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    重庆时时彩网络游戏信誉怎么样: 一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥及其制备方法.pdf

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    一种 防治 棉花 黄萎病 复合 微生物 菌肥 及其 制备 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610745953.X

    申请日:

    2016.08.29

    公开号:

    CN106305793A

    公开日:

    2017.01.11

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):A01N 63/04申请日:20160829|||公开
    IPC分类号: A01N63/04; A01N63/00; A01P3/00; C05G3/00; C12N1/20; C12N1/14; C12R1/465(2006.01)N; C12R1/13(2006.01)N; C12R1/07(2006.01)N; C12R1/885(2006.01)N 主分类号: A01N63/04
    申请人: 佛山市艳晖生物科技有限公司
    发明人: 蒋常德; 胡艳晖
    地址: 528000 广东省佛山市禅城区文沙东一街5号首层3号铺117室
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610745953.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.02.08|||2017.01.11

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥及其制备方法。该复合微生物菌肥的原料由阿布拉链霉菌,田无链霉菌,土壤短芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,桔绿木霉,黄腐酸钾;本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用,以及通过次级代谢产物诱导棉花产生抗病性,能产生多种抗菌素如藤黄霉素,阿布拉霉素等来抑制棉花黄萎病病原菌;本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到,都具有根迹促生作用,可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时,并定向植物根际分泌某些次生代谢产物,能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果。

