提供增加颗粒-表面结合但不增加颗粒的量的方式和方法。
    发明内容
    本发明解决这些需求,并且提供用于增强颗粒与表面的结合效率的方式。特别地,上述目的通过用于检测样品中的靶分子的装置实现,所述装置包括:样品容器,其用于测量样品中的靶分子;磁性颗粒,其中所述颗粒用第一结合分子和排斥表面结构功能化,所述第一结合分子能够特异性 地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子,其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关,并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。
    特别地,本发明描述了表面接触如何以及磁性纳米颗粒的结合概率如何可以借助于将排斥表面结构放置于颗粒上而增加。出人意料地发现,源自颗粒上的高电荷或立体涂层的排斥力具有两个重要的效果。首先,其增加颗粒之间的排斥,导致对于颗?;ハ嘀涞姆翘匾煨越岷隙杂欣目帕4丶募跎?。第二个重要的效果在于排斥导致形成总体的“推斥”,从而将颗粒推向表面而无需增加颗粒浓度。在图4所示的实验中,磁性颗粒用不同长度的dsDNA功能化,并且颗粒的电荷借助于它们的ζ电势进行测量。在光磁测定中,本发明人可以观察到颗粒的表面接触随颗粒电荷增加。如图5所示,对应于表面接触的信号幅度与连接至颗粒的带电分子的数目成正比。因此,不希望被理论束缚,增加的表面接触使得增加反应速率,并且最终在测定时结束增加信号改变(参见,例如图6)?;谡庑┖推渌⑾?,其在下文中会进一步详细地描述,本发明人开发了磁性纳米颗粒的排斥表面构造,其适合于产生排斥力和推迟效果,其有利地增加磁性颗粒结合概率。这个概念可以通过一种类型的包含排斥表面结构的磁性颗粒实施,或者可以通过至少两种类型的磁性颗粒的混合物实施,其中一种类型用能够特异性地结合所述靶分子的第一结合分子功能化,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,并且第二种类型用排斥表面结构功能化。
    因此,在第二方面,本发明涉及一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:样品容器,其用于测量样品中的靶分子;至少两种类型的磁性颗粒的混合物,其中一种类型用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,并且第二类型用排斥表面结构功能化,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所 述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子;其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关,并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。
    在本发明的优选实施方案中,所述第一结合分子经由接头分子连接至颗粒。
    在本发明的优选实施方案中,所述接头分子长于所述排斥表面结构。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述接头分子为或包含所述排斥表面结构。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述排斥表面结构进一步用能够特异性地结合所述靶分子的第一结合分子功能化。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述推斥效果由表面相互作用增加至少1%确定。
    在本发明的另一优选实施方案中,上文所述的排斥表面结构为带电结构或立体涂层。
    在本发明的另一优选实施方案中,在合适的条件下测量,所述带电结构将至少约25mV的ζ电势赋予至所述磁性颗粒,和/或所述立体涂层赋予所述磁性颗粒半径的至少约105%的所述磁性颗粒的流体力学半径。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述第一结合分子为抗体或其片段、适体或互补核酸。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述带电结构为或包含核酸分子、水凝胶或聚合物。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述核酸分子选自dsDNA PNA分子、PNA-DNA双链体(duplex)和RNA-DNA双链体。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述接头分子和/或所述排斥表面结构不会被DNase和/或能够切割双链核酸分子的限制性酶切割。
    在本发明的另一优选实施方案中,所述核酸分子,优选dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体的长度为约50-1000个核苷酸。
    在本发明的进一步优选的实施方案中,所述核酸分子,优选dsDNA、 PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体的长度为约100个核苷酸。
    在另一方面,本发明涉及一种用于检测样品中的靶分子的存在或量的方法,所述方法包括以下步骤:在本文所述的装置中,使所述样品与连接至颗粒的第一结合分子接触,并且使所述样品与能够连接至传感器表面的第二结合分子接触,其中所述第一结合分子和/或所述第二结合分子能够特异性地结合所述靶分子,并且任选地,靶类似物分子连接至所述传感器表面;其中所述靶分子能够干扰所述第一结合分子与所述靶类似物分子的结合,任选地,添加包含本文所定义的排斥表面结构的磁性颗粒并检测结合至所述传感器表面的颗粒的数目,其中施用磁力以使所述颗??拷龃衅鞅砻?;并且其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关。
    在本发明的另一实施方案中,检测结合的颗粒通过受抑全内反射(FTIR)或者通过测量所述表面附近结合的颗粒的散射光进行。
    本发明的另一方面涉及上文或下文所定义的磁性颗粒在检测样品中的靶分子中的用途。
    在本发明特别优选的实施方案中,上文所述的装置、方法或用途的上下文中所述的靶分子是心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。
    附图说明
    图1示出FTIR检测的原理。来自光源的光进入筒,从筒/流体界面反射并在检测器上成像。如果颗粒存在于在这个界面上产生的瞬逝场中,则反射的光强度降低。
    图2示出利用Magnotech技术的夹心免疫测定。在图(1)中,用针对靶标的一抗涂层磁性颗粒分散在样品液体中并结合靶标。在图(2)中,顶部和底部的线圈以脉冲方式驱动磁性颗粒,使得结合传感器表面,其中二抗可以结合至结合的靶分子。在图(3)中,未结合的颗粒从传感器表面移出,并且利用瞬逝场检测结合的颗粒。
    图3示出具有开或关的磁体的磁性颗粒。当磁体打开(左)时,颗粒形成大的串。由此,更少的颗粒足够接近表面而被检测(虚线表示的区域)。当磁 体关闭(右)时,颗??梢岳┥⒅链衅鞅砻?,部分地被顶部颗?!巴瞥狻?。
    图4示出对500-nm Ademtech颗粒测量的ζ电势,所述颗粒用链霉抗生物素蛋白分子功能化并且结合不同量的不同长度的生物素功能化的dsDNA。
    图5示出Magnotech FTIR测定期间生物传感器软件的截图。左边示出瞬逝场的图像。不同关注区域所获取的信号在右图中表示为时间函数。箭头表示信号的幅度,其是表面接触的量度。
    图6示出用不同量的生物素标记的97bp dsDNA进行的测定的FTIR信号幅度,所述dsDNA连接至500nm Ademtech超顺磁磁性颗粒,用链霉抗生物素蛋白功能化。每颗粒的DNA分子越多,表面接触越大。
    图7示出FTIR测定结束时的信号改变。首先,单个97bp dsDNA片段结合至链霉抗生物素蛋白颗粒,所述片段在分子的一端带有生物素,在DNA的另一端带有德克萨斯红分子。然而,每颗粒添加类似但缺少德克萨斯红分子的97bp DNA分子至指定的量。所有的颗粒在FTIR测定中用印刷点的抗德克萨斯红抗体进行测试。
    图8示出用短和长DNA片段功能化的颗粒。短DNA片段带有电荷足够大但是足够短以允许带有捕获剂的较长DNA片段移动的足够自由度。
    图9示出对500-nm Ademtech颗粒测量的流体力学大小(nm)和测量的ζ电势值(mV),所述颗粒用链霉抗生物素蛋白分子功能化,并且结合至不同量的不同长度的生物素功能化的dsDNA。
    具体实施方式
    本发明涉及用于检测样品中的靶分子的方式和方法。虽然参照具体实施方案描述本发明,但是说明书并不以限制的方式理解。
    在描述本发明的详细示例性实施方案之前,给出对于理解本发明重要的定义。
    如本说明书和所附的权利要求书中所用的,单数形式“一个(a)”和“一个(an)”也包括各自的复数形式,除非上下文明确指出。
    在本发明的上下文中,术语“约”和“大约”表示精度的区间,本领域技术人员会理解其仍然保证所关注的特征的技术效果。该属于通常表示指定 数值的±20%、优选±15%、更优选10%并且甚至更优选5%的偏差。
    应当理解,术语“包含”是非限制性的。对于本发明的目的,术语“由…组成”理解为术语“包含”的优选实施方案。如果下文中,某个组限定为包含至少一定数目的实施方案,这也涵盖优选仅由这些实施方案组成的组。
    此外,术语“第一”、“第二”、“第三”或者“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件,并不一定描述顺序或时间次序。应当理解,这样使用的术语在合适的情况下是互换的,并且本文所述的实施方案能够以除了本文描述或示例以外的其他顺序进行操作。
    当术语“第一”、“第二”、“第三”或者“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”等涉及方法或用途或测定的步骤时,步骤之间没有时间或时间间隔相干性,即步骤可以同时进行,或者这些步骤时间可以有数秒、数分钟或数小时的时间间隔,除非在本申请的上下文中明确指出。
    应当理解,本发明并不限于本文所述的具体方法、方案、试剂等,因为这些方法、方案、试剂等可以变化?;褂Φ崩斫?,本文所用的术语仅用于描述具体的实施方案,并不意图限制本发明的范围,其仅有所附的权利要求书限制。除非另外指明,本文所用的所有技术和科学术语具有本领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。
    如上文所示,本发明的一方面涉及一种用于检测样品中的靶分子的装置,其包括:样品容器,其用于测量样品中的靶分子;磁性颗粒,其中所述颗粒用第一结合分子和排斥表面结构功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至所述颗粒,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖所述磁性颗粒的表面,从而实现所述磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;以及传感器表面,其包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接结合所述传感器表面的所述第二结合分子;其中结合的颗粒的数目与存在于所述样品中的靶分子的量直接或反相关,并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。
    本发明还涵盖合适的装置,优选利用生物传感器系统检测靶分子的装置。检测测试样品或样品体积中分析物的存在和/或量的各种分析方法是本领域已知的。通常,这样的检测系统可以光学检测磁性颗粒,其用合适的 结合分子功能化以结合所关注的分析物。分析物的存在或量可以由结合磁性颗粒的分析物的数目得出。在本发明的含义中,包含本文所述的装置的生物传感器系统能够检测单个磁性颗粒并且通过磁场发生器产生的磁场驱动磁性颗粒。
