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    重庆时时彩计划软件哪个好: 汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201710054599.0

    申请日:

    2017.01.24

    公开号:

    CN106636139A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/40申请日:20170124|||公开
    IPC分类号: C12N15/40; C12N15/70; C07K14/175; C07K16/10; G01N33/577; G01N33/569 主分类号: C12N15/40
    申请人: 蔡亮
    发明人: 蔡亮
    地址: 410005 湖南省长沙市芙蓉中路一段450号
    优先权:
    专利代理机构: 上海波拓知识产权代理有限公司 31264 代理人: 杨波
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710054599.0

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体制备方法,包括设计扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框特异性引物,扩增汉坦病毒S基因;将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,转化Ecoli.TOP10感受态细胞,得到TA克隆阳性质粒,克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒pGEX-6P-2/S;将重组质粒pGEX-6P-2/S转化Ecoli.BL21菌体中,经IPTG诱导表达,得到包涵体;包涵体经溶解与复性得到重组蛋白;重组蛋白免疫Balb/c小鼠;小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,选择性培养;阳性克隆筛??;单克隆抗体制备、亚型鉴定及效价检测。同时提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体应用。

    权利要求书

    1.一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在于:所述方法包
    括:
    设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物,通过RT-PCR扩增汉坦病
    毒S基因;
    将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,转化Ecoli.TOP10感受态细胞,得到TA克
    隆阳性质粒;
    TA克隆阳性质??寺〉絧GEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒pGEX-6P-2/S;
    将重组质粒pGEX-6P-2/S转化Ecoli.BL21菌体中,经IPTG诱导表达,得到包涵体;
    包涵体经溶解与复性,得到GST-NP重组蛋白;
    GST-NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠;
    小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,选择性培养;
    阳性克隆筛??;以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。
    2.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述特异性引物包括上游引物pGEX-6P-2-F:5’-TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG-
    3’和下游引物pGEX-6P-2-R:5’-CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC-3’。
    3.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,再转化Ecoli.TOP10感受态细胞,得到
    TA克隆阳性质粒步骤包括:
    扩增的汉坦病毒S基因与pGM-T载体以1:3的比例于22℃下进行连接反应,取一定量连
    接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,挑选阳性克隆,抽提质粒,应用试剂盒进行PCR鉴定,
    应用EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ于37℃进行双酶切鉴定,以确定得到TA克隆阳性质粒。
    4.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述TA克隆阳性质??寺〉絧GEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒pGEX-6P-2/S
    步骤包括:
    TA克隆阳性质粒与pGEX-6P-2空质粒在37℃条件下进行EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切、电泳、
    目的片段回收纯化,二者在1:5比例下应用T4DNA连接酶于22℃连接反应20min,取一定量的
    连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板,37℃倒置培养
    过夜,挑选单克隆菌落,抽提质粒,取1μl进行PCR鉴定,应用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ对重组质粒
    pGEX-6P-2/S进行双酶切,PCR产物及酶切产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳,对重组质粒
    pGEX-6P-2/S进行序列测定。
    5.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述包涵体经溶解与复性,得到GST-NP重组蛋白步骤,还包括GST-NP重组蛋白纯化、
    Western blot鉴定、浓度测定步骤。
    6.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述GST-NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠步骤,包括:
    以重组蛋白GST-NP为免疫原,免疫小鼠,初次免疫采用1mg/ml浓度的重组蛋白GST-
    NP0.1ml与等体积完全佐剂注射器混匀,皮内多点注射;21天后采用0.5mg/ml浓度的重组蛋
    白GST-NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀,皮内多点注射,第二次免疫;之后每隔14
    天采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀,腹腔直接
    注射,第三次、第四次免疫;小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待用,即免疫小鼠血,并分
    离血清。
    7.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,其特征在
    于:所述小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,选择性培养的步骤,包括:小鼠脾细胞的制备、脾细
    胞与骨髓瘤细胞融合以及选择性培养杂交瘤细胞,重组蛋白GST-NP融合检测。
    8.一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用,其特征在于:所述应用为用异硫氰酸荧光素
    标记所制备的单克隆抗体,再对汉坦病毒感染的阳性动物脏器标本进行检测。
    9.如权利要求8所述的汉坦病毒S基因克隆与表达产物的应用,其特征在于:所述汉坦
    病毒感染阳性标本采用汉坦病毒感染的鼠肺组织。
    10.如权利要求8或9所述的汉坦病毒S基因克隆与表达产物的应用,其特征在于:所述
    应用为用PBS调整单克隆细胞株单抗浓度为10mg/ml,取1mg FITC溶于0.2ml DMSO,滴加于
    单抗液内,室温避光作用2h进行交联反应,交联混合物经葡聚糖凝胶Sephadex G25柱进行
    纯化,纯化后的单克隆抗体用含1%FBS的PBS进行1:100稀释,常规IFA法对汉坦病毒感染的
    鼠肺组织进行检测,与1:50稀释的汉坦病毒多克隆抗体检测效果进行比较。

    说明书

    汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用

    技术领域

    本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体
    的制备方法,及单克隆抗体的应用。

    背景技术

    汉坦病毒(Hantavirus,HV)属布尼亚病毒科,是一种分节段的单股负链RNA病毒,
    其会引起汉坦病毒肺综合征(HPS)和汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)等疾病,人和啮齿类
    动物(特别是鼠)均可被感染,其L、M、S基因分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、
    G2)、及核衣壳蛋白(NP)。NP又称核蛋白,是病毒的主要结构蛋白,免疫原性强,刺激机体产
    生的抗体滴度高、维持时间长,在抗病毒免疫中起重要作用,不同株、型的病毒NP氨基酸序
    列保守,均携带有T细胞和B细胞抗原决定簇,能诱导机体产生特异性体液免疫应答和细胞
    免疫应答,可直接与体外转录病毒的RNA及被感染细胞的细胞器结合,起着调节病毒复制的
    作用,常用作为HV感染后的诊断蛋白。目前,汉坦病毒感染后的血清学诊断通常采用病毒感
    染的组织细胞等天然抗原,由于其敏感性、特异性和可操作性不是十分理想,故考虑是否可
    通过基因克隆与表达来获取具有良好的免疫原性和免疫反应性的重组NP,以替代天然抗原
    用于HV感染的实验室诊断。同时,在汉坦病毒感染后鼠组织器官标本中抗原检测方面,目前
    尚没有高特异性和高敏感性的单克隆抗体实际应用于实验室检测,绝大部分均是采用的多
    克隆抗体,检测结果存在一定的假阳性或假阴性,影响检测结果的准确性。

    发明内容

    鉴于上述状况,有必要提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方
    法,以获得具有良好的免疫原性和免疫反应性的汉坦病毒核蛋白,同时制备一种高特异性
    和高敏感性的抗汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体而便于检测应用。