    权利要求书

    1.一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该微生物菌肥的原料配比为:
    阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土壤短芽孢杆菌菌粉10-30份,克劳
    氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份,黄腐酸钾10-30份。
    2.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,其制备
    方法,包括以下步骤:
    步骤一、阿布拉链霉菌菌粉的制备
    取出阿布拉链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7
    天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养
    箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水
    洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为阿布拉链霉菌种子液;
    二级种子扩培:将上述制备的阿布拉链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的阿布拉
    链霉菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:
    0.8,28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到80g/L时,即可作为阿布拉链霉菌二级种子
    液;
    发酵:将上述制备的阿布拉链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的阿布拉链
    霉菌固体发酵培养基上,菌种与阿布拉链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的阿布拉
    链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度
    保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于30亿
    CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到阿布拉链霉菌菌粉;
    其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5
    克,硫酸镁:0﹒5克,氯化钠:0﹒5克,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml,PH7﹒2
    ~7﹒4;
    其中,所述的阿布拉链霉菌二级液体种子培养基:菜粕粉2%,木薯粉2%,氯化钠0.2%,碳
    酸钙1%,硫酸镁0.1%,PH7﹒2~7﹒4;
    其中,所述的阿布拉链霉菌固体发酵培养基:粗玉米皮80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,
    麸皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%;各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    步骤二、田无链霉菌菌粉的制备
    取出田无链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天,
    在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱
    中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗
    脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为田无链霉菌种子液;
    二级种子扩培:将上述制备的田无链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的田无链霉
    菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:0.8,
    28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到60g/L时,即可作为田无链霉菌二级种子液;
    发酵:将上述制备的田无链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的田无链霉菌
    固体发酵培养基上,菌种与田无链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的田无链霉菌固
    体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为
    60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于50亿CFU/g,即
    可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到田无链霉菌菌粉;
    其中,所述的高氏一号固体培养基与步骤一中的高氏一号固体培养基相同;
    其中,所述的田无链霉菌二级液体种子培养基:棉粕粉2%,玉米粉2%,氯化钠0.2%,碳酸
    钙1%,硫酸镁0.1%,磷酸氢二钾0.1%,PH7﹒2~7﹒4;
    其中,所述的田无链霉菌固体发酵培养基:甘蔗渣80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,粗玉
    米皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%;各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    步骤三、土壤短芽孢杆菌菌粉的制备
    取出土壤短芽孢杆菌保藏管,用无氮固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养72小
    时,在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基,在30℃培养箱中培养72小时,用
    3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L土壤短芽孢杆菌种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前8小时通气量为100L/min,8-24小时后通气量为200L/
    min ,24小时后通气量为300L/min ,30℃培养32-48小时,待总菌数含量不低于20亿cfu/
    ml,即可作为土壤短芽孢杆菌种子液;
    发酵:将上述制备的土壤短芽孢杆菌种子液以10%-20%的比例接种至土壤短芽孢杆菌
    固体培养基上,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-
    48小时,待芽孢含量不低于50亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即
    得到土壤短芽孢杆菌菌粉;
    其中,所述无氮固体培养基:蔗糖10g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,硫酸
    钙0.1g,碳酸钙5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.2;
    其中,所述土壤短芽孢杆菌种子培养基:糖蜜20g/L,玉米淀粉10 g/L, 棉粕粉40 g/L,
    硫酸镁0.4 g/L,硫酸锰0.6g/L,磷酸二氢钾0.6 g/L,碳酸钙10 g/L, pH7.0,各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    其中,所述的土壤短芽孢杆菌固体培养基:甘蔗渣57%,麸皮35%,棉粕5%,石粉1%,粗玉
    米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的
    条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    步骤四、克劳氏芽孢杆菌菌粉的制备
    取出克劳氏芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养
    48小时,在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48
    小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L液体种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min
    ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于20亿cfu/ml,即可作为克劳氏芽孢杆菌种子液;
    发酵:将上述制备的克劳氏芽孢杆菌种子液以总接种量的10%-20%的接种量加至克劳
    氏芽孢杆菌固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为
    30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于80亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉
    碎过100目筛,即得到克劳氏芽孢杆菌菌粉;
    其中,所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L,氯化钠5.0 g/L,
    琼脂20 g/L ,pH 7.2 ± 0.2;
    其中,所述液体种子培养基:糖蜜35 g/L, 豆粕粉20 g/L,硫酸镁0.6g/L,硫酸锰0.5
    g/L,磷酸二氢钾0.3 g/L,碳酸钙5.0 g/L,pH7.0;
    其中,所述的克劳氏芽孢杆菌固体发酵培养基:麸皮50%,粗玉米皮 42%,棉粕5%,石粉
    1%,啤酒糟2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基
    灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    步骤五、桔绿木霉菌粉的制备
    桔绿木霉种子液的制备:取出桔绿木霉菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复
    苏,30℃培养6天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶
    中,在培养箱中30℃培养4-6天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生
    理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为桔绿木霉种子液;
    发酵:将上述制备的桔绿木霉种子液以2%的接种量接种至灭菌的桔绿木霉固体发酵培
    养基上,菌种与桔绿木霉固体培养基混合均匀后,将接好种的桔绿木霉固体发酵培养基摊
    在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,湿度保持为60%-75%,发酵4-6天,检测其总
    孢子含量不低于30亿CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到桔
    绿木霉菌粉;
    其中,所述的PDA固体培养基:土豆200g,蔗糖20g,水1000mL,琼脂20g;
    其中,所述的桔绿木霉固体发酵培养基:甘蔗渣85%,芝麻渣粕2%,玉米芯5%,石粉4%,粗
    玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;
    步骤六、将上述步骤中的阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土壤短
    芽孢杆菌菌粉10-30份,克劳氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份与黄腐酸钾
    10-30份混匀,包装即为复合微生物菌肥。
    3.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合
    微生物菌肥在防治黄萎病的方法为拌种,拌种的用量为每千克种子用50-150克复合微生物
    菌肥均匀拌种。
    4.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合
    微生物菌肥在防治黄萎病的方法为浇根,浇根的使用方法为:将复合微生物菌粉稀释100-
    200倍,每棵棉花浇根复合微生物菌粉稀释液50-100毫升。
    5.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合
    微生物菌肥在防治黄萎病的方法为底施:在翻地之前均匀施入本复合微生物菌肥5-10kg。

    说明书

    一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥及其制备方法

    技术领域

    本发明属于农业生物防治与微生物肥料技术领域,具体涉及一种防治棉花黄萎病
    的复合微生物菌肥及其制备方法。

    背景技术

    棉花黄萎病是由大丽花轮枝菌(Verticillium dahaliae)引起的危害严重而且难
    以防治的土传病害。棉花黄萎病在我国经常性地暴发成灾,每年受其影响的棉花种植面积
    在4000万亩以上,常年造成棉花减产10 %-20%左右,病害发生严重地块造成减产可高达
    60%-70%。