    本文所用的“磁场发生器”包括本文所述的光磁装置中的一个或多个磁体,其用于对样品室产生磁场,其中所述磁场应该将磁性颗粒导向接触表面。磁场通常具有非零梯度,其允许在磁性(二级)颗粒上施加磁力。此类磁场发生器或者包含此类磁场发生器的合适系统的合适实例为本领域技术人员已知。在本发明的具体实施方案中,磁场发生器可以是Bruls et al.,Lab Chip,2009,9.2504-3510中所述的磁场发生器,或者包含于Ranzoni et al.,2011,Nano Lett.,11,2017–2022所述的系统或者是所述系统的一部分。
    通常,磁性颗??梢酝ü懦《?,从而可以加速分析方法。在本发明的具体实施方案中,还涵盖可以由于除去非特异性结合的颗粒而降低背景信号的磁场的用途。
    适合用于本发明的光磁系统可以包括例如生物传感器筒,其包含样品容器;用于感知磁性颗粒的传感器装置;检测系统;以及磁场发生器。在其他实施方案中,所述系统可以包含一个或多个额外的功能单元,如读取系统,例如显示器或打印机;数据库或计算机系统的界面;校准单元;与高通量装置的直接或间接连接。
    本发明还涵盖用于快速和即时分析的手持装置,其中可以插入包含测定格式的筒。通常,此类装置包含电源,优选为可充电电池的形式;显示器;无线连接,如用于快速数据库接入的WLAN;或者与实验室信息系统的接入。典型的生物传感器系统例如描述于Bruls et al.,Lab Chip,2009,9.2504-3510。
    特别优选基于磁性颗粒的光学检测的传感装置。不受其限制,示例性装置示于图1,其包含光源和光检测系统。
    本文所用的“样品”指任何样品,其包括本文所定义的靶分子。此类样品可以包括例如,源自或包含以下的样品:粪便、全血、血清、血浆、泪液、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖液、乳液(breast fluid)、乳、初乳、胎液、羊水、汗液、滑液、腹水、脑脊液、胆汁、胃液、房水、玻璃体液、胃肠 液、分泌液、渗出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、收获自免疫应答位点的液体、收获自混合手机位点的液体、支气管灌洗液、尿液、活检材料(例如来自合适的器官如肺、肌肉、脑、肝、皮肤、胰腺、胃等)、有核细胞样品、与粘膜表面、毛发或皮肤有关的液体。此外,也可以使用来自环境来源的样品,如水样品、肉或禽类样品、来自可能的污染的样品。
    本文所用的术语“靶分子”指通过结合分子结合的任何分子,并且可以是生物学物质,如生物分子,优选生物标记,复合物,细胞部分或细胞。优选地,本发明上下文中的靶分子为核酸,如DNA或RNA分子,或者寡核苷酸,如DNA或RNA寡核苷酸分子。甚至更优选的靶分子例如肽、多肽或蛋白、蛋白或多肽片段、或者功能性蛋白或多肽结构域、药物分子、小分子或维生素。
    靶分子可以直接获得自上文所述的样品。在其他情况下,对样品可以直接进行样品制备技术,例如基于标准方案,包括例如部分纯化,其使得靶分子更接近结合配对物(partner),即如本文所定义的亲和力分子。例如,可以将血液样品离心以分离包括全细胞或膜的部分与血清,可以将粪便样品切片并用生理学可接受的缓冲液和去垢剂匀浆,可以将痰样品液化并分级分离。此外,可以向样品添加抗生素或杀菌剂以防止任何存在的生物体的进一步生长?;箍梢猿ト赴蛘呓赴呀庖允头潘堑哪谌菸?。
    本文所用的“样品容器”指其中测量样品的由任何合适的材料制成的容器,如玻璃、任何透明塑料或半导体。本文所述的磁性颗??梢栽谝胙肥币丫嬖谟谘啡萜髦?,可以与样品一起引入,或者可以在样品已经注入样品容器后引入。样品容器还可以包含传感器表面,其包含第二结合分子。优选地,传感器表面位于样品容器的底部。在具体实施方案中,样品容器可以位于可替换的筒中,例如与传感器装置分离的单独组件中。由于样品可能的污染,这样的筒可以优选地为一次性物品,例如通过注塑由塑料制成。本发明还涵盖可回收的筒或者可回收的筒部件,例如可以清洁或灭菌的筒或筒部件。
    本文所用的“传感器表面”限定实际传感器事件发生或被检测的面积。通常,传感器表面位于样品容器的底部。传感器表面可以用于检测结合的 颗粒的数目,其与存在于样品中的靶分子的量直接或反相关??梢杂糜诒痉⒚鞯纳舷挛闹械拇死啻衅鞅砻婧投杂Φ拇衅魈峁┯贐ruls et al.,2009,Lab Chip,9,3504-3510。
    本文所用的“磁性颗?!北硎拘〉木植课锾?,其可以具有物理性质如体积或质量。术语“磁性颗?!庇Φ卑ㄓ谰么判钥帕R约翱纱呕帕?,如超顺磁磁性颗粒。
    本文所用的术语“超顺磁性”描述磁性的一种形式,其在小的铁磁性或铁磁体纳米颗粒中出现。本领域中已知,在足够小的纳米颗粒中,磁化可以在温度的影响下随机地变换方向。两个变换之间的时间称为Néel释放时间。在没有外部磁场的情况下,当用于测量纳米的磁化的时间远长于Néel释放时间时,磁化看起来平均为0,即在顺磁状态。在这样的状态下,外部磁场能够类似地将纳米颗粒磁化为顺磁体。然而,磁化性远大于顺磁体。
    在本发明特别优选的实施方案中,材料或颗粒如纳米颗??梢允浅炒糯判钥帕?,其通常分散在水溶液中并保持少量电荷,如负电荷或正电荷,或者具有一定的ζ电势以确保胶体稳定性,保持颗粒分离并避免非特异性簇集。
    此外,颗粒对于其运送和性质基本上表现为整体单元。因此,磁性颗??梢允嵌猿频?、球形、基本上球形或球体,或者可以是不规则、不对称的形状或形式。
    本发明涵盖的磁性颗粒的大小通常为3nm-50μm。优选纳米和微米至高达数微米的磁性颗粒。在特别优选的实施方案中,颗粒直径大于100nm。本文所用的术语“直径”指通过颗粒中心的任何直线段,并且其终点位于颗粒表面。在非球形或半球形颗粒的情况下,直径理解为通过颗粒中心的最大和最短直线段的平均直径,并且其终点位于颗粒表面。应当理解,本文所定义的颗粒的半径是上文所定义的直径的一半。特别优选磁性纳米颗粒,例如直径为约100nm-10微米,更优选100nm-3μm,甚至更优选300nm-1000nm,例如300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、 600nm、620nm、650nm、670nm、700nm、720nm、750nm、770nm、800nm、820nm、850nm、870nm、900nm、920nm、950nm、970nm、1000nm,或者其中的任何值。甚至更优选直径为约500nm的磁性纳米颗粒。
    本发明的磁性颗粒用第一结合分子功能化。本发明还涵盖进一步包含如本文所定义的排斥表面结构的磁性颗粒。
    本文所用的术语“结合分子”指对第二分子具有高结合亲和力的任何分子,即相互作用配对物。本发明含义中的结合分子通常包含结合或捕获部分,其能够结合本文所定义特异性靶分子如生物分子或生物标记或者能够结合包含分子的靶实体如病毒或者细胞或细胞片段或者从组织衍生的物质。
    在特别优选的实施方案中,结合分子选自适体、肽、蛋白、寡核苷酸特别是互补核酸和分子印迹聚合物、配体或受体以及凝集素,其中所述结合分子优选为抗体或其片段或互补核酸。
    结合分子的上下文中所用的“适体”可以是短核酸分子如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子,或者任何本领域技术人员已知的其他合适的核酸形式,其能够结合本文所定义的靶分子,优选本文所定义的核酸靶分子。此外,本发明涵盖肽适体,即能够特异性地结合包含特定氨基酸序列的蛋白、多肽或肽的适体。
    术语“PNA”涉及肽核酸,即人工合成的类似于DNA或RNA的聚合物,其用于生物学研究和医疗,但是并不天然存在。PNA骨架通常包含通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至骨架。PNA通常像肽一样描述,N-端在第一(左)位置,并且C-端在右。虽然DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖骨架,但是PNA-骨架包含通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元。本领域已知PNA寡聚物也在结合互补DNA中表现出较大的特异性。进一步的细节可以来自任何合适的文献来源或教科书,例如Nielsen PE,Egholm M(1999),An Introduction to Peptide Nucleic Acid,Curr.Issues Mol.Biol.1(2):89–104。
    术语“CNA”涉及氨基环己基乙酸核酸。此外,该术语涉及环戊烷核酸,即包含例如2'-脱氧氨基甲酰尿苷(2'-deoxycarbaguanosine)。
    术语“HNA”涉及己糖醇核酸,即由标准核酸碱基和磷酸化1,5-失水己糖醇骨架构成的DNA类似物。
    术语“LNA”涉及锁核酸。通常,锁核酸是修饰的,因而是难以接触的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以由连接2'和4'碳的额外的桥修饰。这样的桥锁住3'-内结构构象中的核糖。锁住的核糖构象增强碱基堆积和骨架预组织。这可以明显地增加热稳定性,即寡核苷酸的熔解温度。
    术语“ANA”涉及阿拉伯糖核酸或其衍生物。本发明的上下文中优选的ANA衍生物为2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖苷(2'F-ANA)。
    通常,肽适体为可变的肽环,其包含例如10-20个氨基酸。在本发明的上下文中,在具体的实施方案中,肽适体可以在一端或两端连接至支架结构。支架结构可以是任何分子,优选蛋白,例如具有良好的溶解性的蛋白。合适的支架分子是本领域技术人员已知的。本发明的上下文中所用的合适支架分子的实例有细菌蛋白硫氧还蛋白-A。适体肽环可以优选地插入支架分子的还原活性位点中?;蛘?,葡萄球菌蛋白A及其结构域和这些结构域的衍生物如蛋白Z或脂钙蛋白可以用作本发明上下文中的支架结构。核酸或肽适体可以根据本领域技术人员已知的任何合适方法产生,例如通过PCR或分子合成方法或酵母双杂交方法。
    结合分子的上下文中所用的“肽”可以包括2-35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的簇或者由2-35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的簇组成。肽可以是线性、分支、环状的或其混合物。肽亲和力分子还可以连接至上文所定义的支架结构。
    结合分子的上下文中所用的“蛋白”可以包含多于约35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的簇或者由含多于约35个氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的簇组成。蛋白可以为线性、分支、环状形式,或者包含这些形式的混合物。蛋白结合分子还可以连接至上文所定义的支架结构。
    结合分子的上下文中所用的“寡核苷酸”可以包含约5-120个核苷酸的簇或者由约5-120个核苷酸的簇组成,例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸的簇,优选约15-60个核苷酸。寡核苷酸结合分子可以优选为RNA分子或DNA分子,或者这两者的混合物。
    本发明还涵盖结合分子,其为互补核酸分子。术语“互补分子”指限定 序列的分子,其中单链是互相互补的。本领域已知,双链核酸分子的互补链由于形成碱基对而互相具有强亲和力?;购堑チ垂押塑账嵝蛄?,其连接或整合入本文所定义的接头分子结构。在特别优选的实施方案中,合适的接头还包含核酸分子或由核酸分子组成。单链的簇能够以高亲和力识别所关注的互补核苷酸序列并与其杂交。在这样的分析中,靶分子包含寡核苷酸,其与结合分子互补或几乎互补。
    本文所用的术语“分子印迹聚合物”指在分子的存在下形成的聚合物,所述分子被剥离而留下互补的空腔。通常,分子印迹聚合物对原始分子表现出一定的化学亲和力。分子印迹聚合物可以包含本领域技术人员已知的任何合适的聚合单元。它们的制备技术包括聚合技术如混合(bulk)、沉淀、乳化、悬浮、分散、胶凝和多步溶胀聚合。特别优选分层印迹方法。