    本发明提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法,所述方法包
    括:设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物,通过RT-PCR扩增汉坦病
    毒S基因;将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,转化Ecoli.TOP10感受态细胞,得到
    TA克隆阳性质粒;TA克隆阳性质??寺〉絧GEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒pGEX-
    6P-2/S;将重组质粒pGEX-6P-2/S转化Ecoli.BL21菌体中,在经IPTG诱导表达,得到包涵
    体;包涵体经溶解与复性,得到GST-NP重组蛋白;GST-NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠;小鼠
    脾细胞与骨髓瘤细胞融合,选择性培养;阳性克隆筛??;以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以
    及效价检测。

    进一步地,所述特异性引物包括上游引物pGEX-6P-2-F:5’-
    TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG-3’和下游引物pGEX-6P-2-R:5’-
    CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC-3’。

    进一步地,所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,再转化Ecoli.TOP10
    感受态细胞,得到TA克隆阳性质粒步骤包括:扩增的汉坦病毒S基因与pGM-T载体以1:3的
    比例于22℃下进行连接反应,取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,挑选阳性克
    隆,抽提质粒,应用试剂盒进行PCR鉴定,应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双酶切鉴定,以确定得
    到TA克隆阳性质粒。

    进一步地,所述TA克隆阳性质??寺〉絧GEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒
    pGEX-6P-2/S步骤包括:TA克隆阳性质粒与pGEX-6P-2空质粒在37℃条件下进行EcoRⅠ、
    XhoⅠ双酶切、电泳、目的片段回收纯化,二者在1:5比例下应用T4 DNA连接酶于22℃连接反
    应20min,取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,涂布100μg/mL氨苄青霉素的
    LB平板,37℃倒置培养过夜,挑选单克隆菌落,抽提质粒,取1μl进行PCR鉴定,应用EcoRⅠ、
    XholⅠ对重组质粒pGEX-6P-2/S进行双酶切,PCR产物及酶切产物于1.0%琼脂糖凝胶电
    泳,对重组质粒pGEX-6P-2/S进行序列测定。

    进一步地,所述包涵体经溶解与复性,得到GST-NP重组蛋白步骤,还包括GST-NP
    重组蛋白纯化、Western blot鉴定、浓度测定步骤。

    进一步地,所述GST-NP重组蛋白,免疫Balb/c小鼠步骤,包括:以重组蛋白GST-
    NP为免疫原免疫小鼠,初次免疫采用1mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积完全佐
    剂注射器混匀,皮内多点注射;21天后采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体
    积不完全佐剂注射器混匀,皮内多点注射,第二次免疫;之后每隔14天采用0.5mg/ml浓度的
    重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀,腹腔直接注射,第三次、第四次免
    疫;小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待用,即免疫小鼠血,并分离血清。

    进一步地,所述小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,选择性培养的步骤,包括:包括:小
    鼠脾细胞的制备、脾细胞与骨髓瘤细胞融合以及选择性培养杂交瘤细胞,重组蛋白GST-NP
    融合检测。

    本发明还提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用,所述应用为异硫氰酸荧光
    素标记所制备的单克隆抗体,对汉坦病毒感染阳性标本检测。进一步地,所述汉坦病毒感染
    阳性标本采用汉坦病毒感染的鼠肺组织。

    进一步地,所述应用为用PBS调整单克隆细胞株的单抗浓度为10mg/ml,取1mg
    FITC溶于0.2mlDMSO,滴加于单克隆细胞株的单抗液内,室温避光作用2h进行交联反应,交
    联混合物经葡聚糖凝胶Sephadex G25柱进行纯化,纯化后的单克隆抗体用含1%FBS的PBS
    进行1:100稀释,常规IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织进行检测,与1:50稀释的汉坦病毒
    多克隆抗体检测效果进行比较。

    本发明还提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用,所述应用为用异硫氰酸荧
    光素标记所制备的单克隆抗体,对汉坦病毒感染的阳性动物脏器标本进行检测。

    进一步地,所述汉坦病毒感染阳性标本采用汉坦病毒感染的鼠肺组织。

    进一步地,所述应用为用PBS调整单克隆细胞株单抗浓度为10mg/ml,取1mg FITC
    溶于0.2mlDMSO,滴加于单抗液内,室温避光作用2h进行交联反应,交联混合物经葡聚糖凝
    胶Sephadex G25柱进行纯化,纯化后的单克隆抗体用含1%FBS的PBS进行1:100稀释,常规
    IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织进行检测,与1:50稀释的汉坦病毒多克隆抗体检测效果
    进行比较。

    本发明实施例的技术方案带来的有益效果是:上述汉坦病毒S基因克隆与表达方
    法,分离到了纯度较高的目的蛋白,最大程度地恢复了变性后重组蛋白的生物活性,重组蛋
    白GST-NP具有较好的免疫原性和免疫反应性,获得杂交瘤细胞株能稳定分泌高效价的单
    克隆抗体,经与FITC进行交联,建立的IFA试验能用于汉坦病毒感染后鼠组织器官标本中病
    毒抗原的检测。

    附图说明

    图1是本发明实施例的S基因原核重组质粒pGEX-6P-2/S构建结果的琼脂糖凝胶
    电泳图。

    其中:M.1kb DNA ladder;1.PCR阴性对照;2.RT-PCR;3.重组质粒pGEX-6P-2/S
    为模板的PCR产物;4.空质粒pGEX-6P-2;5.重组质粒pGEX-6P-2/S;6.重组质粒pGEX-
    6P-2/S经EcoR I、Xho I双酶切;7.重组质粒pUCm-T/S经EcoR I、Xho I双酶切。

    图2是本发明实施例的重组质粒pGEX-6P-2/S在大肠杆菌中的诱导表达结果的
    SDS-PAGE电泳图。

    其中:M:蛋白Marker;1-6:0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、
    1.0mmol/L、1.2mmol/LIPTG诱导pGEX-6P-2/S;7:空pGEX-6P-2/S;8:空菌
    Ecoli.BL21Star(DE3);9:pGEX-6P-2/S未经IPTG诱导。

    图3是汉坦病毒核蛋白纯化效果的SDS-PAGE电泳图。

    其中:M:蛋白Marker;1:pGEX-6P-2/S未经IPTG诱导;2:pGEX-6P-2/S经
    1.0mmol/LIPTG诱导;3:过GST蛋白纯化柱前;4:过GST蛋白纯化柱后;5:第一次洗脱液;6:第
    二次洗脱液。