    防治棉花黄萎病的方法主要有:一是化学防治,但是化学防治效果较差,而且容易
    造成环境污染,破坏农田的生态平衡;二是轮作,但在以往特定的农业环境条件下,人多地
    少且替代棉花的高价作物种类医乏,难以推广应用;三是生物防治,生物防治由于具有环境
    污染小、对人畜安全、专化性强、不易产生抗药性、作用持效期长、能有效?;ぬ斓?、生产成
    本低等优点日益受到人们的青睐。

    目前,用于防治作物黄萎病的有益菌主要有芽孢杆菌,木霉菌,放线菌等,取得了
    显著的防治效果。但是由于病原菌的多样性和同步进化,单一菌株的生防效果已经不稳定,
    效果不明显。

    芽孢杆菌可以产生多种抑菌活性物质,同时,由于芽孢杆菌存在于土壤中,是土传
    病害防治中研究很热的区域。在防治棉花黄萎病方面,用于防治试验的芽孢杆菌有的还

    可以在棉株体内存活和定殖。解淀粉芽孢杆菌HMB-1005菌株可以在棉花体内定殖,盆

    栽试验证明其对棉花黄萎病具有一定的抗性,与此同时,该菌株还可以在土壤中长时

    的保持(郭慧娟等2011 )。多粘芽孢杆菌7-4菌株被利用琼脂平板扩散法筛选出来,抑
    菌活性较高(王笑颖等2011 )。国内目前生物防治黄萎病的最高防效是枯草芽孢杆菌C-02
    菌株,盆栽防效达85.4%,其抗菌物质也被分离,证明是一种抗菌蛋白或肽类(聂太礼等2011
    )。从棉花体内分离得到的枯草芽抱杆菌BSD-2菌株可以显著抑制大丽轮枝菌孢子萌发,其
    活性产物己经得到分离,具有很好的热稳定性和耐酸碱性质,很具有应用前景(张铎等2008
    )。棉花内生的用于生物防治的芽孢杆菌还有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
    Jsas cd菌株,该菌株可以应用于棉苗的灌根处理,同时大田小区试验证明施用该菌株还有
    助于棉花产量的提高(林玲等 2010 )。

    木霉是一种腐生真菌,具有很强的适应能力,在土壤、植物根际和其他脱落物上很
    容易生长和繁殖。由于木霉分布广泛,所以容易分离得到,对木霉的研究也比较多。目前,全
    世界上己经有五十多种木霉制剂上市,用来防治多种植物病害并取得了可喜的效果。木霉
    防治黄萎病方面的研究同样成果颇丰。木霉可以有效防治大丽轮枝菌的为害,前苏联学者
    发现其防效可达40%以上。我国对木霉菌的研究也比较多,把木霉菌和大丽轮枝菌在培养皿
    内对峙培养,发现木霉可以显著抑制病原菌的生长,显微观察可以发现大丽轮枝菌的菌丝
    断裂、溶解和原生质浓缩。由于棉花黄萎病有两次发病高峰,在发病高峰时调查田间病害证
    明,木霉T34, THT和T24对棉花黄萎病的防效分别达到38.2%,53.5%和13.6%,36%。把哈茨木
    霉与烯酰吗琳制成水分散粒剂发现,盆栽试验中对黄萎病的防效最高可达88%,并且不会影
    响棉花植株的正常生长。生防真菌中,木霉菌研究很多,其作用机制也比较成熟,目前公认
    的有拮抗、重寄生、竞争、和诱导作物抗性等。

    放线菌主要生活在地表,可以产生多种抗生素,称为“抗生素工厂”。从拮抗的角

    度出发,选择放线菌对黄萎病进行防治试验对于找到高效的生防方法具有重要意义,
    事实上,很多学者在这方面做了尝试并取得了一系列成果。这些尝试围绕链霉菌进行,一般
    利用平板对峙方法筛选拮抗菌,然后测定其防效后再做深入研究。有盆栽试验证明,放线菌
    与有机肥结合可以高效防治黄萎病的发生,盆栽防效达到57%。链霉菌S23具有较强的抑制
    大丽轮枝菌的效果,除此之外,我国科研人员还从不同地区分离得到了S5等高活性菌株,盆
    栽试验中均表现出了一定的防效。

    由于病原菌的多样性和同步进化特性,单一拮抗菌株也无法达到很理想的防治效
    果,因此,生防菌的很多生物功能需要依靠两株或两株以上的细菌间的协同作用,才能发挥
    出更好的作用。