    结合分子的上下文中所用的“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以为任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、lgG4、lgA1和IgA2)或者免疫球蛋白分子的亚类。本发明的抗体可以对于识别或特异性结合的靶分子如本发明的多肽的表位或部分而描述或指定。特异性表位及其与抗体的相互作用是本领域技术人员已知的。本文所用的术语“特异性结合”指抗体对抗原性表位的免疫特异性检测和结合。术语“特异性结合”排除非特异性结合,但是并不一定排除与其他抗原的交叉反应性,特别是与包含通过本发明的抗体检测的相同抗原性表位的抗原的交叉反应性。
    抗体可以是多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体,单链抗体或者构成Fab片段、Fab'片段、通过Fab表达文库产生的片段、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、小抗体(minibody)、二抗体(diabody)、scFv、sc(Fv)2、全免疫球蛋白分子、小??槊庖咭┪?SMIP)、结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼(camelized)抗体、含VHH抗体、抗独特型(抗-Id)抗体、上述的任何表位结合片段。最优选地,抗体为本发明的人抗原结合抗体片段并且包括Fab、Fab'和F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)以及包含VL或VH结构域的片段。
    本发明的抗体可以来自任何动物来源,包括鸟和哺乳动物。优选地, 抗体为人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驴、猴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。
    本发明的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或者更高的多特异性的。多特异性抗体可以对靶分子如本发明的多肽的不同表位具有特异性,或者对靶分子如本发明的多肽以及异源表位如异源多肽或固体支持材料具有特异性。优选单特异性抗体。
    本文所用的术语“配体”通常指与靶分子如生物分子形成复合物从而可以以高结合亲和力结合所述分子的物质。特别地,配体可以是能够结合靶蛋白上的位点的信号引发分子。配体通常结合称为受体的结合配对物。用于检测靶分子的受体-配体结合系统是本领域已知的。通常,配体结合受体改变化学构象,即受体蛋白的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。本发明的上下文中合适的配体可以包括例如酶底物、酶抑制剂、受体激动剂和拮抗剂、活化蛋白如DNA结合蛋白或者神经递质。
    本文所用的术语“凝集素”指蛋白或糖蛋白,其能够特异性识别并可逆地结合复合糖缀合物的碳水化合物部分而不改变识别的任何糖基配体的共价结构。本发明的上下文中合适的凝集素的实例包括单价凝集素如细菌和植物毒素,其能够结合细胞壁或膜中的糖部分。本发明的含义中其他合适的凝集素有甘露糖结合凝集素、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素或岩藻糖结合凝集素。
    本文所用的术语“第一结合分子”指本文所述的结合分子,其能够特异性结合样品中的靶分子。第一结合分子可以通过本领域已知的任何合适的方法或者以任何合适的方式连接至磁性颗粒表面,例如经由下文所定义的接头分子和/或排斥表面结构,或者直接与磁性颗粒表面接触。
    本文所用的术语“连接至颗?!敝傅谝唤岷戏肿庸布刍蚍枪布劢岷匣蛘吲剂链判钥帕?。特别地,这样的偶联可以例如为层之间的共价结合、范德华结合或静电结合。对磁性颗粒的连接可以是可逆的,或者可以可终止的,例如通过改变pH、温度、离子浓度,通过用光照射,通过酶促降解或者酶促切割等。在某些实施方案中,第一结合分子可以通过接头结构如本文所定义的接头分子连接至颗粒。用于此目的的第一结合分子可以偶联至接头分子,其又直接或间接连接至颗粒表面。第一结合分子还可以偶联至 本文所定义的排斥结构。本发明还涵盖第一结合分子可以直接与磁性颗粒表面直接接触。
    在本发明的具体实施方案中,第一结合分子偶联、结合或连接至磁性颗?;蚩帕1砻婊蛘咂酱衅鞅砻婵梢允侵苯踊蚣浣咏岷?。
    本文所用的术语“直接结合”表示第一结合分子立即连接至磁性颗粒而不存在中间、桥接或连接物分子或官能团。
    本文所用的术语“间接结合”表示结合分子并不直接连接至磁性颗粒的表面,而是可以间接地经由其他中间、桥接或连接物分子间接地连接,例如其他结合分子、接头分子或带电结构。例如,抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白衍生物、(链霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白-相关蛋白、抗生物素蛋白-样实体如tamavidin1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用作磁性颗粒与包含相容的结合部分如生物素的相互作用分子之间的连接物。在具体实施方案中,磁性颗??梢杂每股锼氐鞍谆蛄疵箍股锼氐鞍琢游锿坎慊蚋哺?。用作连接物分子的相互作用对的更优选的实例有生物素/抗生物素蛋白、任何抗体/抗原对,如抗FITC/FITC、抗-得克萨斯红/得克萨斯红、抗-地高辛/地高辛以及上文所述的核酸互补链。本发明特别地涵盖核酸互补链的用途,这是由于几乎无限的特异性组合而导致的高度倍增。本领域技术人员还应当理解,由核酸序列组成或包含核酸序列的此类连接物分子可以容易地整合入接头结构。
    本文所用的术语“排斥表面结构”指可以直接或间接连接至本文所述的磁性颗粒的表面的结构。优选排斥表面结构直接连接至磁性颗粒的表面,即其立即连接至磁性颗粒而不存在中间、桥接或连接物分子或官能团。
    本发明含义中的排斥表面结构包括能够赋予排斥力的分子、聚合物和/或分子的筛。本文所用的术语“排斥力”指导致分子或颗粒的排斥的力。本发明优选涵盖磁性颗粒的排斥。通常,颗粒之间的排斥力可以是颗粒间力的结果,例如排除体积排斥、静电排斥、熵力或聚合物覆盖的表面之间的立体力。术语“排除体积排斥”表示固体颗粒之间不可能有任何重叠,或者当适用时包括存在与颗粒上的表面结构在内的固体颗粒之间不可能有任何重叠。
    当颗粒带有净电荷时观察到颗粒之间的“静电排斥”。如果两个带有相 同的净电荷,即正电或负电,则它们会彼此排斥。术语“熵力”指基于热力学第二定律的力,其描述系统趋向于熵增的趋势。这可以导致固体球如磁性颗粒之间有效的排斥力。术语“立体排斥力”基于立体效果。应当理解,在原子水平,立体效果源自分子中的每个原子占据一定的立体。如果使原子互相接近,能量的相关耗费由于电子云重叠而变得很高(泡利或伯恩不相容),并且可能影响分子优选的形状或构象以及反应性。因此,立体阻碍或立体效果可以视为单个原子的电子云之间的排斥,并且原则上可以定义为原子水平上的静电排斥的结果。
    本文所用的短语“其中所述排斥表面结构将静电和/或立体推送作用赋予至所述传感器表面”表示颗粒的整个集合被推向传感器表面。这种整体推送作用基于磁性颗粒的排斥表面结构的静电推送作用,例如两个或更多个颗粒之间的静电推送作用,或者磁性颗粒的排斥表面结构立体推送作用,例如两个或更多个颗粒之间的立体推送作用,或者磁性颗粒的静电推送作用和立体推送作用的组合,例如两个或更多个颗粒之间。整体推送作用可以取决于测定的颗粒的数目、传感器表面附近的颗粒的数目、两个或更多个颗粒的整体电荷、静电比立体推送的比例以及本领域技术人员已知的其他参数。这些参数可以根据如本文所述的装置或进行的测定的特定需要和必要进行调整和/或改进。
    在本发明的另一优选实施方案中,上文所定义的整体推送作用通过测量表面相互作用的增加来确定。本文所用的术语“表面相互作用的增加”指由于本发明的磁性颗粒之间的排斥力而存在于或接近传感器表面的颗粒的量或数目的增加?;谎灾?,表面相互作用的增加因此表示颗粒与传感器表面的相互作用的增加。表面相互作用的增加可以通过颗?;ǚ言谟氪衅鞅砻娼裘芙哟サ氖奔涞牧坷床饬?。术语“紧密接触”表示颗粒接近或位于传感器表面,从而利用合适的测量方法,在足够接近传感器表面时产生信号,例如光信号。用于测量磁性颗粒接近或位于传感器表面的合适方法为本领域技术人员已知,并已经描述于例如Bruls et al.,Lab Chip,2009,9.2504-3510。
    在本发明的优选实施方案中,表面相互作用中的增加通过在测量测定过程中的信号幅度进行测定。不限制于此,测定表面相互作用增加的一个 考虑实例是经由如本文描述的受抑全内反射(FTIR)的信号幅度测量。所得到的FTIR信号幅度随后对应于在瞬逝场中存在的颗粒数目。
    表面相互作用的增加由以下进行计算:起因于使用用如上文所定义的排斥表面结构功能化的颗粒例如磁性颗粒测量的信号幅度,相对于起因于使用非功能化颗粒例如磁性颗粒(即不含任何排斥表面结构的颗粒)测量的信号幅度。例如,如果表面接触的增加增加两倍,即使用由排斥表面结构功能化的磁性颗粒的信号幅度是非功能化颗粒例如磁性颗粒的信号幅度的两倍,则表面相互作用中的增加是100%。
    在本发明的优选实施方案中,颗粒与传感器表面之间的表面相互作用的增加可以为至少约1%。表面相互作用的增加可以为例如1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、140%、160%,180%、200%、220%、240%、260%、280%、300%、320%、340%、360%、380%、400%、420%、440%、460%、480%、500%或大于500%。
    在本发明特别优选的实施方案中,排斥表面结构可以是存在于磁性颗粒上的带电结构或立体涂层。
    本文所用的“立体涂层”指表面结构,其可以以涂层的形式存在于磁性颗粒上,并且其提供磁性颗粒之间的排斥。本发明所涵盖的一个重要效果是这样的立体涂层的存在会导致磁性颗粒增加的相互排斥,所述排斥又导致形成推斥力,从而使得磁性颗粒推向平板传感器,而无需如现有技术所述增加磁性颗粒浓度(推送作用)。应当理解,此类立体涂层的立体阻碍产生如本文所述的立体推送作用。因此,所涵盖的方法的效果是磁性颗粒的表面接触随磁性颗粒的排斥力而增加,从而导致增加的反应速率并最终导致测定结束时增加的信号改变。本领域技术人员应当理解,立体推送作用可以借助于如下文所述的磁性颗粒的流体力学半径来测量。
    本发明描述一种如何实现这样的立体推送作用的方式,即通过在磁性颗粒表面上提供可以充当立体涂层或屏障的分子的筛以防止不相关分子的非特异性结合,或者将其他分子或磁性颗粒保持在一定的距离。本领域技术人员应当理解,具有这样的立体涂层的磁性颗粒,例如包含分子的筛的涂层的形式,可以施加一定的立体排斥。
    在颗粒上的涂层可以是这样的,从而使得它们形成分子的网络或筛。因此,本发明的涂布层可以包含小单元或实体,其具有相同或相似的化学、物理和/或生物性质。优选地,如本文描述的涂布层可以包含能够形成一定长度的聚合物的生物或化学分子。合适的聚合物有例如碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树枝状聚合物、树状分子、纳米管或其混合物。优选地,这些聚合实体包含在接头或间隔分子中。在本发明的具体实施方案中,涂层可以包含单一表面层或多层壳结构。
    本文所用的术语“间隔分子”指主要具有间隔功能的分子。为此目的,这些聚合分子具有一定长度和强度,以便能够如同聚合纤维起作用。
    在本发明的具体实施方案中,间隔分子的长度可以为高达约500nm,例如高达约450、400、350、300、250nm、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10nm.