    图4是本发明实施例的免疫小鼠血清Western Blot检测结果的SDS-PAGE电泳图。

    其中:1249-6至1249-10:分别是5只免疫小鼠血清Western Blot的检测结果。

    图5是本发明实施例的多克隆细胞株筛选阶段阳性Western Blot检测结果的
    SDS-PAGE电泳图。

    图6是本发明实施例的sub后单克隆细胞株上清液Western Blot检测结果的SDS-
    PAGE电泳图。

    图7是本发明实施例的单克隆细胞株腹水效价结果柱状图。

    其中:A:单克隆细胞株C3-E8;B:单克隆细胞株2-F11。

    图8是本发明实施例的单克隆抗体的Western blot分析的SDS-PAGE电泳图。

    其中:1:2-F11株经1:100稀释;2:2-F11株经1:500稀释;3:C3-E8株经1:100稀
    释;4:C3-E8株经1:500稀释。

    图9是本发明实施例的单克隆细胞株腹水纯化蛋白检测仪吸光率峰图。

    其中:A:单克隆细胞株2-F11;B:单克隆细胞株C3-E8。

    图10是本发明实施例的Western Blot方法检测纯化后抗体检测结果的SDS-PAGE
    电泳图。

    其中:1:C3-E8;2:2-F11。

    图11是本发明实施例的单克隆抗体对汉坦病毒感染鼠肺组织进行检测的对照结
    果图。

    其中:A:C3-E8;B:2-F11;C:1:50稀释的多克隆抗体;D:阴性对照。

    具体实施方式

    为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明实施例
    作进一步地详细描述。

    一种汉坦病毒S基因克隆、表达及单克隆抗体制备方法,包括如下步骤:

    S101:设计一对扩增汉坦病毒(Genbank No.JN712306)S基因完整开放阅读框
    (ORF)的特异性引物,通过RT-PCR扩增汉坦病毒S基因。

    其中,扩增汉坦病毒(Genbank No.JN712306)S基因的特异性引物为:上游引物
    pGEX-6P-2-F:5’-TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG-3’(5’端下划线部分为EcoRⅠ酶切位
    点);下游引物pGEX-6P-2-R:5’-CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC-3’(5’端下划线部分
    为XholⅠ酶切位点)。

    S102:将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM-T载体,再转化Ecoli.TOP10感受态细
    胞,得到TA克隆阳性质粒。

    扩增的汉坦病毒S基因(即PCR产物)与pGM-T载体以1:3的比例于22℃进行连接反
    应,取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,挑选阳性克隆,抽提质粒,应用试剂盒
    进行PCR鉴定,应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双酶切鉴定,以确定得到TA克隆阳性质粒。

    S103:TA克隆阳性质??寺〉絧GEX-6p-2原核表达载体,得到重组质粒pGEX-
    6P-2/S。

    TA克隆阳性质粒与pGEX-6P-2空质粒在37℃条件下,同时进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶
    切、电泳、目的片段回收纯化,二者在1:5比例下应用T4 DNA连接酶于22℃连接反应10min,
    取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板,37
    ℃倒置培养过夜,挑选单克隆菌落,抽提质粒,取1μl进行PCR鉴定,应用EcoRⅠ、XholⅠ对重组
    质粒进行双酶切,PCR产物及酶切产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳,对重组质粒pGEX-6P-2/S
    进行序列测定。

    S104:将重组质粒pGEX-6P-2/S转化Ecoli.BL21菌体中,在经IPTG诱导表达,得
    到包涵体。

    将pGEX-6P-2/S重组质粒转化工程菌Ecoli.BL21Star(DE3)感受态细胞,37℃培
    养24h,挑单克隆菌落于含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6左右,加入
    不同浓度IPTG(0.2mmol/L ̄1.2mmol/L),37℃水浴诱导培养3h-8h,离心收集菌体。

    S105:包涵体经溶解与复性,得到GST-NP重组蛋白。

    收集的菌体经冰浴超声裂解,应用洗液Ⅰ(60mmol/L EDTA,4%Triton X-100,
    1.5mol/LNaCl,pH7.0),洗液Ⅱ(0.1mol/L Tris-Cl,20mmol/L EDTA,2mol/L Urea,pH7.0)
    洗涤,收集上清和包涵体,12%SDS-PAGE电泳,包涵体应用溶解液(8mol/L Urea,20mmol/L
    Tris-Cl,1mmol/L EDTA,6mmol/L DTT,pH8.0)溶解过夜后装入含GST融合蛋白复性液
    (20mmol/LTris-Cl pH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,0.9mmol/L GSH,0.1mmol/L GSSG)的透
    析袋中复性48h。

    S106:GST-NP重组蛋白纯化、Western blot鉴定、浓度测定。

    将10mL Glutathione Sepharose 4B加入GST蛋白纯化柱,PBS洗涤至柱平衡,以一
    定流速加入10mL的复性蛋白,使蛋白充分吸附,PBS洗涤层析柱至重新平衡,超纯水洗脱目
    的蛋白。洗脱的GST-NP融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳分离,电转移至PVDF膜,以抗GST
    McAb为一抗、HRP标记的羊抗鼠抗体为二抗,ECL显影,Western blot鉴定。在核酸蛋白分析
    仪上,采用A280紫外分光光度法,应用BSA蛋白浓度标准品绘制标准曲线,测定纯化后GST-
    NP浓度。

    S107:Balb/c小鼠免疫。

    以重组蛋白GST-NP为免疫原免疫小鼠,初次免疫采用1mg/ml浓度的重组蛋白
    GST-NP0.1ml与等体积完全佐剂注射器混匀,皮内多点注射;21天后采用0.5mg/ml浓度的
    重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀,皮内多点注射,第二次免疫;之后
    每隔14天采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀,腹
    腔直接注射,第三次、第四次免疫;小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待用,即免疫小鼠
    血,并分离血清。

    S108:细胞融合。

    将末次免疫后7天的小鼠处死,无菌条件下取脾脏,制备脾细胞悬液,按8:1的比例
    与SP2/0进行融合,融合后的第107用HAT选择培养基培养,15天后改换HT培养,20天后用含
    10%FCS(Fetal Calf Serum,胎牛血清)的DMEM培养。

    S109:杂交瘤细胞株筛选和亚克隆。

    以纯化后1μg/ml的重组核蛋白包板,50ul/孔,4℃过夜,间接ELISA法检测杂交瘤
    细胞培养上清,有限稀释法进行亚克隆。

    S110:单克隆细胞株腹水抗体制备、纯化、亚型鉴定、以及效价检测。

    小鼠腹腔注射诱导剂Pristane(0.5ml/只),7天后腹腔注射8×105个杂交瘤细胞/
    只,7天后收集腹水,1500rpm/m离心,去油状物及沉淀,通过Protein G亲和层析柱对小鼠单
    克隆细胞株进行纯化,-20℃保存。

    以1μg/ml纯化后的重组核蛋白包板,50μl/孔,4℃过夜,以1%BSA稀释1:4000后的
    HRP标记的分型抗体为二抗,ELISA法对1:1000稀释的小鼠单克隆细胞株腹水进行亚型检
    测。

    以1μg/ml纯化后的重组核蛋白包板,50μl/孔,4℃过夜,对1:200、1:1000、1:5000、
    1:10000、1:20000、1:60000、1:240000稀释的小鼠单克隆细胞株腹水应用ELISA法进行效价
    检测。

