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    重庆时时彩计划群呢: 一种用于诊断哮喘的分子标志物.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611239181.9

    申请日:

    2016.12.28

    公开号:

    CN106636413A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20161228|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; G01N33/68 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 常州市第二人民医院
    发明人: 张倩; 毛正道; 曹琦
    地址: 213003 江苏省常州市天宁区兴隆巷29号
    优先权:
    专利代理机构: 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 代理人: 孟祥斌;李红伟
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611239181.9

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种用于诊断哮喘的分子标志物,具体地该诊断标志物为HEMGN,本发明首次发现了HEMGN在哮喘患者中表达上调,提示检测HEMGN的表达水平可以成为哮喘早期诊断的指标之一;同时本发明为哮喘的发病机理的研究提供了理论依据;本发明还提供了一种用于哮喘诊断的产品。

    权利要求书

    1.一种HEMGN基因或其表达产物的应用,其特征在于,用于制备诊断哮喘的产品。
    2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括测定样本中HEMGN基因或其
    表达产物的表达水平的试剂。
    3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述试剂选自:
    特异性扩增HEMGN基因的引物;
    特异性识别HEMGN基因的探针;或
    特异性结合HEMGN编码的蛋白的抗体或配体。
    4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述特异性扩增HEMGN基因的引物序列如
    SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
    5.一种体外检测样本中HEMGN表达水平的产品,其特征在于,所述产品包括制剂、芯片、
    或试剂盒。
    6.根据权利要求5所述的产品,其特征在于,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。
    7.根据权利要求6所述的产品,其特征在于,所述基因芯片包括针对HEMGN的特异性引
    物或探针,所述蛋白质芯片包括特异性结合HEMGN编码的蛋白的抗体或配体。
    8.根据权利要求5所述的产品,其特征在于,所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免
    疫检测试剂盒。
    9.根据权利要求8所述的产品,其特征在于,所述基因检测试剂盒包括检测HEMGN的特
    异性引物、探针或基因芯片;所述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合HEMGN蛋白的抗体、
    配体或蛋白质芯片。
    10.权利要求5-9任一项所述的产品在制备哮喘的早期诊断工具中的应用。

    说明书

    一种用于诊断哮喘的分子标志物

    技术领域

    本发明属于生物医药领域,涉及一种用于诊断哮喘的分子标志物,具体地该分子
    标志物为HEMGN。

    背景技术

    支气管哮喘(简称哮喘)是一种以呼吸道气流受限、气道重塑、和慢性炎症为特征
    的慢性气道炎症性疾病,是目前发达国家儿童支气管疾病中发病率最高的一种。其是由多
    种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细
    胞、平滑肌细胞,气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。这种慢性炎症
    导致气道高反应性,通常出现广泛多变的可逆性气流受限,并引起反复发作性的喘息、气
    急、胸闷或咳嗽等症状,常在夜间和(或)清晨发作、加剧。哮喘发病率和病死率呈逐年上升
    趋势,全球范围内目前有3亿哮喘患者,其所造成的社会负担超过了结核病和艾滋病的总
    和。我国的哮喘患者己达3000万以上,其死亡率位列全球第一。

    哮喘的病因目前尚未完全阐明,是与多基因遗传有关的疾病,同时受环境因素和
    遗传因素的双重影响,随着分子生物学和遗传学的不断发展,越来越多研究认为,基因在哮
    喘的发生发展过程中起着重要的调控作用,寻找与哮喘相关的基因将有利于哮喘的预防,
    对缓解哮喘的高发病率和高死亡率具有重要的意义。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种基因标志物在哮喘诊断中的应用。

    本发明提供了一种HEMGN基因或其表达产物的应用,用于制备诊断哮喘的产品。

    进一步,所述产品包括测定样本中HEMGN基因或其表达产物的表达水平的试剂。

    其中,HEMGN在患者中表达上调。其中测定HEMGN基因或其表达产物的表达水平技
    术包括但不限于测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定,核酸扩增技术包括但
    不限于聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置
    换扩增或基于核酸序列的扩增。

    进一步,所述试剂选自:

    特异性扩增HEMGN基因的引物;