    在本发明的进一步具体的实施方案中,间隔分子可以是线性、环状或分支样分子或其混合物。如果它们是分支的,则它们可以以不同程度分支,例如显示2、3、4、4或更多的分层水平。本发明进一步涵盖在网络、层或壳结构内的间隔分子的不同类型例如线性和分支、不同分支度、不同间隔物长度等的组合。在本发明的替代实施方案中,间隔分子或间隔分子的混合物提供均匀的筛或网络,即具有基本上相同大小的开口的平均间隔的筛或网络?;箍悸巧缚梢杂肟谝黄鹛峁?。特别优选如果筛如此均匀,从而使得筛就分子可接近性和分子的运动自由而言的功能性质是均匀的。这些参数可以由间隔分子的长度、分支度等进行调整。
    在本发明的进一步具体实施方案中,间隔分子可以直接或间接互连,以便形成三维的分子的筛。此类互连可以基于在分子末端处的官能团,或位于分子中心,例如在考虑分支的情况下?;チ?、其程度等的控制可以根据本领域技术人员已知的原则和方法实现,所述原则和方法例如来自合格教科书例如"Bioconjugate techniques",Hermanson,2nd Ed.Academic Press,Elsevier"或"Dendrimers and other dendritic polymers"Frechet和Tomalia,J.Wiley。
    在本发明的上下文中的合适间隔分子可以例如是如本文所定义的碳水化合物、脂质、聚乙二醇(PEG)、多糖、树枝状聚合物、树状分子或纳米管、 或其合适衍生物或组合。间隔分子组可以进一步包含基于烃的表面活性剂、胆固醇、糖脂、胆汁酸、皂苷、脂肪酸、合成两亲嵌段共聚物、天然产物如蛋黄磷脂。
    适合于立体涂层的间隔分子的优选实例是聚乙二醇(PEG)分子。聚乙二醇分子能够在表面上形成致密和大体积的分子的筛。本领域技术人员还应当理解PEG分子可以互连,以形成如本文上文描述的合适立体涂层。用于PEG分子互连的合适分子是如本文描述的连接物分子。长度可以根据以下决定:考虑的所得到的涂布层的总体厚度,考虑的接头分子长度,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的每磁性颗粒的结构分子数目。
    本发明还涵盖的是在颗粒上连接的聚乙二醇分子数目。应当理解连接至颗粒的分子越多,涂布层的密度和厚度越高,引起通过立体效应的颗粒-颗粒排斥。因此应当理解颗粒的立体排斥取决于涂布层的厚度,其取决于磁性颗粒上的PEG分子数目、PEG分子长度和PEG分子之间的键数目。每颗粒的分子数目可以是至少约10、20、30、40、50、60、70、80或90,更优选至少约100、150、200、250,甚至更优选至少约300、350、400或450,且最优选至少约500或1000。
    在本发明的其他实施方案中,连接至颗粒的上文所定义的聚乙二醇分子数目可以改变。在具体实施方案中,每磁性颗粒的聚乙二醇分子的数目可以设定为约10、20、30、40、50、60、70、80或90个,更优选约100、150、200、250,甚至更优选约300、350、400或450个,并且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个。在其他实施方案中,每磁性颗粒的聚乙二醇分子的数目可以设定为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000个或更多个。每磁性颗粒的聚乙二醇分子数目可以进一步取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、磁性颗粒大小 或直径和磁性颗粒长度之间的比例、聚乙二醇分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。
    在其他实施方案中,磁性颗粒由聚乙二醇分子的表面覆盖率可以是磁性颗粒的总表面的约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或者这些值之间的任何值。
    在其他实施方案中,本文所定义的立体涂层赋予本文所定义的磁性颗粒半径的至少约105%的本发明的磁性颗粒的流体力学半径。本文所用的术语“磁性颗粒的流体力学半径”指在溶液中包含立体涂层的水合颗粒的有效半径,或在溶液中包含立体涂层的颗粒的表观大小。优选地,立体涂层指大量例如所有分子均促成如本文描述的立体效应。本文所定义的包含立体涂层的颗粒的流体力学半径可以是本文所定义的颗粒半径,特别是不包含此类立体涂层的颗粒半径的至少约105%。本文所定义的包含立体涂层的颗粒的流体力学半径可以是本文所定义的颗粒例如磁性颗粒,特别是不包含此类立体涂层的磁性颗粒半径的约105%、110%、120%、125%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%或这些值之间的任何值或更多。
    在本发明的其他特别优选的实施方案中,磁性颗??梢园缃峁?,以便生成颗粒间的排斥力。本文所用的术语“带电结构”指促成本发明的磁性颗粒的净电荷的实体。本发明的带电结构可以具有可以为正或负的净电荷。应当理解带电结构并不限于特定类型或形式的分子。带电结构可以例如包含一个类型的分子或者两个或更多个不同类型的分子的聚合物,不同分子或实体的复合物,或包含具有不同电荷的几种分子的化合物,例如不同正电荷、不同负电荷、或(不同)正和负电荷,导致正或负电荷总体净电荷。用于电荷计算的工具和方法是技术人员已知的,例如来自Dewar,M.J.S.,The Molecular Orbital Theory of Organic Chemistry,McGraw-Hill,and Inc.,1969或Stewart,R.,The Proton:Applications to Organic Chemistry,Academic Press,Inc.,1985,72。
    在本发明的具体实施方案中,带电结构可以直接或间接连接至磁性颗粒,以导致磁性颗粒的特定净电荷。特定净电荷可以是正或负的?;箍煽?虑不同带电结构连接至相同磁性颗粒上,以导致带电结构的混合物。在本发明的上下文中,带电结构可以覆盖颗粒表面,以提供具有特定净电荷的总体带电分子。本领域技术人员已知纳米颗粒的净电荷可以例如经由测量ζ电势进行确定。
    一个考虑的优点是由于颗粒优选磁性颗粒上增加的电荷的存在而增加的排斥引起增加的静电排斥,其又使磁性颗粒的非特异性簇集降到最低。非特异性簇集的减少可以帮助减少背景水平,而无需使用表面活性剂,因此引起如本文描述的光磁检测测定中的空白水平的改善,并且因此改善检测限度。本发明涵盖另一个重要效果是在磁性颗粒上增加的电荷(负或正电荷)的存在,将导致增加的磁性颗粒相互静电排斥,其依次引起静电“推送”力的形成,因此导致磁性颗粒朝向平面传感器的推送,而无需如本领域描述的增加颗粒浓度??悸堑姆椒ň哂写判钥帕5谋砻娼哟タ梢运孀糯判钥帕5绾稍黾拥男Ч?,因此引起增加的反应速率和最终在测定结束时增加的信号改变。
    在其他优选实施方案中,通过提供包含带电结构或由带电结构组成的如本文描述的接头分子,或通过提供连接至磁性颗粒的带电结构加上接头分子,可以实现在磁性颗粒上增加的电荷存在。
    在本发明的具体实施方案中,带电结构可以覆盖磁性颗粒的整个表面,以便提供具有特定净电荷的总体带电分子。在可替代的实施方案中,带电结构可以仅覆盖磁性颗粒的部分、区域或扇区,例如10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%or100%或更少的磁性颗粒总表面,或这些值之间的任何值。
    在本发明的其他实施方案中,连接至磁性颗粒的带电结构分子的数目可以例如按照考虑的颗粒总体净电荷加以改变。应当理解颗粒的总体净电荷改变,例如随着连接至磁性颗粒的带电分子的数目而增加或减少。ζ电势(mV)可以相应地随着渐增的分子长度而增加(负)。
    因此可考虑磁性颗粒上存在的电荷总和促成总体净电荷。进一步理解磁性颗粒的总体净电荷尤其是磁性颗粒上存在的分子数目和分子长度、其正或负电荷等的函数。在具体实施方案中,每磁性颗粒的带电结构分子数 目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80、or90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每磁性颗粒的带电结构分子数目可以是不同的或取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电结构分子的分子或化学同一性、考虑的用途例如测定或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。
    为了获得如本文所述的这种静电推送效应的合适带电结构可以包含能够促成特定净电荷的生物或化学结构或化合物,例如核酸、核糖核酸、肽、多肽或蛋白、碳水化合物、脂质、或多糖、或其任何合适的衍生物或组合?;购撬汉途酆洗缃峁?。优选使用基于核酸的带电结构分子。
    “基于核酸的带电结构分子”可以是任何核酸分子、或其衍生物或类似物。此类带电结构分子可以例如包含单链和/或双链DNA或RNA分子、或其任何类型的衍生物。此类带电结构分子可以进一步包含以下或由以下组成:上文所定义的PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子,或其任何混合物或组合,例如DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA和ANA中的任何一种的组合,或LNA核苷酸与DNA或RNA碱基的混合物,或具有本文所定义的任何其他带电结构分子的任何混合物或组合。在基于核酸的带电结构的上下文中,核酸或其类似物可以另外与携带电荷的化学基团或单位一起提供。例如,可以包括或添加磷酸基、带电氮衍生物或带电硫衍生物。此外,可以通过提供其中至少一种分子包含电荷的双链体分子,例如包含DNA的双链体来积累电荷。
    在本发明特别优选的实施方案中,磁性颗??梢杂每梢跃哂胁煌ざ鹊拇缃峁菇泄δ芑?,所述带电结构例如单链或双链核酸特别是dsDNA。磁性颗粒上的电荷可以相应地借助于其ζ电势进行测量。本发明涵盖磁性 颗粒的表面接触随着磁性颗粒的电荷而增加,因此引起增加的反应速率和最终在测定结束时增加的信号改变。在本发明的特定实施方案中,带电结构例如核酸可以以双链或双链体形式存在,即包含由链间的碱基配对结合的核酸分子的链和互补或反平行相反链,或核酸分子的有义或反义链?;蛘?,带电结构可以包含单链核酸或单链核糖核酸分子。
    在本发明特别优选的实施方案中,带电结构包含选自以下的分子:双链或dsDNA、双链或dsRNA、PNA、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体?;褂杀痉⒚鹘徊接叛∈凳┓桨负堑囊桓鲇欣矫媸荘NA和PNA/DNA或PNA/DNA双链体无法由核酸酶或蛋白酶容易识别,使得它们对酶促降解具有抗性。
    在本发明的其他实施方案中,合适的基于核酸的带电结构分子还可以包含具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子,或由具有不同碱基组成和/或长度的单链DNA分子组成。单链分子可以例如包含碱基序列的重复,是完全随机的,或衍生自自然界,或仅具有一种碱基。
    如上文定义的基于核酸的带电结构分子或其组合可以具有不同的碱基组成和/或长度。分子的长度可以在约5个核苷酸至约5000个氨基酸之间改变,优选约50个核苷酸至约3000个核苷酸,甚至更优选约100个核苷酸至约2000个核苷酸,最优选约400个核苷酸至约1000个核苷酸?;购窃谒痉段诘钠渌ざ然蛉魏纬ざ戎?。分子可以例如具有约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000个核苷酸或更多,或所述值之间的任何数目的核苷酸的长度。
    基于核酸的带电结构分子的长度可以取决于以下决定:考虑的总体特定净电荷,考虑的接头分子长度,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的每磁性颗粒的带电结构分子数目。用于计算净电荷的合适方法将是本领域技术人员已知的,或可以源自合适的文献来源。