    发明内容

    本发明的第一目的在于提供一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥。该复合微生
    物菌肥的原料配比为:阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土壤短芽孢杆
    菌菌粉10-30份,克劳氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份,黄腐酸钾10-30份。
    在所述微生物菌肥中,阿布拉链霉菌,田无链霉菌,土壤短芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,桔绿
    木霉,五种菌是从450多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存,能产生多种抗菌素如藤黄
    霉素和阿布拉霉素;它们对抑制棉花黄萎病病原菌--大丽花轮枝菌有特别强大的效果;另
    一方面,本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用,
    或者通过次级代谢产物诱导棉花产生抗病性,增强其防病效果;再次,本发明中所使用的这
    5株菌株都是可从土壤中直接分离得到,具有固氮与根迹促生作用,可在作物表面、植株内
    部或土壤中繁殖生长的同时,并定向植物根际分泌某些次生代谢产物,能够提高植物对养
    分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果;

    本发明的第二目的在于提供一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥的制备方法,该方
    法步骤简单,确保微生物菌肥的药肥效果突出。

    为了达到上述目的,该防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥的制备方法,包括以下
    步骤:

    步骤一、阿布拉链霉菌菌粉的制备

    取出阿布拉链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7
    天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养
    箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水
    洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为阿布拉链霉菌种子液;

    二级种子扩培:将上述制备的阿布拉链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的阿布拉
    链霉菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:
    0.8,28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到80g/L时,即可作为阿布拉链霉菌二级种子
    液;

    发酵:将上述制备的阿布拉链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的阿布拉链
    霉菌固体发酵培养基上,菌种与阿布拉链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的阿布拉
    链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度
    保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于30亿
    CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到浑圆链霉菌菌粉;

    其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5,
    硫酸镁:0﹒5,氯化钠:0﹒5,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的阿布拉链霉菌二级液体种子培养基:菜粕粉2%,木薯粉2%,氯化钠0.2%,碳
    酸钙1%,硫酸镁0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的阿布拉链霉菌固体发酵培养基:粗玉米皮80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,
    麸皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤二,田无链霉菌菌粉的制备

    取出田无链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天。
    在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱
    中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗
    脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为田无链霉菌种子液;

    二级种子扩培:将上述制备的田无链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的田无链霉
    菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:0.8,
    28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到60g/L时,即可作为田无链霉菌二级种子液;

    发酵:将上述制备的田无链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的田无链霉菌
    固体发酵培养基上,菌种与田无链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的田无链霉菌固
    体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为
    60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于50亿CFU/g,即
    可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到田无链霉菌菌粉;

    其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5,
    硫酸镁:0﹒5,氯化钠:0﹒5,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的田无链霉菌二级液体种子培养基:棉粕粉2%,玉米粉2%,氯化钠0.2%,碳酸
    钙1%,硫酸镁0.1%,磷酸氢二钾0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的田无链霉菌固体发酵培养基:甘蔗渣80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,粗玉
    米皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤三,土壤短芽孢杆菌菌粉的制备

    取出土壤短芽孢杆菌保藏管,用无氮固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养72小
    时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基,在30℃培养箱中培养72小时,用
    3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L土壤短芽孢杆菌种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前8小时通气量为100L/min,8-24小时后通气量为200L/
    min ,24小时后通气量为300L/min ,30℃培养32-48小时,待总菌数含量不低于20亿cfu/
    ml,即可作为土壤短芽孢杆菌种子液;

    发酵:将上述制备的土壤短芽孢杆菌种子液以10%-20%的比例接种至土壤短芽孢杆菌
    固体培养基上,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-
    48小时,待芽孢含量不低于50亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即
    得到土壤短芽孢杆菌菌粉;

    其中,所述无氮固体培养基:蔗糖10g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,硫酸
    钙0.1g,碳酸钙5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.2;

    其中,所述土壤短芽孢杆菌种子培养基:糖蜜20g/L,玉米淀粉10 g/L, 棉粕粉40 g/L,
    硫酸镁0.4 g/L,硫酸锰0.6g/L,磷酸二氢钾0.6 g/L,碳酸钙10 g/L, pH7.0。各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

    其中,所述的土壤短芽孢杆菌固体培养基:甘蔗渣57%,麸皮35%,棉粕5%,石粉1%,粗玉
    米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的
    条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤四、克劳氏芽孢杆菌菌粉的制备