    特异性识别HEMGN基因的探针;或

    特异性结合HEMGN编码的蛋白的抗体或配体。

    进一步,所述特异性扩增HEMGN基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所
    示。

    本发明提供了一种体外检测样本中HEMGN表达水平的产品,所述产品包括制剂、芯
    片、或试剂盒。

    一方面,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片。优选的,所述基因芯片包括固相载
    体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测HEMGN基因转
    录水平的针对HEMGN基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相
    载体上的HEMGN蛋白的特异性抗体或配体。

    其中,所述基因芯片可用于检测包括HEMGN基因在内的多个基因(例如,与哮喘相
    关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括HEMGN蛋白在内的多个蛋白质
    (例如与哮喘相关的多个蛋白质)的表达水平。

    进一步,所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

    进一步,所述基因检测试剂盒包括检测HEMGN的特异性引物、探针或基因芯片;所
    述蛋白免疫检测试剂盒包括特异性结合HEMGN蛋白的抗体、配体或蛋白质芯片。

    进一步,所述检测试剂盒还包括对照、使用说明书或标签。

    本发明提供了上述产品在制备哮喘的早期诊断工具中的应用。

    本发明的优点和有益效果:

    本发明首次发现了HEMGN基因表达与哮喘的发生发展相关,对于揭示哮喘的发病
    机理具有重要的意义。

    本发明提供了一种诊断产品,通过检测血液中HEMGN的表达水平,实现哮喘的早期
    诊断,从而提高哮喘患者的生存质量。

    附图说明

    图1是利用QPCR检测HEMGN基因在哮喘患者中的表达情况图;

    图2是利用免疫印迹在蛋白水平上检测HEMGN基因的差异表达的图。

    具体实施方式

    本发明首次发现了HEMGN与哮喘的发生发展相关,并验证了血液中的HEMGN在哮喘
    诊断中高表达。HEMGN可作为哮喘的独立预测因子,也可以和其他的基因标志物联合应用。

    本发明中术语“分子标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正?;蚪】迪赴?br />或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。

    本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的
    任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例,标志物基因可具有SEQ ID NO.1
    或SEQ ID NO.2指定的编码序列或氨基酸序列。在一些实施方案中,其具有与所列的序列至
    少85%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列,诸如上述所列的序列至少90%、91%、92%、
    93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。

    本发明所述的分子标志物包括基因和蛋白。此类标志物包括含有编码分子标志物
    的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。分子标志物核酸还包括含有所
    关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。分子标志物蛋白是由本发明的DNA分子标志
    物编码的或对应于本发明的DNA分子标志物的蛋白。分子标志物蛋白包含任何分子标志物
    蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。分子标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发
    明的范围内。所谓“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列并因而编码的蛋白的一部
    分。为分子标志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少10、15、20、50、75、100、150、
    200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或
    1,400个连续的核苷酸,或最多存在于本文所公开的全长分子标志物多核苷酸中的核苷酸
    个数。分子标志物多核苷酸的片段将通常编码至少15、25、30、50、100、150、200或250个连续
    氨基酸,或存在于本发明的全长分子标志物蛋白中的氨基酸的总数?!氨涮濉敝赣氩握斩嚯?br />具有至少约60%氨基酸序列同一性且保留天然存在参照多肽的至少一项生物学活性的多
    肽。天然存在变体可包括与参照多肽具有至少约65%氨基酸序列同一性,至少约70%氨基
    酸序列同一性,至少约75%氨基酸序列同一性,至少约80%氨基酸序列同一性,至少约80%
    氨基酸序列同一性,至少约85%氨基酸序列同一性,至少约90%氨基酸序列同一性,至少约
    95%氨基酸序列同一性,至少约98%氨基酸序列同一性或至少约99%氨基酸序列同一性的
    变体多肽。

    本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理
    解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面??梢栽谧蓟蚍?即蛋白)水平上检测
    生物标志物的表达水平。

    在一些实施方案中,在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技
    术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离
    (例如,用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹),但是也可以在不利
    用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如,通过斑点印迹)?;蜃镈NA(例如,来自
    人)的Southern印??捎糜谏秆∠拗菩云纬ざ榷嗵?RFLP),以检测影响本发明多肽的
    遗传病症的存在??梢约觳馑行问降腞NA,包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、
    核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。