    在本发明的其他实施方案中,连接至磁性颗粒的上文所定义的基于核酸的带电结构分子数目可以例如按照考虑的磁性颗粒总体净电荷加以改变。应当理解磁性颗粒的总体净电荷改变,例如随着连接至磁性颗粒的基 于核酸的带电结构分子数目而增加或减少。在具体实施方案中,每磁性颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以设定为约10、20、30、40、50、60、70、80或90,更优选约100、150、200、250,甚至更优选约300、350、400或450,且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在其他实施方案中,每磁性颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以设定为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000或150000。每磁性颗粒的基于核酸的带电结构分子数目可以进一步取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、磁性颗粒大小或直径和磁性颗粒长度之间的比例、基于核酸的带电结构分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在其他实施方案中,磁性颗粒由基于核酸的带电结构分子的表面覆盖率可以是颗粒的总体表面的约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或者这些值之间的任何值。
    由于在氨基酸内的带电实体的存在,例如上文所定义的肽分子、多肽分子或蛋白分子还可以是或包含合适的带电结构。本领域描述在氨基酸中发现的胺和羧酸官能团允许其具有两性性质。羧酸基团(-CO2H)可以去质子化,以变成负羧酸盐(-CO2-),并且α-氨基(NH2-)可以质子化,以变成正α-铵基(+NH3-)。技术人员还了解在大于羧酸基团的pKa的pH值时,负羧酸盐离子占优势。在低于α-铵基的pKa的pH值时,氮占优势地质子化为带正电的α-铵基。本领域技术人员还应当知道氨基酸的净电荷取决于pH和pKa值。计算氨基酸、肽、多肽或蛋白的净电荷的工具和方法是本领域技术人员已知的,或可以源自自合适的文献来源例如Compute pI/Mw工具,其允许计算UniProt Knowledgebase(Swiss-Prot或TrEMBL)条目列表或用户输入序列(Gasteiger E.等人;Protein Identification and Analysis Tools on the  ExPASy Server;(In)John M.Walker(编辑):The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press(2005)的理论pI(等电点)和Mw(分子量)。
    此类肽、多肽或蛋白带电结构可以具有不同的氨基酸组成和/或长度。长度可以取决于以下决定:考虑的总体特定净电荷,考虑的接头分子长度,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的每磁性颗粒的带电结构分子数目。应当理解磁性颗粒的总体净电荷是磁性颗粒上的蛋白或肽分子数目和分子长度的函数。
    在本发明的其他实施方案中,连接至磁性颗粒的上文所定义的带电肽、多肽或蛋白分子数目可以例如按照考虑的磁性颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中,每磁性颗粒的带电肽、多肽或蛋白分子数目可以设定为约10、20、30、40、50、60、70、80或90,更优选约100、150、200、250,甚至更优选约300、350、400或450,且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在进一步的实施方案中,每磁性颗粒的带电肽、多肽或蛋白分子数目可以设定为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每磁性颗粒的带电肽、多肽或蛋白分子数目可以进一步取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、磁性颗粒大小或直径和磁性颗粒长度之间的比例、带电多肽或蛋白分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中,磁性颗粒由带电肽、多肽或蛋白分子的表面覆盖率可以是磁性颗粒的总体表面的约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或者这些值之间的任何值。
    在其他实施方案中,带电结构还可以是或包含例如上文所定义的碳水化合物分子,其包含能够促成在磁性颗粒上的总体净电荷的带电实体。此 类碳水化合物可以具有不同的组成和/或长度。长度可以取决于以下决定:考虑的总体特定净电荷,考虑的接头分子长度,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的每磁性颗粒的带电结构分子数目。
    在本发明的其他实施方案中,连接至颗粒的上文所定义的带电碳水化合物分子数目可以例如按照考虑的磁性颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中,每磁性颗粒的带电碳水化合物分子数目可以设定为约10、20、30、40、50、60、70、80或90,更优选约100、150、200、250,甚至更优选约300、350、400或450,且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在其他实施方案中,每磁性颗粒的带电碳水化合物分子数目可以设定为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每磁性颗粒的带电碳水化合物分子数目可以进一步取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、磁性颗粒大小或直径和磁性颗粒长度之间的比例、带电碳水化合物分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在进一步的实施方案中,磁性颗粒由带电碳水化合物分子的表面覆盖率可以是颗粒的总体表面的约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或者这些值之间的任何值。
    合适的带电结构还可以是例如上文所定义的任何脂质分子,其包含能够促成在磁性颗粒上的总体净电荷的带电实体。脂质尤其是磷脂中的电荷通常由首基的电荷决定。能够赋予脂质分子净电荷的合适首基的优选实例是选自以下的首基:磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)或其任何组合。
    此类脂质可以具有不同的组成和/或长度。长度可以取决于以下决定:考虑的总体特定净电荷,考虑的接头分子长度,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的带电结构分子数目/颗粒。
    在本发明的其他实施方案中,连接至磁性颗粒的上文所定义的带电脂质分子数目可以例如按照考虑的颗粒总体净电荷加以改变。在具体实施方案中,每磁性颗粒的带电脂质分子数目可以设为约10、20、30、40、50、60、70、80或90,更优选约100、150、200、250,甚至更优选约300、350、400或450,且最优选约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000。在其他实施方案中,每磁性颗粒的带电脂质分子数目可以设定为约1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、150000或更多。每磁性颗粒的带电脂质分子数目可以进一步取决于以下决定:磁性颗粒的大小或直径、连接在其中是可能或合适的区域、磁性颗粒大小或直径和颗粒长度之间的比例、带电脂质分子的分子同一性或本领域技术人员已知的任何其他合适参数。在其他实施方案中,磁性颗粒由带电脂质分子的表面覆盖率可以是颗粒的总体表面的约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%或者这些值之间的任何值。
    包含带电结构的“水凝胶”指聚合物链的三维网络,其是亲水的,有时作为其中水是分散介质的胶体凝胶发现。通常,水凝胶是高度吸收的,即它们可以含有超过99.9%水、天然或合成聚合物,并且能够保留大量水伴随网络结构的保存。由于其显著的含水量,水凝胶还可以具有非常类似于天然组织的灵活度。因为高含水量,水凝胶一般视为生物相容性材料,其使得它们特别有利于生物医学和药物应用。水凝胶的常见成分可以包含例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、具有丰富亲水基团的丙烯酸盐聚合物和丙烯酸 盐共聚物?;购翘烊凰翰牧侠绨ㄇ碇?、甲基纤维素、透明质酸及其他天然衍生的聚合物的材料。更优选水凝胶另外包含以下或由以下组成:带电元件例如带电聚合物或任何其他带电分子或部分,其可以用作磁性颗粒表面的带电涂层。均质水凝胶结构可以有利地促成磁性颗粒的总体净电荷,引起磁性颗粒的静电排斥。在具体实施方案中,接头分子及涂层或表面结构的其他组分可以嵌入含水水凝胶构架系统中,其可以进一步提供一定的分子稳定性。本领域技术人员应当了解如何选择合适的带电聚合物,以便获得具有总体净电荷的水凝胶。另外,用于产生合适水凝胶且将其连接在磁性颗粒表面上的手段和方法会是本领域已知的。上文所述的水凝胶还可以包含本文所述的聚合带电分子。
    在其他实施方案中,带电结构还可以是“聚合带电分子”。本文所用的术语“聚合带电分子”或“带电聚合物”指包含选自带负电或带正电重复单元的多个重复单元的聚合物或共聚物。此类聚合物或共聚物因此作为聚电解质发挥作用。应当理解电荷可以衍生自在重复单位内带负电或带正电的基团。特别优选的是选自以下的带正电的基团:季铵基团、伯胺基团、仲胺基团、叔胺基团、季磷基团、叔磷基团、酰胺基、杂芳香族氮基团和锍基团。
    所得到的带正电的聚合物也称为阳离子聚合物。聚合带电分子的正电荷可以有利地防止卷曲聚合物的形成。这允许其更多促成其拉伸状态中的粘度,因为伸长的聚合物占据更多空间。
    优选的带负电的聚合物包括但不限于硫酸酯基团、羧酸酯基团、磷酸酯基团、砜基团、硫化物基团、二硫化物基团、原酸酯基团、酐基团和β-酮砜基团或其任何组合。
    聚电解质已用于形成称为聚电解质多层(PEM)的新型材料。这些薄膜使用逐层(LbL)沉积技术进行构建。在LbL沉积过程中,合适的生长基底(通常为带电的)在带正电和带负电的聚电解质溶液的稀释液之间来回浸渍。在每次浸渍过程中,吸收少量聚电解质,并且表面电荷逆转,允许聚阳离子-聚阴离子层的静电交联薄膜的逐步和控制叠加。应当理解此类聚电解质多层适合于提供具有总体正或负净电荷的本发明的磁性颗粒。
    在更优选的实施方案中,本文所定义的带电结构将在合适的条件下测 量的至少约25mV的ζ电势赋予给本发明的磁性颗粒。本领域技术人员了解,颗粒的绝对净电荷可以通过测量ζ电势来确定。本文所用的术语“绝对净电荷”指颗粒的净或整体电荷,并不表明其正或负。本文所用的“ζ电势”或“ζ-电势”是用于表示胶体系统中的电动电势的量度。ζ电势可以表示为滑动面的位置处的界面双层相对于远离该界面的主体流体(bulk fluid)中的点的电势?;谎灾?,ζ电势是分散介质与连接至分散的颗粒的流体的静态层之间的电势差。ζ电势表示分散体中邻近的带类似电荷的颗粒之间的排斥程度。确定纳米颗粒如磁性纳米颗粒的ζ电势的合适方式和方法是本领域技术人员已知的,或者可以源自合适的文献来源。ζ电势不可直接测量,但是其可以利用理论模型和实验确定的电泳迁移率或动态电泳迁移率来计算。术语“在合适的条件下测量”表示ζ电势与分散介质相关地测量。应当理解,测量在分散介质的特定条件下进行。在本发明的具体实施方案中,ζ电势在特定的缓冲液浓度下确定。本领域技术人员理解用于磁性颗粒的分散和ζ电势的测量的合适缓冲液。在本发明特别优选的实施方案中,ζ电势利用浓度为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM或50mM或者其中的任何值的磷酸盐缓冲液来测量。ζ电势可以优选地在10mM的磷酸盐缓冲液浓度下确定。在其他具体实施方案中,ζ电势在具有特定pH的介质中确定。优选地,介质的pH值为6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。特别优选ζ电势在pH7.4下确定。在特别优选的实施方案中,ζ电势可以优选地在特定条件下确定,例如在特定的缓冲液浓度和特定的pH。最优选ζ电势在10mM磷酸盐缓冲液和pH7.4下确定。
