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    重庆时时彩后二直选单式做号技巧: 基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611205222.2

    申请日:

    2016.12.23

    公开号:

    CN106636211A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/87申请日:20161223|||公开
    IPC分类号: C12N15/87; C08G83/00 主分类号: C12N15/87
    申请人: 北京化工大学
    发明人: 徐福建; 俞丙然; 朱艺文
    地址: 100029 北京市朝阳区北三环东路15号
    优先权:
    专利代理机构: 北京思海天达知识产权代理有限公司 11203 代理人: 张立改
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611205222.2

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,属于阳离子基因载体技术领域。该反应体系包括氨基糖苷类抗生素、有机溶剂、交联剂:其中交联剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.1??25:1范围;有机溶剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.1??200:1范围;反应体系所述各组分加入顺序为:先将氨基糖苷类抗生素溶于有机溶剂,然后加入交联剂,最后加入三乙胺调节反应环境;本方法简单易行,使得超支化聚合物广泛应用于基因载体,药物载体,蛋白载体,医学影像,荧光探针等生物医用材料领域。

    权利要求书

    1.基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,其特征在于,包括以下
    步骤:该反应体系包括氨基糖苷类抗生素、有机溶剂、交联剂:其中交联剂与氨基糖苷类抗
    生素的质量比值在0.1-25:1范围;有机溶剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.1-200:1
    范围;
    反应体系所述各组分加入顺序为:先将氨基糖苷类抗生素溶于有机溶剂,然后加入交
    联剂,最后加入三乙胺调节反应环境;
    聚合反应温度0-100℃;该聚合反应时间为100-2000min;
    反应完成后加入乙二胺或者乙醇胺,使未反应的环氧全部反应,加入的乙二胺或乙醇
    胺的质量是交联剂的质量的1-50倍;
    交联剂为羟乙基二硫双缩水甘油醚或聚乙二醇二缩水甘油醚;
    整个反应在无氧环境下连续进行。
    2.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,氨基糖苷类抗生素为庆大霉素硫酸盐、妥布霉素、硫酸新霉素的一种或者几
    种,其中庆大霉素硫酸盐和硫酸新霉素在使用前需要除去硫酸盐。
    3.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、醇类的一种或者几种。
    4.按照权利要求3所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,醇类化合物为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、异戊醇、正
    己醇中的一种或者几种;
    砜类选自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二苄基砜、甲基苯基砜、环丁砜中的
    一种或者几种;
    亚砜类选自二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、二己基亚
    砜中的一种或者几种。
    5.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,对于溶于水的一系列产物,将其溶于水中,加水量与产物的比例为100-300mL/
    g,产物溶解后放入不同截留分子量的透析袋中以除去小分子,获得相应分子量的抗菌抗污
    材料。
    6.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,反应体系应加入适量的三乙胺为反应提供一个碱性环境,氨基糖苷类抗生素
    与三乙胺的质量比为(0.5:8)-(5:15)。
    7.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,羟乙基二硫双缩水甘油醚的制备:将2-羟乙基二硫化物、氢氧化钠、四丁基溴
    化胺混合搅拌均匀,随后加热至40℃,滴加环氧氯丙烷,反应后向反应体系加水,用二氯甲
    烷萃取除去杂质盐得到粗产物,用硅胶柱层析得到浅黄色澄清的羟乙基二硫双缩水甘油
    醚。
    8.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,其中交联剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.1-15:1范围;有机溶剂与氨
    基糖苷类抗生素的质量比值在1-150:1范围;聚合反应温度5-80℃;该聚合反应时间为200-
    1900min。
    9.按照权利要求1所述的基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,
    其特征在于,其中交联剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.5-10:1范围;有机溶剂与氨
    基糖苷类抗生素的质量比值在2-100:1范围;聚合反应温度10-70℃;该聚合反应时间为
    300-1700min。