    取出克劳氏芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养
    48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48
    小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L液体种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min
    ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于20亿cfu/ml,即可作为克劳氏芽孢杆菌种子液;

    发酵:将上述制备的克劳氏芽孢杆菌种子液以总接种量的10%-20%的接种量加至克劳
    氏芽孢杆菌固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为
    30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于80亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉
    碎过100目筛,即得到克劳氏芽孢杆菌菌粉;

    其中,所述所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L,氯化钠5.0
    g/L,琼脂20 g/L ,pH 7.2 ± 0.2;

    其中,所述液体种子培养基:糖蜜35 g/L, 豆粕粉20 g/L,硫酸镁0.6g/L,硫酸锰0.5
    g/L,磷酸二氢钾0.3 g/L,碳酸钙5.0 g/L,pH7.0;

    其中,克劳氏芽孢杆菌固体发酵培养基:麸皮50%,粗玉米皮 42%,棉粕5%,石粉1%,啤酒
    糟2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条
    件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤五、桔绿木霉菌粉的制备

    A、桔绿木霉种子液的制备:取出桔绿木霉菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复
    苏,30℃培养6天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶
    中,在培养箱中30℃培养4-6天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生
    理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为桔绿木霉种子液;

    发酵:将上述制备的桔绿木霉种子液以2%的接种量接种至灭菌的桔绿木霉固体发酵培
    养基上,菌种与桔绿木霉固体培养基混合均匀后,将接好种的桔绿木霉固体发酵培养基摊
    在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,湿度保持为60%-75%,发酵4-6天,检测其总
    孢子含量不低于30亿CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到桔
    绿木霉菌粉;

    其中,所述的PDA固体培养基:土豆200g,蔗糖20g,水1000mL,琼脂20g;

    其中,所述的桔绿木霉固体发酵培养基:甘蔗渣85%,芝麻渣粕2%,玉米芯5%,石粉4%,粗
    玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤六、将上述步骤中的阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土
    壤短芽孢杆菌菌粉10-30份,克劳氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份与黄腐酸
    钾10-30混匀,包装即为复合微生物菌肥。

    其中,该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为拌种与浇根,拌种的用量为每千
    克种子用50-150克复合微生物菌肥均匀拌种;浇根的使用方法为:将复合微生物菌粉稀释
    100-200倍,每棵棉花浇根复合微生物菌粉稀释液50-100毫升,

    另外的该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为底施:在翻地之前均匀施入本复合微
    生物菌肥5-10kg,可更好的抑制病原菌的生长,可起到改良土壤的作用。

    本发明具有的优点和有益效果:、本发明中包含的阿布拉链霉菌,田无链霉菌,
    土壤短芽孢杆菌,克劳氏芽孢杆菌,桔绿木霉五种菌是从450多株微生物菌株中筛选得到的
    能共生共存,能产生多种抗菌素如藤黄霉素和阿布拉霉素;它们对抑制棉花黄萎病病原
    菌--大丽花轮枝菌有特别强大的效果,从而达到超强防治棉花黄萎病的效果,其对棉花黄
    萎病的药效高,平均防效在90.0%以上,且针对性强;、本发明的菌种能够全面的利用微生
    物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用,以及通过次级代谢产物诱导棉花产生抗病
    性,增强其防病效果;、本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到,如土
    壤短芽孢杆菌具有固氮与根迹促生作用,其他的菌都可在作物表面、植株内部或土壤中繁
    殖生长的同时,并定向植物根际分泌某些次生代谢产物,能够提高植物对养分的吸收、刺激
    植株生长起到肥料的效果,增产效果明显;(4)、 本发明复合微生物菌肥对人、畜安全,属于
    环境友好型,利用本发明方法防治棉花黄萎病不易产生抗药性,本发明制备方法简单、成本
    低、使用简单。

    具体实施方式

    实施例1

    一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该微生物菌肥的原料配比为:阿
    布拉链霉菌菌粉20份,田无链霉菌菌粉20份,土壤短芽孢杆菌菌粉20份,克劳氏芽孢杆菌菌
    粉20份,桔绿木霉菌粉20份,黄腐酸钾20份;其制备方法,包括以下步骤:

    步骤一,阿布拉链霉菌菌粉的制备

    取出阿布拉链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7
    天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养
    箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水
    洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为阿布拉链霉菌种子液;

    二级种子扩培:将上述制备的阿布拉链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的阿布拉
    链霉菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:
    0.8,28-30℃培养40小时,检测其菌体含量为82g/L时,即作为阿布拉链霉菌二级种子液;

    发酵:将上述制备的阿布拉链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的阿布拉链
    霉菌固体发酵培养基上,菌种与阿布拉链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的阿布拉
    链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度
    保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵4天,检测其孢子含量为38亿CFU/g,低
    温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到浑圆链霉菌菌粉;

    其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5,
    硫酸镁:0﹒5,氯化钠:0﹒5,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的阿布拉链霉菌二级液体种子培养基:菜粕粉2%,木薯粉2%,氯化钠0.2%,碳
    酸钙1%,硫酸镁0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的阿布拉链霉菌固体发酵培养基:粗玉米皮80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,
    麸皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤二,田无链霉菌菌粉的制备

    取出田无链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天。
    在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱
    中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗
    脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为田无链霉菌种子液;

    二级种子扩培:将上述制备的田无链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的田无链霉
    菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:0.8,
    28-30℃培养38小时,检测其菌体含量为65g/L时,即作为田无链霉菌二级种子液;

    发酵:将上述制备的田无链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的田无链霉菌
    固体发酵培养基上,菌种与田无链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的田无链霉菌固
    体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为
    60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量为54亿CFU/g,低温风
    干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到田无链霉菌菌粉;

    其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5,
    硫酸镁:0﹒5,氯化钠:0﹒5,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml ,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的田无链霉菌二级液体种子培养基:棉粕粉2%,玉米粉2%,氯化钠0.2%,碳酸
    钙1%,硫酸镁0.1%,磷酸氢二钾0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

    其中,所述的田无链霉菌固体发酵培养基:甘蔗渣80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,粗玉
    米皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%。各培
    养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤三,土壤短芽孢杆菌菌粉的制备

    取出土壤短芽孢杆菌保藏管,用无氮固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养72小
    时。在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基,在30℃培养箱中培养72小时,用
    3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L土壤短芽孢杆菌种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前8小时通气量为100L/min,8-24小时后通气量为200L/
    min ,24小时后通气量为300L/min ,30℃培养36小时,检测总菌数含量为22亿cfu/ml,即可
    作为土壤短芽孢杆菌种子液;

    发酵:将上述制备的土壤短芽孢杆菌种子液以15%的比例接种至土壤短芽孢杆菌固体
    培养基上,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵44小时,
    检测其芽孢含量为58亿cfu/g,晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到土壤短芽
    孢杆菌菌粉;

    其中,所述无氮固体培养基:蔗糖10g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,硫酸
    钙0.1g,碳酸钙5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.2;

    其中,所述土壤短芽孢杆菌种子培养基:糖蜜20g/L,玉米淀粉10 g/L, 棉粕粉40 g/L,
    硫酸镁0.4 g/L,硫酸锰0.6g/L,磷酸二氢钾0.6 g/L,碳酸钙10 g/L, pH7.0。各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

    土壤短芽孢杆菌固体培养基:甘蔗渣57%,麸皮35%,棉粕5%,石粉1%,粗玉米皮2%,尿素
    0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条件为:
    0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟

    步骤四,克劳氏芽孢杆菌菌粉的制备

    取出克劳氏芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养
    48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48
    小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L液体种子培养基的
    500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min
    ,30℃培养20小时,检测总菌含量为25亿cfu/ml,即可作为克劳氏芽孢杆菌种子液;

    发酵:将上述制备的克劳氏芽孢杆菌种子液以总接种量的10%-20%的接种量加至克劳
    氏芽孢杆菌固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为
    30-40℃,发酵42小时,检测芽孢含量为84亿cfu/g,晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目
    筛,即得到克劳氏芽孢杆菌菌粉;

    其中,所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L,氯化钠5.0 g/L,
    琼脂20 g/L ,pH 7.2 ± 0.2;

    其中,所述液体种子培养基:糖蜜35 g/L, 豆粕粉20 g/L,硫酸镁0.6g/L,硫酸锰0.5
    g/L,磷酸二氢钾0.3 g/L,碳酸钙5.0 g/L,pH7.0;