    S111:单克隆抗体的Western blot分析。

    重组核蛋白经SDS-PAGE电泳,120mA恒流转膜2.5h,以纯化后1:100、1:500稀释的
    C3-E8、2-F11为一抗,以1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,通过封闭反应、抗体
    孵育、底物反应、曝光显影,获得Western blot结果。

    本发明还提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用,所述应用为异硫氰酸荧光
    素标记单克隆抗体,再对汉坦病毒感染阳性标本检测。

    用PBS(PH9.0)调整C3-E8、2-F11单抗浓度为10mg/ml,取1mg FITC溶于
    0.2mlDMSO,滴加于抗体液内,室温避光作用2h进行交联反应,交联混合物经葡聚糖凝胶
    Sephadex G25柱进行纯化。对纯化后的C3-E8、2-F11单克隆抗体应用含1%FBS的PBS进行
    1:100稀释,建立常规IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织(经IFA、PCR和测序鉴定)进行检测,
    与1:50稀释的汉坦病毒多克隆抗体(第四军医大)检测效果进行比较。

    实施例:

    1汉坦病毒S基因克隆、表达及单克隆抗体制备方法

    1.1质粒、菌株与试剂

    质粒pGEX-6P-2(GE Healthcare,USA),Glutathione Sepharose 4B蛋白纯化柱
    (GE Healthcare,USA),抗GST McAb(Cell Signaling Technology Inc,USA),
    Ecoli.BL21Star

    (DE3)、JM109(TIANGEN,北京),Trizol、One-step RT-PCR System with
    Taq High Fidelity、PCR Super Mix、Kit
    (Invitrogen,USA)、T4 DNA连接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、1000bp DNA Marker、低分子
    量蛋白Marker(Fermentas,Canada),胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒(Axygen,USA),福
    氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT(Sigma,USA),PEG1500、Isostrip、Pristane(Roche,
    USA);DMEM、胎牛血清(Gibco,USA);Protein G亲和层析柱(四季青,中国);ECL蛋白印迹法
    检测试剂盒(Pierce);其余试剂均为国产分析纯。

    1.2引物设计与合成

    根据前期研究上传至Genbank的汉坦病毒Hunan03株(Genbank No.JN712306)S基
    因编码区序列及质粒pGEX-6P-2多克隆位点,应用Primer Premier 6.0设计一对扩增S基
    因编码区全长的特异性引物,为了便于克隆与表达,在引物两端引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点
    及?;ば约罨?。上游引物pGEX-6P-2-F:5’-TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG-3’(5’端下
    划线部分为EcoRⅠ酶切位点);下游引物pGEX-6P-2-R:5’-CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCT
    C-3’(5’端下划线部分为XholⅠ酶切位点),委托Invitrogen公司合成。

    1.3RNA提取、cDNA合成及PCR产物纯化回收

    Trizol法提取HV鼠肺组织Hunan03株阳性标本总RNA,在引物pGEX-6P-2-F、
    pGEX-6P-2-R作用下,应用One-step RT-PCR System withTaq High
    Fidelity试剂盒对S基因ORF区域进行一步法逆转录及扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶
    电泳,应用Axygen胶回收试剂盒对产物进行纯化回收。

    1.4TA克隆与鉴定

    PCR产物纯化回收后,参照TA Cloning Kit说明书按照PCR产物与pGM-T载
    体1:5的比例于22℃进行连接反应,取10ul连接产物转化Ecoli.TOP10,挑选阳性克隆抽提
    质粒,应用PCR Super Mix试剂盒进行PCR鉴定,应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双
    酶切鉴定。

    1.5重组质粒pGEX-6P-2/S的构建与鉴定

    扩增的汉坦病毒S基因(即PCR产物)与pGM-T载体以1:3的比例于22℃进行连接反
    应,取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞,鉴定后的TA克隆阳性质粒与pGEX-
    6P-2空质粒在37℃条件下同时进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切、电泳、目的片段回收纯化。

    在1:5比例下应用T4 DNA连接酶于22℃连接反应10min,取连接产物10μl转化感受
    态细胞TOP10,涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板,37℃倒置培养过夜。挑选单克隆菌落,抽
    提质粒,取1μl进行PCR鉴定。应用EcoRⅠ、XholⅠ对重组质粒进行双酶切,PCR产物及酶切产物
    于1.0%琼脂糖凝胶电泳,对pGEX-6P-2/S重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定。

    1.6S基因的表达

    将pGEX-6P-2/S重组质粒转化工程菌Ecoli.BL21Star(DE3)感受态细胞,37℃培
    养24h,挑单克隆菌落于含100ug/mL氨苄青霉素的LB培养液中(2mL)培养至OD值为0.6左右,
    加入不同浓度IPTG(0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/
    L),37℃水浴诱导培养3h-8h,离心收集菌体。

    1.7包涵体的溶解与复性

    收集的菌体经冰浴超声裂解,应用洗液Ⅰ(60mmol/L EDTA,4%Triton X-100,
    1.5mol/LNaCl,pH7.0),洗液Ⅱ(0.1mol/L Tris-Cl,20mmol/L EDTA,2mol/L Urea,pH7.0)
    洗涤,收集上清和包涵体,12%SDS-PAGE电泳。包涵体应用溶解液(8mol/L Urea,20mmol/L
    Tris-Cl,1mmol/L EDTA,6mmol/L DTT,pH8.0)溶解过夜后装入含GST融合蛋白复性液
    (20mmol/L Tris-ClpH8.0,1mmol/L EDTA pH8.0,0.9mmol/L GSH,0.1mmol/L GSSG)的透
    析袋中复性48h。

    1.8GST-NP重组蛋白纯化、Western Blot(蛋白质免疫印迹)

    将10mL Glutathione Sepharose 4B加入GST蛋白纯化柱,PBS洗涤至柱平衡,以
    0.1mL/min流速加入10mL的复性蛋白,使蛋白充分吸附,PBS洗涤层析柱至重新平衡,超纯水
    洗脱目的蛋白,具体操作参考GST蛋白纯化柱说明进行。洗脱的GST-NP融合蛋白经12%
    SDS-PAGE电泳分离,电转移至PVDF膜,以抗GST McAb为一抗、HRP标记的羊抗鼠抗体为二
    抗,ECL显影,Western Blot鉴定。

    1.9GST-NP重组蛋白浓度测定

    在核酸蛋白分析仪上,采用A280紫外分光光度法,应用BSA蛋白浓度标准品绘制标
    准曲线,测定纯化后GST-NP浓度。

    1.10S基因的PCR扩增及TA克隆鉴定

    Trizol提取后的RNA经pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物进行一步法RT-PCR
    扩增S基因,1.0%琼脂糖凝胶电泳显示扩增条带约1306bp,与预期大小一致,提示扩增的
    DNA为目的片段。以抽提后的TA克隆质粒为模板,用pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物
    对S基因进行PCR扩增,产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,可见一约1306bp的目的条带(见图1),
    与预期值一致。