    说明书

    基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法

    技术领域

    本发明属于阳离子基因载体技术领域,具体涉及开环法构建一系列以氨基糖苷类
    抗生素为基体,其中包括庆大霉素硫酸盐、妥布霉素、硫酸新霉素抗生素等,具有高效基因
    转染效率的氨基糖苷类抗生素阳离子基因载体。

    背景技术

    二十年来,基因治疗作为一种极具潜能的治疗方法引起了科研学者广泛的关注,
    基因治疗既将遗传物质直接导入到患者的靶向细胞中,是一种很有前景的治疗方法。被广
    泛的用于治疗一系列遗传性疾病、人类癌症和心血管疾病等等。然而,直接注射DNA,RNA等
    遗传物质,遗传物质很容易被血液中的核酸酶降解,失去治疗的效果,所以构建安全高效的
    基因载体?;せ虿槐缓怂崦附到饩哂兄匾庖?。

    基因治疗中的重中之重是寻找到合适的基因载体?;蛟靥遄魑庠椿虻既?br />到细胞的工具,它的作用有两个:一是负载目的基因到宿主细胞,二是将目的基因在细胞内
    安全地释放出来,然后细胞内表达产生治疗蛋白。因而构建结构简单、容易大规模制备,无
    免疫排异反应,高基因转染效率的非病毒基因载体亟待科研人员进一步的研究。目前人们
    广泛使用的基因载体包括两类:病毒载体(viral vector)和非病毒载体(non-viral
    vector)。携带治疗基因的病毒可以感染正常/肿瘤细胞,从而将治疗基因导入细胞核,是一
    种高效率的基因传递系统。病毒基因载体的基因转染效率高,但是其细胞毒性大,会引起机
    体免疫反应,病毒基因载体的研究具有很大的争议。由于病毒载体存在以上诸多缺点,人们
    将更多的目光投向了非病毒载体。非病毒基因载体具有很多优点:1.具备灵活多样的功能;
    2,简单可控地合成过程;3,稳定且成熟的基因转染效率。具有很高的商业潜力。其发展潜力
    对非病毒载体的研究与开发起到了推动作用。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高
    的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因,从
    而形成带正电荷纳米级的复合体(complex),从而能够?;せ虼┕赴ひ苑乐贡缓怂?br />酶所降解,从而保证基因的顺利表达。

    随着高分子科学的不断进步,如何将其与现代医学、生物学以及工程学等学科更
    好的相互交融与渗透成为人们现在重点解决的难题。而在基因治疗方面,高分子材料已经
    体现出了很高的利用价值。目前,文献报道过一系列的非病毒阳离子基因载体近三十年来,
    随着科研人员对阳离子基因载体研究的不断深入,他们意识到仅仅构建高效、低毒的载体
    已经无法满足日益多元化的临床要求,将MRI/CT可视化、抗菌、荧光成像、光热治疗、光动力
    学等各种不同功能的材料组装在一起开发具有多功能的基因载体具有重要的临床意义。

    在基因治疗周期内,多次注射载体/基因复合物造成创伤引起的细菌感染,影响治
    疗效果,因此,构建具有抗菌性能的多功能基因载体对于临床试验有重大意义。除此之外,
    小分子抗菌型基因载体存在不少缺点,比如基因转染效率低,抗菌耐受性,抗菌持续时间短
    等。超支化聚合物凭借其抗菌性能好,细胞毒性低,合成制备简单,不会造成细菌耐药性等
    优点引起了人们的关注。

    氨基糖苷类抗生素是通过氧桥键连接多个氨基糖和环醇而形成的糖苷类抗生素。
    其抗菌机理是抑制细菌的蛋白质合成??股乜勺饔糜谙妇鞍字屎铣傻恼龉?,通过
    影响16SrRNA编码区(细菌胞内的30S核糖体亚单位)A区域对蛋白质合成的调控,蛋白质初
    始复合物的形成受到抑制,作用的途径有两种:一是细菌蛋白质的胞外释放受到抑制,将细
    菌杀死;二是受到诱导合成结构错误的蛋白质,蛋白质形成的细胞膜易破裂,最终导致细菌
    死亡。超支化聚合物具有高度枝化的拓扑结构,内部空腔,可功能化的端基和简单的合成步
    骤等优点,使得超支化聚合物广泛应用于基因载体,药物载体,蛋白载体,医学影像,荧光探
    针等生物医用材料领域。制备超支化聚合物,一般采用“一锅法”,合成简单,提纯步骤少,可
    减小工业化生产的成本。目前用于基因治疗的超支化聚合物大多基于天然产物,比如氨基
    糖苷类抗生素,蛋白质等具有良好的生物相容性和生物可降解性,可以满足工业生产的要
    求。