    其中,克劳氏芽孢杆菌固体发酵培养基:麸皮50%,粗玉米皮 42%,棉粕5%,石粉1%,啤酒
    糟2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%。各培养基灭菌的条
    件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤五,桔绿木霉菌粉的制备

    A、桔绿木霉种子液的制备:取出桔绿木霉菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复
    苏,30℃培养6天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶
    中,在培养箱中30℃培养4-6天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生
    理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为桔绿木霉种子液;

    发酵:将上述制备的桔绿木霉种子液以2%的接种量接种至灭菌的桔绿木霉固体发酵培
    养基上,菌种与桔绿木霉固体培养基混合均匀后,将接好种的桔绿木霉固体发酵培养基摊
    在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,湿度保持为60%-75%,发酵5天,检测其总孢
    子含量为34亿CFU/g,低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到桔绿木霉菌
    粉;

    其中,所述的PDA固体培养基:土豆200g,蔗糖20g,水1000mL,琼脂20g;

    其中,所述的桔绿木霉固体发酵培养基:甘蔗渣85%,芝麻渣粕2%,玉米芯5%,石粉4%,粗
    玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌
    的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟。

    步骤六、将上述步骤中的阿布拉链霉菌菌粉20份,田无链霉菌菌粉20份,土壤短芽
    孢杆菌菌粉20份,克劳氏芽孢杆菌菌粉20份,桔绿木霉菌粉20份与黄腐酸钾20混匀,包装即
    为复合微生物菌肥。

    实施例2复合微生物菌肥对棉花黄萎病的防治效果试验

    (一)试验处理:

    (1)试验组一:实施例1制备的复合微生物菌肥,拌种的用量为每千克种子用100克复合
    微生物菌肥均匀拌种;播种后正常培养。待棉苗生长至两叶一新片真叶时,切根接种棉花黄
    萎病原菌-大丽花轮枝菌菌株的孢子悬浮液(108个孢子/毫升);

    (2)试验组二:不拌种,直接播种后正常培养。待棉苗生长至两叶一新片真叶时,切根接
    种棉花黄萎病原菌-大丽花轮枝菌菌株的孢子悬浮液(108个孢子/毫升)后,将实施例1制备
    的复合微生物菌粉稀释150倍,每棵棉花浇根复合微生物菌粉稀释液60毫升;

    (3)试验组三:底施:在翻地之前均匀施入实施例1生产的本复合微生物菌肥6kg/亩,不
    拌种,直接播种后正常培养。待棉苗生长至两叶一新片真叶时,切根接种棉花黄萎病原菌-
    大丽花轮枝菌菌株的孢子悬浮液(108个孢子/毫升);

    药剂对照组: 多菌灵100倍稀释液拌种,待棉苗生长至两叶一新片真叶时,切根接种
    棉花黄萎病原菌-大丽花轮枝菌菌株的孢子悬浮液(108个孢子/毫升);

    空白对照:清水拌种,待棉苗生长至两叶一新片真叶时,切根接种棉花黄萎病原菌-
    大丽花轮枝菌菌株的孢子悬浮液(108个孢子/毫升);

    继续培养至空白对照充分发病时调查病情指数,计算防治效果。每组三个平行,每个平
    行100株棉花。

    试验结果:

    结果见表1:该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为拌种,浇根,或直接底施改土,这
    三种施入方法,相对于化学药剂都有明显的效果,并且相对空白对照组的防效达到了85%以
    上,效果非常显著;相对而言,进行底施效果更佳,防效可达到90%以上,而且可减少水量的
    施入,减少人工,因此推荐是底施;从增产上也明显可以看出,使用本发明的复合微生物菌
    肥的效果显著高于使用化学药剂的防治效果。

    表1复合微生物菌肥对棉花黄萎病防效试验结果

    处理
    病情指数
    防效(%)
    平均产量(kg)
    增产率(%)
    试验组一
    12.3
    85.59
    8.784
    42.04
    试验组二
    9.1
    89.34
    9.023
    45.91
    试验组三
    8.2
    90.39
    9.488
    53.43
    化学药剂
    45.6
    46.57
    7.262
    17.43
    空白对照
    85.34

    6.184

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    本文标题:一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥及其制备方法.pdf
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