    1.11pGEX-6P-2/S的构建与鉴定

    以抽提后的质粒pGEX-6P-2/S为模板,以pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R为引
    物进行PCR扩增,可见一约1306bp的目的条带(见图2),与预期值一致。用限制性内切酶EcoR
    Ⅰ、XholⅠ对重组质粒pGEX-6P-2/S进行双酶切,得到与目的基因(1306bp)及载体(4985bp)
    相同大小的2个片段(见图1)。挑取含插入片段pGEX-6P-2/S的阳性克隆,用小量质粒提取
    试剂盒提取质粒测序,结果表明S基因片段已经成功的插入pGEX-6P-2载体,且插入方向
    正确。

    1.12测序结果分析

    核蛋白基因编码区以起始密码ATG开始,以终止密码子TAA结尾,ORF长1290个核苷
    酸残基,包括碱基A423个(32.79%),碱基C244个(18.91%),碱基G325个(25.19%),碱基
    T298个(23.10%),GC含量为44.11%,AT含量为55.89%,单链分子量约为391.41kDa,编码
    429个氨基酸(20种),平均分子量为48.13kDa,含量最高的氨基酸为Leu(亮氨酸),占总蛋白
    含量的9.79%(42/429),含量最低的为Cys(半胱氨酸)和Trp(色氨酸),仅各占1.17%(5/
    429)。

    1.13pGEX-6P-2/S的表达与鉴定

    含重组质粒pGEX-6P-2/S的E.coli Star BL21(DE3)菌株应用不同浓度IPTG进
    行诱导,SDS-PAGE凝胶电泳图上均显示特异性条带,蛋白分子量与理论值一致,约为
    74kDa。菌株在IPTG终浓度1.0mmol/L、37℃条件下诱导3h条件下,表达量最大(见图2)。菌体
    经超声波破菌,包涵体经8mol/L尿素溶解后过GST亲和层析柱,SDS-PAGE凝胶电泳显示单
    一的目的蛋白条带,分子量与预期大小一致,约74kDa,融合蛋白主要存在于不溶性的包涵
    体中。

    1.14NP蛋白的纯化与Western blot鉴定

    A280紫外分光光度法测得蛋白浓度为1.80mg/mL。蛋白复性后经GST蛋白纯化柱纯
    化,SDS-PAGE凝胶电泳显示蛋白分子量约74kDa(见图3);以抗GST McAb为一抗、HRP标记的
    羊抗鼠IgG为二抗的Western blott在相应位置出现特异性条带。

    1.15实验动物免疫

    1.15.1免疫操作

    以鉴定的重组蛋白GST-NP为免疫原免疫小鼠(5只),设置BSA对照组。初次免疫采
    用1mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积(0.1ml)完全佐剂注射器混匀,皮内(如四
    肢、腹腔皮下、及腹腔)多点注射;21天后采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等
    体积(0.1ml)不完全佐剂注射器混匀,皮内(如四肢、腹腔皮下、及腹腔)多点注射,第二次免
    疫;之后每隔14天采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST-NP0.1ml与等体积(0.1ml)不完全佐
    剂注射器混匀,腹腔直接注射,第三次、第四次免疫。小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待
    用,即免疫小鼠血,将血液37℃处理30min后,4℃冰浴1h,10000rpm离心10min,分离收集上
    层血清备用。

    1.15.2实验动物血清效价检测

    1.15.2.1通过ELSIA方法对免疫小鼠血清效价进行检测和鉴定

    实验方法:间接法ELISA

    试剂配方:

    Coating buffer(1L、pH=9.6):NaHCO3 2.93g,Na2CO3 1.59g,加去离子水至1L,4
    ℃贮存。

    1%BSA:称1g BSA溶于100ml TBS。

    2M H2SO4:100ml浓硫酸+800ml水。

    10×TBS:Tris 48.4g NaCl 116.8g,用HCl调节pH=7.4,加去离子水定容至2L,常
    温保存。

    1×TBST:取10×TBS 2L,Tween 20ml,加去离子水至20L,常温保存。

    TMB显色液配方:A液与B液以体积比1:1混合,临用前混合。A液:0.2M Na2HPO4
    25.7ml,0.1M柠檬酸24.3ml,H2O2 0.1%,H2O 50ml。B液:TMB 3.9g,柠檬酸10.52g,EDTA
    1.86g,甘油2000ml,DMSO 300ml,溶解后加H2O至10000ml(注意TMB先用DMSO溶解)。

    操作步骤:

    1)包板:用包被缓冲液将组蛋白GST-NP抗原稀释至1μg/ml,ELSIA板的96孔板中
    加50μl,4℃过夜,次日,弃去孔内溶液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次,拍干。

    2)封闭:每孔加60μl的1%BSA进行封闭,置37℃孵育1h,之后弃封闭液。

    加样:加免疫小鼠血清稀释样品(小鼠血清按照1:200、1:1000、1:5000、1:10000、
    1:20000、1:60000、1:240000的比例稀释)50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阴性对
    照孔(不加小鼠血清而加1%BSA)。置37℃孵育1h,之后弃液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔
    180μl洗2次,拍干。

    3)加酶标抗体:加稀释的羊抗鼠二抗-HRP(1:10000稀释,用1%BSA进行稀释),以
    50μl/孔加入酶标板孔中,置37℃孵育45min,之后弃液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl
    洗3次,拍干。

    4)加底物液显色:于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100μl(A液与B液以1:1配
    制,现配现用),置37℃反应5min。

    5)终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸100μl,终止反应。

    6)读板:将酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数,保存数据,进行分析。

    1.15.2.2通过Western Blot方法对小鼠B4血清效价进行检测和鉴定

    试剂配方:同前述ELSIA方法。

    操作步骤:

    1)裁膜

    2)一抗反应:加样槽中用5%的脱脂奶粉稀释小鼠血清样品(1:50稀释),反应体积
    为1ml,把泡于TBST中的膜条分别用镊子夹入对应加样槽中,室温摇床上反应1h。

    3)洗膜:先用1×TBST以每道1ml的用量连续洗8遍,接着水平摇床10min×3遍。

    4)二抗反应:用5%的脱脂奶粉按照每条膜1ml的用量稀释羊抗鼠二抗,1:5000稀
    释使用,保证二抗充分混匀。之后将经过一抗处理后的膜夹入装有二抗的对应槽内,室温摇
    床上反应1h。

    5)洗膜:先用1×TBST以每道1ml的用量连续洗8遍,接着水平摇床10min×3遍。

    6)底物反应:底物需提前30min从4℃冰箱拿出平衡至室温。底物分为A液与B液,以
    每条膜200ul的总体积来计算用量,根据所需用量以1:1的比例临用前混合配置。将配好的
    底物用1ml移液器均匀地加于所有膜上,静置反应3min。再将塑料垫片竖立起来,在吸水纸
    上倒去底物液,用镊子排布好膜,两个项目之间留出1cm以上的空隙,同一个项目的膜与膜
    之间留出2-3mm空隙,之后用塑料膜封盖,准备曝光。