    核酸杂交形式的选择不是关键的。多种核酸杂交形式包括但不限于夹心测定和竞
    争或替代测定。

    杂交复合物的检测可需要产信号复合物与靶标和探针多核苷酸或核酸的双螺旋
    的结合。通常,这种结合通过配体和抗配体相互作用而发生,例如配体偶联的探针和偶联有
    信号的抗配体之间的相互作用。通过暴露于超声能,信号生成复合物的结合也易于得到加
    速。

    标记也可以允许间接检测杂交复合物。例如,如果标记是半抗原或抗原,可以通过
    使用抗体来检测样本。

    术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另
    有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)
    结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的
    靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限
    于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

    杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定,而且通常根据探针
    长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言,较长的探针要求较高的温度以正确退火,
    而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中
    时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高,可使用的相对
    温度也越高。结果是,推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格,而较低温度也就
    较不严格。

    探针通常被直接标记,例如用同位素、发色团、发光团、色原体,或被间接标记,例
    如用生物素,链霉亲和素复合物随后可以与生物素结合。因此,本发明测定中所用的可检测
    的标记可以是一级标记(其中该标记包含可直接检测的元件或能产生直接可检测的元件的
    元件)或二级标记(其中可检测的标记与一级标记结合,例如,免疫标记中常用的)。通常,标
    记的信号核酸用于检测杂交??梢酝üS糜诩觳庠咏欢嗪塑账岽嬖诘氖址椒ㄖ械娜我?br />种标记互补的核酸或信号核酸。最常用的检测方法是利用用3H、125I、35S、14C或32P标记的探
    针等的放射自显影法。其它标记包括,例如,能结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光剂、
    酶以及能作为标记配体的特异结合对成员的抗体。

    术语“芯片”也称为“阵列”,指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常
    包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列,也称为
    “微阵列”,通??梢岳没岛铣煞椒ɑ蚬庖己铣煞椒ɡ床庑┱罅?,所述光引导合
    成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面,或者可以是珠
    子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽??梢砸?br />一定的方式来包装阵列,从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

    “微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上,所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探
    针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质,例如,玻璃或二氧化硅
    玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质,例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或
    其中的任何排列。

    各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文
    所述表型相关的标志物。例如,DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则,可以通
    过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻
    璃晶片,其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000
    万个用于识别较长样品DNA序列(例如,来自个体或群体,例如,包含所关注的标志物)的DNA
    探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列
    杂交时,样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳
    固地杂交,有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中,由此确定核酸中发现的标志物
    是否存在?;箍梢允褂谜庖皇侄瓮ü刂圃咏惶跫栽市砬鸬ヒ缓塑账?,例如,用于SNP
    鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个
    多态性标志物的便利性实施方案。

    上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,
    只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有
    80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,
    也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工
    核酸置换得到的多核苷酸。

    本发明中使用的针对上述STAC2蛋白质的抗体只要能够发挥抗肿瘤活性就可以是
    任何种类的抗体,包含例如,单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、例如合成抗体、多特异性
    抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体等)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFv)等人
    抗体,它们的抗体片段、例如Fab、F(ab’)2、Fv等。这些抗体及其片段还可以通过本领域技术
    人员公知的方法制备。

    “单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相
    同和/或结合相同表位,除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外,此类变体一
    般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物
    结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到
    的。

    “嵌合”抗体的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或
    亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体
    类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望
    的生物学活性即可。

    “抗体或抗体片段”指无论自天然生成抗体的任何物种衍生,还是通过重组DNA技
    术创建;无论自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离的抗体(例如IgG、IgM、IgA、
    IgD或IgE)或片段(诸如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗
    体、二硫化物连接的scFv、双抗体)。

    在本发明中,分子标志物的“高表达”或“过表达”或“表达上调”是指生物标志物的
    表达高出10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、
    500%或更多。

    在本发明的上下文中,“诊断哮喘”既包括判断受试者是否已经患有哮喘、也包括
    判断受试者是否存在患有哮喘的风险。

    术语“样本”包括诸如活检和尸检样本的组织切片以及采集用于组织学目的的冷
    冻切片。这类样本包括血液、唾液、组织、裂解的细胞、培养的细胞(例如,原代培养物、外植
    体和转化的细胞)、粪便、尿液等。在本发明的具体实施方式中,所述样本为血液。