    发明内容

    本发明的目的是提供一种开环反应构建的以氨基糖苷类抗生素为基体的阳离子
    基因载体。本部分的研究内容是以氨基糖苷类抗生素为骨架构建具备抗菌性能的基因载
    体,研究载体的体外体内基因转染,抗菌效果,以及载体负载p53抑瘤基因后在裸鼠体内的
    表达,该类阳离子基因载体具有高的转染率,本身毒性较小,几乎不会引起免疫反应,同时
    对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌具有一定的抑菌性能,合成基本采用“一锅法”,合成简单很高
    的商业潜能,同时具备投入临床试验的可能。

    基于开环反应构建具有抗菌性能的超支化基因载体的方法,其特征在于,包括以
    下步骤:该聚合反应体系包括氨基糖苷类抗生素、有机溶剂、交联剂:其中交联剂与氨基糖
    苷类抗生素的质量比值在0.1-25:1范围,优选0.1-15:1范围,更优选在0.5-10:1范围;有机
    溶剂与氨基糖苷类抗生素的质量比值在0.1-200:1范围,优选1-150:1范围,更优选2-100:1
    范围。

    反应体系所述各组分加入顺序为:先将氨基糖苷类抗生素溶于有机溶剂,然后加
    入交联剂,最后加入三乙胺调节反应环境,使聚合更好发生。

    聚合反应温度0-100℃,优选5-80℃,更优选10-70℃;该聚合反应时间为100-
    2000min,优选200-1900min,更优选300-1700min。

    反应完成后加入乙二胺或者乙醇胺,使未反应的环氧全部反应,加入的乙二胺或
    乙醇胺的质量是交联剂的质量的1-50倍。

    整个反应在无氧环境下连续进行。

    所述的氨基糖苷类抗生素一般为庆大霉素硫酸盐、妥布霉素、硫酸新霉素的一种
    或者几种。在本发明的反应体系中,其中庆大霉素硫酸盐和硫酸新霉素在使用前需要除去
    硫酸盐,如采用氢氧化钙水溶液去除硫酸盐。

    所述的交联剂一般为羟乙基二硫双缩水甘油醚或聚乙二醇二缩水甘油醚。

    所述的有机溶剂选自砜类、亚砜类、酰胺类、醇类的一种或者几种。

    所述醇类化合物一般为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、异戊
    醇、正己醇中的一种或者几种。

    所说的砜类选自二甲砜、二乙砜、二丙砜、二丁砜、二苯砜、二苄基砜、甲基苯基砜、
    环丁砜中的一种或者几种。

    所述亚砜类选自二甲基亚砜、二乙基亚砜、二丙基亚砜、二丁基亚砜、二戊基亚砜、
    二己基亚砜中的一种或者几种。

    对于溶于水的一系列产物,一般处理是将其溶于水中,加水量与产物的比例为
    100-300mL/g,产物溶解后放入不同截留分子量的透析袋中以除去小分子,获得相应分子量
    的抗菌抗污材料。透析过程延续3天,最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即
    得到一系列基于氨基糖苷类抗生素的多功能基因载体。

    反应体系应加入适量的三乙胺为反应提供一个碱性环境,聚合物单体与三乙胺的
    质量比为(0.5:8)-(5:15)。

    羟乙基二硫双缩水甘油醚的制备:将2-羟乙基二硫化物、氢氧化钠、四丁基溴化胺
    混合搅拌均匀,随后加热至40℃,滴加环氧氯丙烷,反应后向反应体系加适量水,用二氯甲
    烷萃取除去杂质盐得到粗产物。用硅胶柱层析得到浅黄色澄清的羟乙基二硫双缩水甘油
    醚。