    7)曝光:曝光时间按照条带荧光强弱而不同,一般肉眼能看到比较明亮的荧光条
    带曝光1min;肉眼隐约能看到荧光曝光2min;肉眼看不到任何荧光曝光3min。曝光完毕后将
    胶片立即放入显影液中,先反应2min左右,之后用手不时地拿起胶片观察,直到条带清晰为
    止。显影过度可能出现多余的杂带并且加深背景。之后将胶片放入清水中漂洗,接着放入定
    影液中,定影2min以上。将定影结束后的胶片取出放在水盆中,带出暗室。胶片在自来水下
    冲洗干净,干燥,记录结果。

    8)结果处理:在完全干燥后的胶片上标注检测内容,项目编号,分子量,膜的名称,
    制膜日期,曝光时间,检测日期。

    1.16细胞融合

    以ELISA和Western Blot筛选出含高效价血清的免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进
    行体外融合。

    1.16.1融合及检测操作步骤:

    小鼠脾细胞的制备、细胞融合、以及选择性培养杂交瘤细胞。

    1.16.1.1脾细胞的制备:

    1)抓住免疫后的小鼠尾巴,拉紧小鼠颈部皮肤保持其头部无法自由转动的同时,
    使其眼珠向外突出。

    2)用弯头镊子将突出的眼球摘下,收集从眼眶中流出血液。

    3)待血流完后,断颈处死小鼠,并放入盛有75%酒精的烧杯中消毒。

    4)将烧杯连同小鼠和酒精一并带入无菌室内。

    5)用镊子将小鼠从酒精中取出,沥干酒精后,放入超净台上。

    6)用镊子将小鼠腹部毛皮层提起,用无菌眼科剪剪出一个倒三角的切口后,用止
    血钳将其腹部毛皮层撕开,露出腹腔。

    7)用无菌小镊子提起小鼠腹腔膜,用另一无菌眼科剪剪开腹腔膜,露出整个腹腔。

    8)在腹腔右上方,找出脾脏,小心取出,放入盛有预热的1640培养液的玻璃平皿
    中,洗涤三遍。

    9)用镊子在脾脏一端先造成一个穿孔,然后用两把镊子将脾脏中的脾细胞挤压出
    来,然后用1ml的枪将脾细胞吹散,收集至15ml离心管,1500rpm离心5min。

    10)去上清液,加入3ml红细胞裂解液,吹匀细胞,静置5min后,1500rpm离心5min,
    弃上清,沉淀加入10ml预热的1640培养基。

    1.16.1.2细胞融合:

    1)将生长状态良好的SP2/0细胞,吹打下来后,1000rpm离心5min。

    2)弃去上清,用4ml预热的1640培养液重悬,1000rpm离心5min。

    3)重复步骤2)。

    4)弃去上清,加入适量预热的1640培养液重悬沉淀。

    5)取50ul细胞悬液,于显微镜下检活计数。

    6)每个融合取1×107个细胞,与处理好的1×108个脾细胞在进口的50ml离心管中
    混合均匀后,1350rpm离心7min。

    7)用抽液泵抽干上清,在超净台桌面上敲打离心管底部,使沉淀松动呈糜状沿着
    离心管底部的管壁,缓慢加入1ml PEG,在90s内完成。

    8)将离心管静置60s。

    9)沿管壁缓慢滴加5ml预热的1640培养液,先慢后快,终止反应再逐渐加快速度,
    最终加入40ml预热的1640培养液,再将细胞吸起缓慢地将细胞打入培养基中以致均匀分
    布。

    10)步骤7)-9)在3min内完成。

    11)1200rpm离心5min。

    12)弃去上清,加入25ml预热的15%FBS 1640(1*HAT)培养基,用10ml移液管小心
    重悬细胞。

    13)200ul/孔的量将步骤12)中的混合细胞悬液铺到96孔细胞培养板上,数量10
    板。

    1.16.1.3选择性培养杂交瘤细胞:

    1)融合后第四天,吸尽融合板上的培养液,避免吸走板底的细胞。

    2)每孔补液(15%FBS血清,1×HAT,1640)150ul。

    3)根据克隆大小,于融合后第6天,吸尽融合板上的培养液。

    4)每孔补液(15%FBS血清,1×HAT,1640)50ul。

    5)融合后第10天,取上清应用ELISA进行初筛(Primary-screen)。

    6)挑取ELISA检测阳性的孔至一新的96孔板进行转孔,弃去原来的上清。

    7)根据克隆大小,于转孔后第2天再次取样应用ELISA进行确认(Confirm-
    screen)。

    8)待Confirm-screen结果阳性的孔长大后,转至24孔板。

    9)培养4天后,取上清,WESTERN BLOT鉴定。

    10)根据WESTERN BLOT结果,将阳性的克隆进行亚克隆处理,筛选单克隆细胞株。

    1.16.2重组蛋白GST-NP融合检测

    通过ELSIA方法,96孔板取多克隆细胞株上清液检测阳性,挑选分泌所需抗体的多
    克隆细胞株。

    1)包板:用包被缓冲液将重组蛋白GST-NP稀释至1μg/ml,在96孔板中加50μl/孔,
    4℃过夜,次日,弃去孔内溶液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次,拍干。

    2)封闭:每孔加60μl的1%BSA进行封闭,置37℃孵育1h。之后弃封闭液。

    3)加样:加融合后的多克隆细胞株上清(含有细胞分泌的抗体),50μl于上述已封
    闭的反应孔。同时设置好阴性对照孔(不加小鼠血清加1%BSA)。置37℃孵育1h,之后弃液,
    用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次,拍干。

    4)加酶标抗体:加稀释的羊抗鼠二抗-HRP(用1%BSA进行1:10000稀释),以50μl/
    孔加入酶标板孔中,置37℃孵育45min,之后弃液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次,
    拍干。

    5)加底物液显色:于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100μl(A液与B液以1:1配
    制),置37℃反应5min。

    6)终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸100μl,终止反应。

    7)读板:将酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数,保存数据,进行分析。

    1.17细胞亚克隆(sub)挑选单克隆细胞株

    1)取Western Blot结果阳性的多克隆期细胞,用(15%FBS,1×HT,1640)培养液重
    悬,通过细胞计数,确定铺板细胞量。(1板96孔板挑选200-220个细胞)。

    2)以200ul/孔的量,将稀释好的细胞铺到新的96孔板中。

    3)7天后,待克隆长至1/8-1/10底面大,可取上清,送检ELISA(Subclone-
    screen)。

    4)从ELISA结果阳性的孔中挑选单克隆细胞株,一般挑选10-12个,单克隆不多时
    用双克隆、三克隆补足。每个细胞孔逐个换液,于1-2天再次取样送检ELISA(Subclone
    Confirm-screen)。5)每板sub选2-3个阳性值最好,细胞状态最好的克隆扩增至24孔板。