    因此,带电结构可以赋予约+25mV或-25mV的ζ电势。在这个上下文中术语“带电结构”指一个带电结构,或者优选多个带电结构,例如本文所定义的颗粒上的所有带电结构。
    在具体实施方案中,包含本文所定义的带电结构的颗粒的ζ电势可以为约25mV、30mV、35mV、40mV、45mV、50mV、60mV、70mV、80mV、90mV、100mV或其中的任何值,或者大于100mV。
    在本发明的其他实施方案中,本文所定义的带电结构,特别是多个带电结构,例如颗粒上的所有带电结构,与不具有所述带电结构的颗粒的ζ 电势相比,可以赋予至少1mV的所述颗粒的ζ电势的增加。与不具有所述带电结构的颗粒的ζ电势相比,所述颗粒的ζ电势的增加可以为例如约1mV、2mV、3mV、4mV、5mV、6mV、7mV、8mV、9mV、10mV、15mV、20mV、25mV、30mV、35mV、40mV、50mV或这些值之间的任何值,或者大于50mV。
    在本发明的另一实施方案中,本文所定义的带电结构,特别是多个带电结构,例如颗粒上的所有带电结构,与不具有所述带电结构的颗粒的ζ电势相比,可以赋予颗粒的ζ电势的增加至少5%。与不具有所述带电结构的颗粒的ζ电势相比,所述颗粒的ζ电势的增加可以为例如约5%、7%、10%、12%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、55%、60%、70%、80%、100%或这些值之间的任何值,或者大于100%。
    本文所用的术语“第二结合分子”指直接或间接连接至本文所述的传感器表面的结合分子。第二结合分子可以是与第一结合分子相同类型的分子或可以是不同分子。在本发明的优选实施方案中,第一和第二结合分子是相同的分子。在本发明的具体实施方案中,第二结合分子是抗体或其片段,优选上文所定义的抗体。在本发明的特别优选的实施方案中,第二结合蛋白能够特异性识别且结合样品中的靶分子,然而,在与由第一结合分子识别的靶分子不同的结合位点或表位处。在其他优选实施方案中,第二结合分子可以是第二抗体,例如上文所定义的抗体,其识别第一结合分子,例如第一抗体,其可以是上文所定义的抗体。
    在本发明的优选实施方案中,第一结合分子经由接头分子连接至磁性颗粒。
    在另一优选实施方案中,第二结合分子可以经由本文所述的接头分子连接至传感器表面。
    本文描述的术语“接头分子”可以是适合于提供第一结合分子和/或第二结合分子与表面的连接的任何结构。本领域技术人员应当知道用于使接头分子与磁性颗粒表面偶联的方式和方法。为此目的,磁性颗粒的表面和/或接头分子可以包含能够使接头与表面偶联的锚定部分。
    为此目的,表面和/或接头分子可以包含能够使接头与表面偶联的锚定部分。本文所用的“锚定部分”应理解为接头分子或一种或多种排斥结构表 面分子与表面之间的连接物。特别有关的因此是如本文描述的任何桥接或连接物分子。例如,抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白衍生物、(链霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白关联蛋白、抗生物素蛋白样实体例如tamavidin1和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用于锚定如本文描述的接头分子和表面或表面结构。例如,锚定部分可以包含生物素,而表面涂布有链霉抗生物素蛋白或由链霉抗生物素蛋白功能化。用于使表面涂布有链霉抗生物素蛋白的手段和方法是技术人员已知的,或可以源自自合适的教科书或文献来源。
    适合作为用于锚定的连接物分子的相互作用对的进一步优选实例是生物素/抗生物素蛋白、任何抗体/抗原对例如抗FITC/FITC、抗德克萨斯红/德克萨斯红、抗地高辛/地高辛、如本文上文提及的核酸互补链。由于几乎无限的特异性组合而导致的高度倍增,锚定部分还可以包含核酸互补链。本领域技术人员还应当理解:由核酸序列组成的此类连接物分子可以容易地整合到接头结构中。
    另外本发明涵盖包含化学基团或由化学基团组成的锚定部分,所述化学基团可以通过偶联化学共价连接(例如交叉连接)至表面或与表面结合的分子。交叉连接是通过通常被称为生物缀合的共价键化学连接两种或更多种分子的过程。通常,交叉连接反应物(或交联剂)是含有两个或更多个反应末端的分子,其能够或化学连接至蛋白或其他分子上的特定官能团,例如蛋白官能团,例如伯胺(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基或羰基(-CHO),或交联剂反应基团例如碳化二亚胺(例如EDC)、NHS酯、亚氨酸酯、PFP酯、羟甲基膦、马来酰亚胺、卤代乙酰(溴代或碘代)、吡啶基二硫化物、乙烯砜、酰肼、二氮丙啶、芳基叠氮化物或异氰酸酯。
    另外本发明涵盖的接头分子具有一定长度,以便充当间隔分子,即提供结合分子和颗粒表面的一定距离。应当理解此类距离的提供可以提供几个其他优点:
    首先,一定距离可以导致颗粒与其他分子和彼此更少的非特异性结合。而且,通常发生的颗粒例如磁性颗粒的非特异性簇集可以降到最低。
    结合分子和磁性颗粒表面之间增强的末端间距离的第二个技术优势在于大磁性颗粒和表面如本文所述的传感器表面之间结合的概率可以通过将 靶标连接至具有一定长度的磁性颗粒接头分子而大大增加。
    在本发明的优选实施方案中,使用长且刚性的接头分子来克服结合难度以实现更有效的结合。有效的结合基于这样的观察,如果连接点的位置远离磁性颗粒,其中磁性颗??梢越岷媳砻娴目赡艹虻氖看蟠笤黾?。对于使结合分子的位置远离磁性颗粒表面使用长且刚性的接头分子,从而明显增强磁性颗粒结合表面的动力学。因此,所得的末端间距离为分子的伸直长度和刚性的函数,促进增强的结合动力学。
    本发明的接头分子因此可以具有连接物分子的功能和/或间隔物的功能。为此目的,这些聚合分子优选具有一定长度、强度和/或刚性,以便能够如同聚合纤维起作用。
    另外本发明涵盖例如通过二聚化或更高级别的多聚化以纤维装配的聚合物的使用?;购恰案ㄖ肿印钡氖褂?,其帮助建立更高级别的结构。一个考虑的实例是单链核酸分子,其可以装配成二聚螺旋结构,并且其又可以与辅助分子装配。其他考虑的辅助分子的实例是能够结合核酸例如ssDNA、dsDNA或两者(例如DNA结合蛋白)或者ssRNA、dsRNA或两者的蛋白(例如RNA结合蛋白)。此类因子或蛋白的结合可以优选由结合蛋白识别的特异性结合基序引导,所述结合基序可以存在于核酸分子例如dsDNA或ssDNA或ssRNA中。一旦此类结合因子在核酸分子上结合,则接头的刚性就可以得到增强且引起具有增加的平均延伸长度的接头。此类接头修饰可以在测定之前或过程中执行。在本发明的其他具体实施方案中,辅助分子例如RNA或DNA结合蛋白可以包含蛋白-蛋白相互作用结构域,例如SH3、PDZ、14-3-3、SH2结构域或本领域技术人员已知的任何其他合适结构域??梢韵嘤Φ靥峁┌嗳菔侗鸾峁褂蚧蛳嗷プ饔媒峁褂虻拇渭督岷弦蜃?,允许包含由辅助分子结合的核酸的复合物装配,所述辅助分子又可以由次级相互作用分子结合。在其他实施方案中,刚性接头结构可以以聚合多肽的形式提供,例如基于胶原或胶原样蛋白例如Scl1、Scl2、SclA或SclC的形式和/或分子同一性。这些分子可以进一步与本文所定义的其他接头分子或官能团组合。
    在本发明的其他具体实施方案中,聚合接头分子可以是能够在合适条件下自装配的聚合分子。相应地,结合分子可以与颗粒结合提供,引起聚 合物在颗粒表面上的装配。自装配可以通过合适参数加以控制,例如聚合所需的单体或聚合单位的浓度、单体或聚合单位的桥接因子的浓度、反应环境的pH、温度、离子的存在、辅助因子例如蛋白的存在等。在进一步的实施方案中,自装配的聚合物可以在此类合适条件的改变下崩解,例如通过改变pH、降低或增加因子或单体的浓度、改变温度等。
    还考虑接头分子包含本文所定义的带电结构或由本文所定义的带电结构组成,或者可以整合在本文描述的立体表面结构中。
    在本发明其他的具体实施方案中,接头分子可以是线性、环状或分支样分子或其混合物。
    在本发明的上下文中的合适接头分子可以是例如核酸、核糖核酸、肽、多肽、蛋白、碳水化合物、脂质、聚乙二醇、多糖、树枝状聚合物、树状分子(dendron)、纳米管或其任何合适衍生物或组合。
    上文所定义的核酸分子可以有利地还用作“核酸接头分子”。这些接头分子可以包含单链和/或双链DNA分子,或其任何类型的衍生物。DNA可以例如以例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式,或这些形式的任何混合物。接头分子还可以是PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子,或其任何混合物或组合,或与本文所定义的其他接头分子例如与任何类型的核酸例如DNA或RNA的任何混合物或组合。在具体的实施方案中,接头分子为核糖核酸分子,或者核糖核酸与任何其他描述的核酸分子的混合物,或者与任何本文所定义的任何其他间隔分子的混合物。核酸或核糖核酸分子可以具有本文所定义的不同的碱基组成和/或长度。接头分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,本文所定义的排斥表面结构分子的存在、大小或长度,考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是因为如果用作接头,核酸分子可以为磁性颗粒提供特定净电荷和/或立体排斥),任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,核酸接头分子可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电核酸接头分子”涉及约0的分子净电荷。
    在本发明特别优选的实施方案中,接头分子是或包含选自以下的分子:双链或dsDNA、双链或dsRNA、PNA、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。
    还由本发明的进一步优选实施方案涵盖的一个有利方面是PNA和PNA/DNA或PNA/DNA双链体无法由核酸酶或蛋白酶容易识别,使得它们对酶促降解具有抗性。
    在本发明的上下文中,上文所定义的肽分子可以有利地用作“肽接头分子”。如上文所述,此类肽分子接头可以具有不同氨基酸组成和/或长度。肽分子接头分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,本文所定义的带电结构分子的存在、大小或长度,考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是因为如果用作接头,肽分子可以为磁性颗粒提供特定净电荷和/或立体排斥),任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,肽接头分子可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电肽接头分子”涉及约0的分子净电荷。
    在本发明的上下文中,上文所定义的蛋白或多肽分子还可以有利地用作用“蛋白接头分子”或“多肽接头分子”。如上文所述,此类蛋白可以具有不同氨基酸组成和/或长度。蛋白或多肽分子接头分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,上文所定义的带电结构分子的存在、大小或长度,考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是因为如果用作接头,蛋白或多肽分子可以为颗粒提供特定净电荷和/或立体排斥),任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,多肽或蛋白接头分子可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电多肽或蛋白分子”涉及约0的分子净电荷。
