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    乐彩重庆时时彩走势分析: 一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611259551.5

    申请日:

    2016.12.30

    公开号:

    CN106636121A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/13申请日:20161230|||公开
    IPC分类号: C12N15/13; C12N15/85; C07K16/28; C07K1/22; G01N33/68 主分类号: C12N15/13
    申请人: 武汉金开瑞生物工程有限公司
    发明人: 华权高; 沈鹤霄; 马峰; 罗绍祥; 肖颖; 舒芹; 徐春雷
    地址: 430000 湖北省武汉市东湖开发区高新大道818号高科医疗器械园B11号1楼、2楼
    优先权:
    专利代理机构: 武汉智嘉联合知识产权代理事务所(普通合伙) 42231 代理人: 黄君军
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611259551.5

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法及其应用,包括以下步骤:步骤(1):获取CD14抗体重链及轻链可变区序列;步骤(2):构建重链轻链表达载体;步骤(3):共转293T细胞表达CD14抗体,用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞,诱导后获得含有人类抗体恒定区的膜蛋白CD14抗体。本发明是通过用细胞直接作为抗原免疫小鼠后,小鼠的免疫系统直接识别细胞表面的膜蛋白。

    权利要求书

    1.一种膜蛋白CD14的抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
    步骤(1):获取CD14抗体重链及轻链可变区序列:
    以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后,提取脾脏mRNA,反转录得到
    抗体cDNA,根据抗体可变区两端的保守序列设计特异性引物,引物序列见核苷酸序列表,分
    别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区,在重链可变区的上游和轻链可变
    区下游分别引入双酶切位点,以linker序列为接头,通过重叠延伸PCR技术将重链可变区和
    轻链可变区的片段连接起来,以此为连接产物为模板,以引物scFv for和scFv back进行二
    次PCR,得到单链抗体scFv基因片段;对scFv基因和pCAN TAB5E噬菌粒载体进行双酶切并连
    接,转化大肠杆菌TG1感受态细胞中,加入M13KO7辅助噬菌体超感染后,得到噬菌体展示的
    抗体库;将噬菌体展示的抗体库加入CD14蛋白包被的免疫管中进行富集筛选得到鼠抗CD14
    抗体的重链可变区和轻链可变区序列;
    步骤(2):构建重链轻链表达载体:
    以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板进行PCR扩增,
    将PCR扩增得到的带胶回收并用内切酶进行双酶切,回收目的片段,载体pFUSEss-CHIg-hG1
    用同样的内切酶双酶切,然后用T4DNA连接酶连接载体和目的片段,将连接产物转化至大肠
    杆菌DH5α感受态细胞中,进行菌落PCR,筛选阳性单克隆菌落扩增提取得到pFUSEss_CHIg重
    链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒;
    步骤(3):共转293F细胞表达CD14抗体:
    将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质?;旌?,通过
    PEI缓释液转染至293F细胞中,用抗性筛选含有两种质粒的293F细胞株,培养细胞获得含有
    人类抗体恒定区的膜蛋白CD14抗体。
    2.如权利要求1所述的膜蛋白CD14的抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,
    linker序列为4个甘氨酸和1个丝氨酸((Gly4Ser)3)的15肽序列对应的45bp的基因序列。
    3.如权利要求1所述的膜蛋白CD14的抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,噬
    菌体展示的抗体库的富集筛选的具体过程如下:将所得噬菌体展示的抗体库加入CD14蛋白
    包被的免疫管中,于37℃下静置孵育1h,洗涤,用100mmol/L三乙胺洗脱,加入1mol/L Tris
    (pH8.5)进行中和,以此感染对数生长期TG1,经培养后收集菌体细胞,再次加入M13KO7辅助
    噬菌体进行感染,重复上述富集程序3次,挑取单菌落扩大培养,进行菌液PCR鉴定和单克隆
    Phage-ELISA鉴定后进行测序,得到重链和轻链可变区的序列。
    4.如权利要求1所述的膜蛋白CD14的抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,
    PCR扩增具体过程如下:分别设计用于扩增重轻链可变区的引物,上游:5’-
    CTTGGAATTCGAGGTGAAGCTCAAGGAGTCT-3’,下游:5’-GAATCTCGAGTGTCGACACGGTGACCGTGG-3’,
    以筛选得到的鼠抗CD14抗体的重链可变区和轻链可变区序列作为模板,用上述引物及Pfu
    DNA聚合酶进行PCR扩增,反应条件如下:94℃预变性2min、94℃变性30s、60℃退火30s、72℃
    延伸60s,共35个循环,最后72℃终延伸5min,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析回收
    纯化。
    5.如权利要求1所述的膜蛋白CD14的抗体的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中,细
    胞转染的具体过程如下:转染前将293T细胞传代,保证细胞汇合度达到80%~85%,将DNA
    稀释液和PEI稀释液混合,静置5min后加入293T细胞中,放于37℃的二氧化碳培养箱中培
    养,转染48h取样检测抗体是否表达,根据检测情况确定收样时间。
    6.一种如权利要求1~5所述的膜蛋白CD14的抗体的纯化方法,其特征在于:包括如下
    步骤:1)取亲和层析柱,先用水洗柱床,再用乙酸钠缓冲液洗涤层析柱;2)取细胞培养液,于
    4℃、转速12000rpm下离心10min,收集上清,用0.45μm的滤膜过滤;3)取细胞培养基上清与
    等量的乙酸钠缓冲液混合,以0.5mL/min的速度上样,收集穿透;4)上样结束后,继续以乙酸
    钠缓冲冲洗至G250检测无色,用冰乙酸洗脱缓冲冲洗柱床,搜集洗脱峰,迅速用饱和碳酸钠
    调洗脱峰pH至中性;5)用10倍体积的超纯水洗涤层析柱,再用10mLNaCl-叠氮钠缓冲封闭层
    析柱,置于4℃备用;6)将洗脱峰超滤浓缩,装入透析袋4℃PBS缓冲透析过夜;7)取出样品,
    于4℃、12000rpm下离心10min,收集上清,,加入叠氮钠即得纯化后的膜蛋白CD14抗体。
    7.一种如权利要求1~5所述的膜蛋白CD14的抗体的应用,其特征在于:所述抗体用于
    识别CD14膜蛋白。

    关 键 词:
    一种 膜蛋白 CD14 抗体 制备 方法 应用
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