    6)培养72h后,进行Western Blot检测。

    7)选取Western Blot结果好的克隆,扩增至6孔板。

    8)最终扩增至100mm dish,每个克隆各冻存2管。

    9)将综合结果最好的细胞株,扩大生产制备腹水,然后再进行二次亚克隆,扩增细
    胞,再冻存2-3管。

    1.18单克隆细胞株腹水抗体制备、纯化、亚型鉴定、以及效价检测

    1.18.1挑选的单克隆细胞株制备腹水

    1)提前7天准备腹水制备用的小鼠,将诱导剂注射至小鼠体内。

    2)提前准备需要接种的细胞,注射当天每只小鼠注射8X105个细胞,根据所需接种
    的小鼠数量,饲养细胞。

    3)小鼠诱导7天后注射细胞。

    4)注射的细胞先用无血清培养基(1640)将细胞吹下来,计数,离心(1500rpm,
    5min)。

    5)去上清,再用无血清培养基将细胞悬浮至浓度为8X105个/mL,1mL每管分装到
    1.5mLEP管中,接种小鼠,1ml注射1只小鼠。

    6)第7天左右小鼠开始产腹水,开始收集腹水。

    1.18.2单克隆细胞株的腹水亚型鉴定

    1)包板:用包被缓冲液将GST-NP重组蛋白稀释至1μg/ml,ELSIA板的96孔板中加
    50μl,4℃过夜,次日,弃去孔内溶液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次,拍干。

    2)封闭:每孔加60μl的1%BSA进行封闭,置37℃孵育1h。之后弃封闭液。

    3)加样:加1:1000稀释的小鼠腹水,50μl于上述已封闭的反应孔。同时设置好阴性
    对照孔(不加小鼠血清加1%BSA)。置37℃孵育1h,之后弃液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔
    180μl洗2次,拍干。

    4)加酶标抗体:加稀释的分型二抗-HRP(用1%BSA进行1:4000稀释),以50μl/孔
    加入酶标板孔中,置37℃孵育45min,之后弃液,用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次,拍
    干。

    5)加底物液显色:于各反应孔中加入配制的TMB底物溶液100μl(A液与B液以1:1配
    制),置37℃反应5min。

    6)终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸100μl,终止反应。

    7)读板:将酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数,保存数据,进行分析。

    1.18.3单克隆细胞株腹水效价检测

    通过ELSIA和Western Blot方法检测小鼠腹水的效价,检测方法同免疫小鼠血清
    检测,稀释比例也同免疫小鼠血清。

    1.18.4单克隆细胞株腹水纯化

    1)将亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)充分清洗,流速70mL/h。

    2)取待纯化的血清10mL于50mL离心管,用孔径0.45μm,直径25mm微孔滤膜抽滤。

    3)将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样,重复一次。

    4)用20mL 1×PBS(pH7.4)清洗柱子,70mL/h的流速,10min后连接蛋白检测仪,清
    洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100。

    5)调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0,打开HD-A电脑采集器,将满屏量程调
    到5,用甘氨酸溶液(pH 2.7,0.2M)以40mL/h的流速洗脱抗体,在仪器示数开始升高时开始
    收集抗体。

    6)在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7.0,记录洗脱峰的
    最高峰值。

    7)抗体收集完后,调节pH值至7.0,记录洗脱的抗体体积,用纯净水冲洗连接收集
    器的橡胶管。

    8)依次用20mL 1×PBS和纯水以70mL/h的流速清洗亲和层析柱,加入20%乙醇,封
    口,4℃冰箱保存。

    1.18.5纯化后单克隆抗体效价检测

    通过ELSIA和Western Blot方法检测纯化后抗体的效价,检测方法同免疫小鼠血
    清检测,稀释比例也同免疫小鼠血清。

    1.19单克隆抗体的Western blot分析

    重组核蛋白经SDS-PAGE电泳,120mA恒流转膜2.5h,以纯化后1:100、1:500稀释的
    单克隆细胞株C3-E8和2-F11为一抗,以1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗,通过
    封闭反应、抗体孵育、底物反应、曝光显影,获得Western blot结果。

    2汉坦病毒S基因克隆、表达及单克隆抗体制备结果

    2.1S基因的PCR扩增及TA克隆鉴定

    Trizol提取后的RNA经pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物进行一步法RT-PCR
    扩增S基因,1.0%琼脂糖凝胶电泳显示扩增条带约1306bp,与预期大小一致,提示扩增的
    DNA为目的片段。以抽提后的TA克隆质粒为模板,用pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R引物
    对S基因进行PCR扩增,产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,可见一约1306bp的目的条带(见图1),
    与预期值一致。

    2.2pGEX-6P-2/S的构建与鉴定

    以抽提后的质粒pGEX-6P-2/S为模板,以pGEX-6P-2-F、pGEX-6P-2-R为引
    物进行PCR扩增,可见一约1306bp的目的条带(见图2),与预期值一致。用限制性内切酶EcoR
    Ⅰ、XholⅠ对重组质粒pGEX-6P-2/S进行双酶切,得到与目的基因(1306bp)及载体(4985bp)
    相同大小的2个片段(见图1)。挑取含插入片段pGEX-6P-2/S的阳性克隆,用小量质粒提取
    试剂盒提取质粒测序,结果表明S基因片段已经成功的插入pGEX-6P-2载体,且插入方向
    正确。

    2.3测序结果分析

    核蛋白基因编码区以起始密码ATG开始,以终止密码子TAA结尾,ORF长1290个核苷
    酸残基,包括碱基A423个(32.79%),碱基C244个(18.91%),碱基G325个(25.19%),碱基
    T298个(23.10%),GC含量为44.11%,AT含量为55.89%,单链分子量约为391.41kDa,编码
    429个氨基酸(20种),平均分子量为48.13kDa,含量最高的氨基酸为Leu(亮氨酸),占总蛋白
    含量的9.79%(42/429),含量最低的为Cys(半胱氨酸)和Trp(色氨酸),仅各占1.17%(5/
    429)。

    2.4pGEX-6P-2/S的表达与鉴定

    含重组质粒pGEX-6P-2/S的E.coli Star BL21(DE3)菌株应用不同浓度IPTG进
    行诱导,SDS-PAGE凝胶电泳图上均显示特异性条带,蛋白分子量与理论值一致,约为
    74kDa。菌株在IPTG终浓度1.0mmol/L、37℃条件下诱导3h条件下,表达量最大(见图2)。菌体
    经超声波破菌,包涵体经8mol/L尿素溶解后过GST亲和层析柱,SDS-PAGE凝胶电泳显示单
    一的目的蛋白条带,分子量与预期大小一致,约74kDa,融合蛋白主要存在于不溶性的包涵
    体中。