    在本发明的上下文中,上文所定义的碳水化合物分子还可以有利地用作用“碳水化合物接头分子”。如上文所述,此类碳水化合物可以不同组成和/或长度。碳水化合物接头分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,本文所定义的带电结构分子的存在、大小或长度,考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是因为如果用作接头,碳水化合物 分子可以为磁性颗粒提供特定净电荷和/或立体排斥),任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,碳水化合物接头分子可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电碳水化合物分子”涉及约0的分子净电荷。
    在本发明的上下文中,上文所定义的脂质分子还可以有利地用作“脂质非亲和间隔分子”。如上文所定义,此类脂质分子可以具有不同组合和/或长度。脂质非亲和间隔分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,本文所定义的带电结构分子的存在、大小或长度,考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是因为如果用作接头,脂质分子可以为磁性颗粒提供特定净电荷和/或立体排斥),任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,脂质间隔分子可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电脂质分子”涉及约0的分子净电荷。
    在本发明的上下文中,上文所定义的聚乙二醇分子还可以有利地用作“聚乙二醇接头分子”。如上文所定义的,此类聚乙二醇可以具有不同的组成和/或长度。聚乙二醇接头分子的长度可以取决于以下决定:磁性颗粒大小或直径,本文所定义的带电结构分子的存在、大小或长度,或考虑的磁性颗粒总体特定净电荷和/或立体排斥(特别是如果使用携带电荷的聚乙二醇分子衍生物),或任何考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,或任何考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性。在本发明的特定实施方案中,聚乙二醇接头分子,特别是其衍生物或其修饰形式,可以是带电或不带电分子。本文所用的术语“不带电聚乙二醇分子”涉及约0的分子净电荷。
    “树枝状聚合物”或“树枝状聚合物接头分子”可以是任何重复分支、大致球形的大分子。此类树枝状聚合物可以具有不同组成和/或长度、和/或支化度。长度可以取决于以下决定:考虑的总体特定净电荷和/或立体排斥,考虑的结合分子和颗粒表面之间的末端间距离,考虑的接头分子的柔性、刚性或稳定性,和/或考虑的每磁性颗粒的带电分子数目。如本发明涵盖的树枝状聚合物可以包含低分子量或高分子量种类。根据本发明的树枝状聚合物优选是不带电的,即分子显示净电荷0。
    另外本发明涵盖根据本发明的树枝状聚合物作为接头的部分的用途。为此目的,在特定实施方案中,树枝状聚合物可以包含分子表面上的官能团,例如亲水基团,或者具有内部官能性。如为了本发明的目的的树枝状聚合物可以是第1、2、3、4或更高代的树枝状聚合物。优选的树枝状聚合物包括例如newkome树枝状聚合物或arbolol、和聚酰胺胺(PAMAM)。本领域技术人员应当理解树枝状聚合物引起可以有利地用于在颗粒表面或平坦表面上提供大体积和立体表面结构的结构,其中如上文描述的接头分子是此类结构的部分或嵌入其中。在本发明的上下文中使用的其他变体以及合成方法等将是技术人员已知的,或可以源自自合适的文件,例如"Dendrimers and other dendritic polymers",Frechet和Tomalia,J.Wiley。
    “树状分子”或“树状分子接头分子”应理解为含有单一可化学寻址的树枝状聚合物基团,即上文所定义的树枝状聚合物的焦点。本发明的树状分子优选是不带电的,即分子显示净电荷0。在本发明的特定实施方案中,树状分子可以用作本文所定义的接头的一部分。
    本文所用的术语“纳米管”指碳纳米管,即具有圆柱状纳米结构的碳同素异形体。此类纳米管可以是单壁纳米管或多壁纳米管。本发明还涵盖不同类型、形式和复杂性的富勒烯结构家族的接头分子,例如球形或椭圆形巴基球(buckyball)形式、巴基球富勒烯、或纳米管与巴基球的组合等。本发明的纳米管或本领域技术人员已知的其他接头合适的接头分子优选是不带电的,即分子显示净电荷0。
    在本发明的另一优选的实施方案中,接头分子可以长于排斥表面结构,例如本文所定义的带电核酸分子、肽分子、脂质分子等。本文所用的术语“更长的”表示接头分子的平均延伸长度大于表面结构的平均延伸长度。平均延伸长度中的差异可以是5%、10%、15%、20%、30%、50%、75%、100%、200%、300%、500%、1000%或更多。
    本文所用的术语“平均延伸长度”定义为接头的均方根末端间距离√<R2>,其可以根据蠕虫状链模型描述为:
    <R2>=2Pl[1–(P/l)(1-e-l/P)],
    其中P是聚合物的持久长度,并且1是接头的伸直长度。
    本文所用的术语“伸直长度”指作为在最大物理可能延伸处的长度的聚 合物链的伸直长度。
    几种生物学重要的聚合物可以有效地建模为蠕虫状链,包括双链DNA和RNA、非结构化RNA和非结构化多肽。Kratky-Porod蠕虫状链模型适合于建模半柔性聚合物,以便估计末端间距离和持久长度。然而,技术人员知道例如下文描述的众多其他理论模型,以估计末端间距离和持久长度。
    本文所用的术语“持久长度,P”指定量聚合物或串的刚度或刚性的基础机械性质,并且定义为超过其在切线方向中的相互关系不成立时的长度。在化学中,它还可以定义为在无限长链中的键i上所有键j≥i的投影平均总和(Flory,Paul J.(1969),Statistical Mechanics of Chain Molecules,New York:Interscience Publishers)。当角度θ在对位置0(零)的聚合物切线的向量和远离位置0距离L处的切向量之间时,角度余弦的期望值随着距离指数下降
    <cosθ>=e–(L/P)
    其中P是持久长度,并且尖括号指示在所有起始位置上的平均值。柔性聚合物例如PEG可以使用Flory模型(随机游动)进行描述。
    持久长度还可以使用弯曲刚度Bs、杨氏模量E和聚合物链的截面进行定义,如Mofrad,M.R.K,"Cytoskeletal mechanics:models and measurements",Cambridge Univ Press,2006中描述的。
    pl=BskBT]]>
    Bs=EI
    在刚性且均匀的杆的情况下,I可以表示为:
    I=πa44]]>
    其中a是半径。
    在高分子科学中,持久长度可以定义为库恩长度的一半,即链可以视为自由连接的假设区段的长度。持久长度等于在无限链长极限中的链末端处的链轮廓的切线上的末端间矢量的平均投影。
    本文所用的“刚性”或“刚性的”也称为“刚度”限定固体抵抗变形的性质。应当理解接头分子的刚性基本上促成平均延伸长度。本文所用的“柔性”因此指可以容易地变形的固体性质。在本发明的上下文中,柔性分子、聚合物或接头因此具有本文所定义的低刚性,其可以导致分子的弯曲和折叠。
    在本发明的具体实施方案中,接头分子的刚性经由如上定义的接头的均方根末端间距离√<R2>进行确定。在特定实施方案中,刚性可以相应地依据与其本文所定义的伸直长度相比较,接头的均方根末端间距离或平均延伸长度进行测量。因此,例如,与接头分子的平均延伸长度基本上相同的接头分子的伸直长度指示接头分子的高刚性。另一方面,显著大于所述接头的平均延伸长度的接头分子的伸直长度指示接头分子的低刚性。
    因此,本发明涵盖接头分子具有一定的长度以提供第一结合分子与磁性颗粒表面之间增加的平均延伸长度??梢钥悸?,伴随本发明的排斥结构,即增加的排斥,所提供的效果还可以通过例如存在于本文所定义的磁性颗粒上的大量相对短的排斥结构如立体涂层或带电分子实现。因此,在优选的实施方案中,本发明涵盖具有长接头分子和短排斥表面结构分子如立体涂层或带电分子的磁性颗粒,以组合本文所述的优势特征,实现增加的对传感器表面的结合。在本发明的其他优选实施方案中,长接头分子与短带电分子组合。在另一具体实施方案中,接头分子可以不同时具有排斥表面结构分子的功能。例如,接头分子可以是本文所定义的不带电的接头分子。
    在本发明的某些实施方案中,接头分子可以具有至少约60nm的平均延伸长度,优选长达约500nm,优选至少约65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm95nm或100nm,甚至更优选至少约110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm或200nm,甚至更优选至少约220nm、250nm、270nm或300nm,最优选至少320nm、350nm、370nm或400nm。在其他实施方案中,接头分子的平均延伸长度还可以大于400nm。接头分子还可以具有所示值之间的任何其他合适的平均延伸长度。
    在本发明的另一优选实施方案中,接头分子为如上文所定义的排斥表面结构,或者包含如上文所定义的排斥表面结构。为了获得增加的结合,磁性颗??梢哉显醋猿そ油贩肿雍驮醋耘懦獗砻娼峁沟拇嬖诘挠欣卣?,例如通过使用包含带电荷的结构的接头分子。因此这种方法具有这样的优势,仅必须制备满足长接头和排斥表面结构要求的一种类型的分子,导致更均质和易于制备的颗粒。本发明还涵盖不同类型或形式的接头分子和/或排斥表面结构的组合。
    在本发明的另一优选实施方案中,用能够特异性地结合所述靶分子的第一结合分子将排斥表面结构进一步功能化。在本发明的一具体实施方案中,用第一结合分子进一步功能化的排斥表面结构可以增加或进一步增加磁性颗粒上第一结合分子的量。所述第一结合分子优选为如上文所定义的抗体或其片段、如上文所定义的适体或者如上文所定义的核酸。
    优选接头分子和/或排斥表面结构不可被DNase和/或能够切割双链核酸分子的限制性酶切割。这样的不可被DNase切割性可以通过提供不代表DNase酶底物或识别基序的接头分子或排斥表面结构来实现。通常,可以通过使用如上文所定义的DNA类似物如PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子来实现该效果。
    不可被能够切割双链核酸分子的限制性酶切割性可以通过提供不代表能够切割双链核酸分子的限制性酶的底物或识别基序的接头分子或排斥表面结构来实现。通常,可以通过使用如上文所定义的DNA类似物如PNA、CAN、HNA、LNA或ANA,或者通过使用单链DNA分子,或者通过使用不含限制性酶的结合和/或活性所必需的特异性序列基序的DNA分子来实现该效果。进一步的细节是本领域技术人员已知的,或者可以来源于合适的文献来源。
    在本发明的其他具体实施方案中,如本文所定义的接头分子和/或如本文所定义的排斥表面结构不可被RNase切割。这样的不可被RNase切割性可以通过提供不代表RNase酶底物或识别基序的接头分子或排斥表面结构来实现。
    在本发明的另一优选实施方案中,核酸分子如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体具有约50-1000个核苷酸的长度。核酸分子如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体可以例如具有约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、250、270、300、320、350、370、400、420、450、470、500、520、550、570、600、620、650、670、700、720、750、770、800、820、850、870、900、920、950、970或1000个核苷酸的长度,或者所示值之间的任何长度。在其他具体实施方案中,核酸分子如dsDNA、PNA、PNA-DNA双链体或RNA-DNA双链体还可以比所示值短或长。
    在本发明的一特别优选的实施方案中,核酸分子如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体具有约100个核苷酸的长度。
    在本发明的一特别优选的实施方案中,核酸分子选自dsDNA、PNA分子、PNA-DNA双链体和RNA-DNA双链体。