    有益结果:本发明利用开环法法制得分子量大小为5000-10000,分子量分布在
    1.1-13的聚合物。本发明利用开环反应法制得分子量大小为7000-15000,分子量分布在
    1.2-1.5的聚合物。对于开环过程中:(1)伯氨环氧开环,或通过ED、DED或其中任意两者的混
    合等开环除去未反应完全伯氨基团进行封端得到的一系列抗菌剂聚合物骨架材料均完全
    开环。(2)通过开环得到的其中部分多功能基因载体可降解。(3)通过开环反应得到的多功
    能基因载体具有一定的抗菌效果。这类基因载体在HepG2、Hela、C6、COS7、SL、H9C2细胞系中
    都有较好的转染效率,同时该多功能基因载体可采用“一锅法”,合成简单,具有很高的商业
    化潜力。

    附图说明

    图1实施例3,4中不同基因载体在HEK 293和Hep G2细胞中的毒性和转染效率测
    试。

    图2实施例3,4中不同的多功能基因载体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效
    果图和OD图。

    具体实施方式

    下面结合实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。

    实例1

    将2-羟乙基二硫化物(0.39mL,2.87mmol)、氢氧化钠(395.4mg,9.78mmol),四丁基
    溴化胺(7.1mg,0.02mmol)依次加入到50mL三口烧瓶中,搅拌均匀,随后加热至40℃。用滴液
    漏斗将环氧氯丙烷(0.83mL,10.59mmol)缓慢滴加到上述体系,3h内滴完。反应3h后向反应
    体系加适量水,用二氯甲烷萃取除去杂质盐得到粗产物。用硅胶柱层析(乙酸乙酯:正己烷
    =4:1)得到浅黄色澄清的羟乙基二硫双缩水甘油醚。

    实例2

    硫酸庆大霉素(547mg,1mmol),硫酸新霉素(908mg,1mmol)加入到100mL的氢氧化
    钙水溶液中,搅拌24h后过滤除去沉淀,沉淀用少量水洗涤。冷冻干燥得到除去硫酸盐的庆
    大霉素、新霉素。

    实例3

    将庆大霉素(449mg,1mmol)或妥布霉素(369mg,1mmol)或新霉素(810mg,1mmol)分
    别加入到5mL二甲基亚砜,40℃下搅拌至溶解。再将聚乙二醇二缩水甘油醚加入到上述溶
    液,其中环氧基的摩尔数等于氨基的摩尔数。氮气鼓泡排气10min后,加入10mmol的三乙胺,
    封口膜封口。反应体系在40℃下,氮气环境中反应24h。然后将过量的乙二胺加入到上述反
    应溶液中,60℃下反应1小时,除去未反应的环氧基团,同时提高聚合物水溶性。停止反应
    后,将反应溶液用醋酸中和后加水置于截留分子量为1000的透析膜中透析72h。冷冻干燥分
    别得到絮状的超支化聚合物HPG,HPT,HPN。

    聚合物HPG,HPT,HPN的数均分子量(Mn)分别为8300,8400,8600,分子量分布指数
    (Mw/Mn)分别为1.13,1.12,1.20。

    实例4

    合成方法如同实3,将交联剂乙二醇二缩水甘油醚换成合成的羟乙基二硫双缩水
    甘油醚,可分别得到带双硫键的超支化聚合物SS-HPG,SS-HPT,SS-HPN。

    聚合物SS-HPG,SS-HPT,SS-HPN的数均分子量(Mn)分别为8800,8900,9300,分子量
    分布指数(Mw/Mn)分别为1.18,1.17,1.25。

    关 键 词:
    基于 开环 反应 构建 具有 抗菌 性能 超支 基因 载体 方法
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