    2.5NP蛋白的纯化与Western blott鉴定

    A280紫外分光光度法测得蛋白浓度为1.80mg/mL。蛋白复性后经GST蛋白纯化柱纯
    化,SDS-PAGE凝胶电泳显示蛋白分子量约74kDa(见图3);以抗GST McAb为一抗、HRP标记的
    羊抗鼠IgG为二抗的Western blott在相应位置出现特异性条带。

    2.6小鼠血清ELSIA检测结果

    参见表1所示,5只小鼠血清ELSIA检测结果显示效价均已经达到合格标准(1:
    10000>0.6)。

    表1重组蛋白GST-NP小鼠血清ELSIA检测效价结果





    2.7实验动物(小鼠)血清Western Blot检测结果

    图4是本发明实施例的免疫小鼠血清Western Blot检测结果的SDS-PAGE电泳图,
    参见图4所示,5只免疫小鼠血清Western Blot检测效价均合格。综合ELISA和Western Blot
    效价结果,挑选1249-7小鼠进融合。

    2.8细胞融合检测结果

    多克隆细胞株筛选阶段(pri阶段)ELSIA方法检测结果为:1249-7免疫小鼠融合
    结果阳性较多,具体结果见表2。

    表2多克隆细胞株筛选阶段(pri阶段)ELSIA方法检测结果























    针对重组蛋白的标签进行交叉筛选,去除与标签蛋白反应的细胞株ELSIA方法检
    测结果绝大部分为阳性。

    表3去除与标签蛋白反应的细胞株ELSIA方法检测结果





    多克隆细胞株筛选阶段阳性(pri阶段)Western Blot方法检测结果为:方法同小
    鼠血清阶段,检测样品为多克隆阶段细胞株上清液、原液检测,检测结果阳性率较高,参见
    图5,结合Western Blot和ELSIA结果挑选阳性较好的细胞株进行细胞亚克隆(sub)挑选单
    克隆细胞株。

    2.9细胞亚克隆(sub)挑选单克隆细胞株

    Sub阶段ELSIA检测结果(ELSIA检测方法同pri阶段,检测sub板每个细胞孔里细胞
    的抗体分泌情况)参见表4,A2#、C3#、2#、10#、6#效果较好。

    表4Sub阶段细胞亚克隆ELSIA检测结果













    sub阶段的阳性细胞株挑选10颗左右单克隆细胞株进行复检,同时上清液做1:20
    的稀释检测效价及叉检his标签蛋白。具体参见表5,通过ELSIA方法筛选后,每个多克隆来
    源的单克隆细胞株,分别挑选2株比较好的细胞株进行扩大培养和Western Blot检测结果
    较好。Western Blot检测sub后单克隆细胞株上清液的抗体分泌良好,参见图6。

    表5sub阶段的阳性细胞株ELSIA复检结果









    2.10单克隆细胞株腹水抗体亚型检测结果

    对2株(C3-E8和2-F11)单克隆细胞株的小鼠腹水抗体亚型检测结果均为IgG1类
    型k链,具体参见表6。

    表6单克隆细胞株的腹水抗体亚型检测结果



    2.11单克隆细胞株腹水效价检测结果

    通过ELSIA和Western Blot方法检测单克隆细胞株C3-E8和2-F11的小鼠腹水的
    效价,检测方法同免疫小鼠血清检测,稀释比例也同免疫小鼠血清。参见图7和图8,ELSIA和
    WesternBlot结果都较好。

    2.12单克隆细胞株腹水纯化结果

    参见图9所示,腹水纯化峰值较为集中,纯化效果较好。

    2.13纯化后单克隆抗体效价检测结果

    通过ELSIA和Western Blot方法检测纯化后单克隆抗体(单克隆细胞株C3-E8和
    2-F11)的效价,检测方法同免疫小鼠血清检测,稀释比例也同免疫小鼠血清。参见表7和图
    10,ELSIA和Western Blot结果较好。

    表7ELSIA方法检测纯化后抗体的效价结果


    2.14单克隆抗体检测结果

    根据纯化后单克隆抗体(单克隆细胞株C3-E8和2-F11)检测效价,进行适当浓
    缩,通过ELSIA方法检测浓缩后抗体达到更高的效价,具体参见表8。

    表8ELSIA方法检测单克隆抗体的效价结果


    3异硫氰酸荧光素标记单克隆抗体及应用

    用PBS(PH9.0)调整单克隆细胞株C3-E8和2-F11的单抗浓度为10mg/ml,取1mg
    FITC溶于0.2mlDMSO,滴加于抗体液内,室温避光作用2h进行交联反应,交联混合物经葡聚
    糖凝胶Sephadex G25柱进行纯化。对纯化后的C3-E8、2-F11单克隆抗体应用含1%FBS的
    PBS进行1:100稀释,建立常规IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织(经IFA、PCR和测序鉴定)进
    行检测,与1:50稀释的汉坦病毒多克隆抗体(第四军医大)检测效果进行比较。

    应用结果:将FITC标记到C3-E8、2-F11两株单克隆抗体后,1:100进行稀释,对鉴
    定后的汉坦病毒感染鼠肺组织进行检测,在荧光显微镜下可见在被感染的鼠肺组织中见到
    密集的苹果绿色荧光颗粒,与1:50稀释的多克隆抗体检测结果进行比较,参见图11。

    国内目前没有较好的应用关于汉坦病毒感染后检测的单克隆抗体,大部分均为多
    抗。大量实验证明,汉坦病毒核蛋白存在有许多血清型特异性抗原位点,具有良好的免疫原
    性,有极高的诊断应用价值。我们通过构建汉坦病毒S基因PGE原核蛋白原核表达载体系,转
    染大肠埃希菌诱导表达,获得具有抗原活性的核蛋白。通过分离纯化,得到了该核蛋白包涵
    体抗原,通过免疫小鼠,制备杂交瘤细胞,亲和纯化后得到了高纯度核蛋白。用核蛋白包被
    酶标板,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞克隆株,建立了细胞系。选取2株高效价单抗细胞2-F11
    和C3-E8,常规制备腹水后鉴定了其免疫球蛋白种类和IgG亚类。同时将FITC标记到2-F11
    和C3-E8单抗上,检测鼠肺组织中的汉坦病毒抗原,取得了满意的效果。

    本发明实施例的技术方案带来的有益效果是:上述汉坦病毒S基因克隆、表达、单
    克隆抗体的制备方法,可分离到了纯度较高的目的蛋白,最大程度地恢复了变性后重组蛋
    白的生物活性,重组蛋白GST-NP具有较好的免疫原性和免疫反应性,获得杂交瘤细胞株能
    稳定分泌高效价的单克隆抗体,经与FITC进行交联,建立的IFA试验能用于汉坦病毒感染后
    鼠组织器官标本中病毒抗原的检测。

    以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽
    然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人
    员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰
    为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对
    以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。

    关 键 词:
    病毒 基因 克隆 表达 单克隆抗体 制备 方法 及其 应用
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