    应当理解上文所示的目标还通过本发明的第二方面来解决,其描述用于检测样品中的靶分子的装置和传感器表面:所述装置包含至少两种类型的磁性颗粒的混合物,其中一种类型用第一结合分子功能化,所述第一结合分子能够特异性地结合所述靶分子,其中所述第一结合分子连接至颗粒,并且第二种类型用排斥表面结构功能化,所述排斥表面结构直接连接至所述颗粒的表面,其中所述排斥表面结构覆盖磁性颗粒的表面以导致磁性颗粒的特定净电荷和/或立体排斥;所述传感器表面包含第二结合分子,其中所述磁性颗粒能够直接或间接地结合传感器表面的所述第二结合分子;其中结合的颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接或反相关;并且其中所述排斥表面结构赋予给所述磁性颗粒朝向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。
    上文所示的本发明的第一方面的定义和实施方案也应用于本发明的第二方面。本发明的第二方面是基于相同的原理,即在所述磁性颗粒上产生向所述传感器表面的静电和/或立体推送作用。但是,这种效果是通过提供至少两种类型的磁性颗粒的混合物来实现的。
    如本文所用,术语“至少两种类型的磁性颗粒的混合物表示除了用第一结合分子功能化的磁性颗粒,在如上文所述的装置中可以采用第二或其他类型的磁性颗粒,其主要通过如上文所定义的排斥表面结构(排斥磁性颗粒)功能化。在具体实施方案中,这种第二或其他类型的排斥磁性颗粒不用第一结合分子功能化。因此这类磁性颗??梢越霭垂δ芑呐懦獗砻娼峁?,特别是在与功能化的磁性颗粒联用时。
    在一具体实施方案中,本发明涵盖使用仅一种第二类型的排斥磁性颗粒以及仅一种第一类型的用第一结合分子功能化的磁性颗粒?;箍悸鞘褂贸恢掷嘈偷呐懦獯判钥帕A鲆恢值谝焕嘈偷挠玫谝唤岷戏肿庸δ芑拇判钥帕?。例如,可以使用具有不同排斥表面结构或者包含不同分子如上文所定义的带不同电荷的分子或立体包衣的排斥磁性颗粒。此外,排 斥磁性颗??梢岳绱笮』蛑本?、磁性特征等不同。进一步考虑使用一种超过一种类型的排斥磁性颗粒连同仅一种或更多种类型的用第一结合分子功能化的磁性颗粒。这些一种或更多种类型的用第一结合分子功能化的磁性颗??梢岳绲谝唤岷戏肿?、大小或直径、磁性特征等不同。
    这样的方法可以具有以下主要优点,排斥磁性颗粒作为捕获颗粒明确地分离自它们的官能性?;痪浠八?,导致改良的结合特性的官能性现在分离并分布在两种或更多种类型的颗粒上。因此一个优点可以是就靶分子而言,排斥表面结构的分子是非特异性的,并且可以更通用。例如可以将排斥磁性颗粒添加至对所关注的靶分子特异性的非排斥磁性颗粒。因此本发明涵盖所得的磁性颗粒的混合物的排斥磁性颗??梢苑⒒幼饔靡孕纬删驳缤扑妥饔?,从而将用结合分子功能化的磁性颗粒推向传感器表面。
    在本发明的具体实施方案中,用能够特异性地结合所述靶分子的第一结合分子功能化的第一类型的磁性颗??梢远钔獾匕懦獗砻娼峁谷缟衔乃ㄒ宓拇绾傻姆肿踊蛄⑻灏?。
    在本发明的其他具体实施方案中,用能够特异性地结合所述靶分子的第一结合分子功能化的第一类型的磁性颗??梢远钔獾匕缟衔乃ㄒ宓拇绾傻姆肿?。
    至少两种类型的磁性颗粒的混合物中第一类型比第二类型磁性颗粒的比例,例如带电荷和不带电荷的磁性颗粒的比例可以在10:90和90:10之间。例如,第一类型:第二类型磁性颗粒的比例,例如带电荷和不带电荷的磁性颗粒的比例可以为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20或90:10的比例?;箍悸撬局抵涞娜魏纹渌壤?。
    在本发明的另一优选实施方案中,如本文所定义的接头分子还包含至少一个短的柔性间隔物。因此本发明涵盖如本文所定义的接头结构,优选如本文所定义的长且刚性的接头,在一端或两端携带短的柔性间隔物。应当理解由于这类柔性间隔物的存在,将一定的柔性加入刚性接头分子中。因此柔性间隔物结构可以用作柔性连接,其有助于接头分子的移动性,同时保留其总体刚性。接头分子可能的方向的数目可以由这样的柔性间隔物促进。柔性间隔物可以是任何合适的柔性分子,例如聚合物分子、肽、化学基团等。
    在一特别优选的实施方案中,短的柔性间隔物包含单链核酸,例如如本文所定义的单链DNA或RNA分子,或者如本文所定义的或如本领域技术人员已知的任何其他单链核酸形式。
    在另一方面,本发明涉及一种检测样品中的靶分子的存在或量的方法,其包括以下步骤:在本文所述的装置中,使样品与连接至磁性颗粒的第一结合分子接触以及使样品与能够连接至传感器表面的第二结合分子接触,其中第一结合分子和/或第二结合分子能够特异性地结合所述靶分子,以及任选地结合连接至传感器表面的靶类似物分子;其中靶分子能够干扰第一结合分子结合至靶类似物分子,任选地添加包含如本文所定义的排斥表面结构的磁性颗粒并检测结合至传感器表面的颗粒的数目,其中施用磁力来使颗??拷衅鞅砻?;并且其中结合的颗粒的数目与样品中存在的靶分子的量直接或反相关。本发明涵盖测定形式,其可以是用于检测靶分子的存在和/或量的典型竞争或非竞争测定。本领域技术人员会理解如上文所述的装置以及本发明的方法适合进行这样的分析。
    术语“能够连接至传感器表面”表示第二结合分子不必一直结合以预定方式与其连接的传感器表面,即不必在测定开始时已连接至表面。应当理解第二结合分子直接或通过如上文所定义的接头分子连接至表面可以在测定期间的任何时间点发生。本领域技术人员会理解选择的连接时间点打开进行测定的广泛可能性。因此本发明涵盖可以独立于其与表面的结合用作分离??榈牡诙岷戏肿?接头复合物。技术人员会进一步理解不一直固定或连接在传感器表面上的第二结合分子-接头复合物可以具有几个优点。一个考虑的优点是未连接的第二结合分子-接头复合物可以自由和快速扩散,因此增强通过结合靶分子而结合捕获复合物。术语“捕获复合物”描述这样的状态,其中直接或间接连接至第一磁性颗粒的第一结合分子或捕获分子具有捕获的靶分子。在这个实例中,第二结合分子/接头分子与第一结合分子捕获的靶分子的结合可以独立于时间发生,即在其连接至表面之前发生。
    在特别优选的实施方案中,所述第二结合分子连接至传感器表面可以在第二结合分子结合至靶分子之前或之后发生。在本发明的具体实施方案中,在测定的第一步中或在测定开始之前(这是添加如上文所定义的样品的 时间点),允许第二结合分子连接至表面,优选通过如本文所定义的接头分子。在这样的情况下,捕获复合物首先形成,并且在随后的步骤中结合至预制的表面结构,所述表面结构包含连接至表面的第二结合分子。
    在本发明的其他优选实施方案中,由于其首先特异性地结合至靶分子,第二结合分子-接头分子结合至捕获复合物,随后将整个捕获–第二结合分子–接头复合物导向传感器表面,以便将捕获复合物连接至表面??梢酝ü又炼沟某そ油凡嗬?,而第一结合分子直接连接至第一颗粒的表面?;痪浠八?,已连接接头的第二结合分子产生导致增强的结合动力学的效应。
    在涵盖的非竞争性测定形式中,第一和第二结合分子均能够特异性地结合靶分子??梢韵嘈旁诘谝徊街?,第一磁性颗粒上存在的第一结合分子可以识别并结合靶标。在第二步中,已结合靶分子的第一磁性颗??梢酝ü┥⒒虼判郧枷虼衅鞅砻娲嬖诘牡诙岷戏肿?。通过第二结合分子结合至靶标来介导结合至传感器表面?;箍悸且桓龌蚨喔鱿吹硬街?,其中从表面去除非特异性地结合的磁性颗粒。在本发明的具体实施方案中,这类洗涤步骤通过脉冲磁性驱动进行。随后确定随后结合至传感器表面的颗粒的数目。结合的颗粒的数目直接对应于样品中存在的靶分子的数目。
    还考虑基于竞争性测定的测定形式,其通常需要存在竞争物或靶类似物。如本文所用,术语“靶类似物分子”指任何分子,其与靶分子竞争结合至如本文所定义的第一结合分子。在这样的情况下,靶分子可以干扰第一结合分子结合至靶类似物分子。本发明涵盖竞争或抑制测定形式,其中第一结合蛋白可以结合连接在平表面的表面或如上文所定义的磁性颗粒上的靶类似物分子。如果如本文所述的靶分子存在于样品中并且如果这种靶分子首先结合抗体,则可以防止这种结合。例如,如果将药物分子的类似物例如固定至平传感器表面,利用所考虑的方法可以检测小药物分子。如果样品中不存在药物分子,则具有识别靶分子的结合分子的所有颗??梢越岷现帘砻嫔系陌欣嗨莆锓肿?。但是,在干扰这种结合的药物(靶)分子的存在下,抗药物结合分子不可以结合或较少结合至表面上的靶类似物。在这种情况下,表面上的颗粒的量与靶分子的量负相关。
    本发明涵盖磁性颗??梢酝üτ么懦±辞?,从而可以加速分析过 程。本发明还考虑使用磁场可以减少背景信号,这是由于去除非特异性结合的颗粒。适合本发明的检测方法的示例性光磁系统在图1中说明。
    特别优选基于磁性颗粒的光学检测的传感装置。相应细节可以源自图1中说明的示例性装置,其包含光源和光检测系统。用于检测的光学方法通常测量光信号中的改变,其表示由磁性颗粒反射的光的差异并且可以通过光学手段检测。例如,这类方法可以包括技术如散射光的检测或者基于全内反射(TIR)或受抑全内反射(FTIR)的检测。优选地,光信号的改变仅指由于第二结合分子结合至传感器表面而结合的那些磁性颗粒。细节是本领域技术人员已知的,或者可以来源于合适的参考文献,例如Bruls et al.,Lab Chip,2009,9.2504-3510。
    如本文所用,术语“全内反射”描述当光以大于特定角度的入射角从具有较高折射率的另一种材料进入一种材料时,在某些材料中存在的条件。这发生的特定角度取决于两种材料的折射率,也称为临界角度,并且可以数学计算(斯涅尔定律,折射定律)。在磁性颗粒不存在的情况下,不发生折射并且来自光源的光束被完全反射。如果磁性颗粒接近表面或与表面接触,则说光线被颗粒抑制且在该点处的反射不再完全。
    可以计算可以定义为全内反射信号的减少的信号。信号或多或少线性地取决于表面上的颗粒浓度(表面密度)。信号可以表示为:
    S=βn~]]>
    其中S是以%计的测量的信号改变,并且β是从表面密度至信号改变的换算因子。
    在本发明的优选实施方案中,结合颗粒的检测通过受抑全内反射(FTIR)或通过来自表面附近的所述结合颗粒的散射光测量来进行。
    在另一方面,本发明涉及如本文所定义的磁性颗粒在检测样品如上文所定义的样品中的靶分子中的用途。
    在本发明的一特别优选的实施方案中,在如上文所述的装置、方法或用途的上下文中提到的靶分子为心肌肌钙蛋白I(cTnI)、NT-proBNP或甲状旁腺激素。本发明还涉及其他靶分子或靶分子种类的检测。特别优选心肌肌钙蛋白I(cTnI)。
    实施例
    实施例1–带负电荷的DNA分子对ζ电位的影响
    分析带负电荷的DNA分子的效应。为此,将高度带负电荷的DNA分子结合至颗粒??帕I系牡绾刹饬课频缥?。当结合至颗粒的高度带负电荷的DNA分子的量增加时,电荷增加。此外,对于携带较长DNA分子(包含更多电荷)的颗粒,测量到较高电荷。
    在10mM磷酸盐缓冲液中于pH7.4下测量500-nm Ademtech颗粒的ζ电位值,所述500-nm Ademtech颗粒用链霉抗生物素蛋白分子功能化并连接至不同量的不同长度的生物素-功能化的dsDNA(见图4)。
    实施例2–增加数目的97bp dsDNA的影响
    为了确定增加数目的97bp dsDNA FTIR的效应,确定用不同量的链霉抗生物素蛋白功能化的连接至500nm Ademtech超顺磁性颗粒的生物素标记的97bp dsDNA进行的测定的信号振幅。如图6中可以看到,DNA分子/颗粒越多,表面接触越大。
    实施例3–FTIR测定结束时的信号改变
    在另一实验中,在FTIR测定结束时信号改变。首先,将在分子的一端携带生物素且在DNA的另一端携带德克萨斯红分子的单一97bp dsDNA片段结合至链霉抗生物素蛋白颗粒。随后,每颗粒添加相似但缺少德克萨斯红分子的97bp DNA分子至所示量。在FTIR测定中用抗德克萨斯红抗体的打印点测试所有颗粒(见图7)。
    实施例4–带负电荷的DNA对流体力学大小的影响
    分析带负电荷的DNA分子对颗粒的流体力学大小的影响。为此,将高度带负电荷的DNA分子结合至颗粒。测量颗粒的流体力学大小或流体力学半径。当结合至颗粒的DNA分子的量增加时,流体力学大小或流体力学半径增加。
    在10mM磷酸盐缓冲液中于pH7.4下测量500-nm Ademtech颗粒的流体力学大小和相应的ζ电位值,所述500-nm Ademtech颗粒用链霉抗生物 素蛋白分子功能化并结合至不同量的不同长度的生物素-功能化的dsDNA(见图9)?!  ∧谌堇醋宰ɡ鴚ww.www.4mum.com.cn转载请标明出处

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