    实施例

    下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本
    发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条
    件,例如Sambrook等人,分子克?。菏笛槭沂植?New York:Cold Spring HarborLaboratory
    Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

    实施例1筛选与哮喘相关的基因标志物

    1、样品收集

    按照支气管哮喘诊断与防治指南的诊断标准,各收集10例正常人血液和哮喘患者
    血液外周静脉血3ml,患者均知情同意,上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

    2、RNA样品的制备及质量分析

    2.1RNA样品的制备

    使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下:

    1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血,放进无菌离心管中;

    2)3000rpm(400g)离心5min,小心地从样品顶部吸走上清;

    3)加1ml血细胞裂解液,小心吸放4-5次,重悬沉淀物;

    4)3000rpm离心5min;

    5)重复步骤3)和4)两次(共三次);

    6)避开细胞沉淀物,小心吸走几乎所有上清,只保留100μl上清液;确认一下BME已
    经加到RNA裂解液中,然后加175μl RNA裂解液到细胞中,吸放重悬并裂解细胞;

    7)加350μl RNA稀释液,颠倒混合3-4次;

    8)置于70℃水浴中3min;

    9)室温下13000g离心10min;

    10)将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中;

    11)向澄清裂解液中加入200μl 95%乙醇,用移液枪吸放3-4次以混合;将此混合
    物转移到离心柱装配体中,13000g离心1min;

    12)从离心柱装配体上拿下离心柱,弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管
    上,确认一下RNA Wash Solution已用乙醇稀释,加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体,
    13000g离心1min;

    13)弃去收集管中的液体,将离心柱装回到收集管上,将50μl新鲜制备的DNase孵
    育混合物直接加到离心柱内的膜上;

    14)室温下孵育15min,向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙
    醇),13000g离心1min;

    15)加入600μl RNA洗涤液(已加入乙醇),13000g,离心1min;

    16)清空收集管,向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇),高速离心2min;

    17)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上,向膜上加100μl无核酸酶水,将离心柱
    装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外,13000g离心1min,丢弃离心柱,盖好盛有RNA的
    洗脱管,存于-70℃。

    2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

    NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为
    1.8-2.2。

    2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)

    将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,Agilent Technologies
    2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整
    性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求,可以用于文库构建及
    测序。

    3、高通量转录组测序

    3.1RNA-seq读段定位

    首先将低质量的读段去除得到清洁读段,然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与
    UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配,H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引
    从TopHat主页下载,并作为参考基因组,利用TopHat与基因组匹配时,允许每个读段(默认
    到20)有多个匹配位点,最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的
    剪切位点库,根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用
    TopHat方法的系统默认参数。

    3.2转录丰度评估

    匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理,Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片
    段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定
    基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。
    Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_
    sapiens.GRCh37.63.gtf)。

    3.3差异表达基因的检测

    将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff,
    Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度,检测差异表
    达。在Cuffidff输出中只有q值<0.01,测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

    4、结果

    RNA-seq结果显示,HEMGN基因在哮喘患者血液中的表达量显著高于正常人的表达
    量。

    实施例2QPCR测序验证HEMGN基因的差异表达

    1、根据高通量测序的检测结果选择HEMGN基因进行大样本QPCR验证。按照实施例1
    中的方法收集选择哮喘患者血液和正常人血液样本各80例。

    2、RNA提取步骤同实施例1。

    3、逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下:

    (1)取总RNA 2μg进行逆转录,加入Oligo(dT)2μl,充分混匀;70℃水浴5min后立即
    冰浴2-3min;

    (2)构建25μl反应体系,其中包括5×逆转录缓冲液5μl,dNTP(2.5mM)5μl,RNasin
    40U/μl,M-MLV 200U/μl,补无核酶水至25μl;

    (3)42℃水浴60min后,95℃水浴5min以灭活M-MLV;

    (4)-20℃储存备用。

    4、QPCR扩增

    (1)引物设计

    根据Genebank中HEMGN基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由上海生
    工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下:

    HEMGN基因:

    正向引物为5’-ATGTGTCTGAACCTGAAG-3’(SEQ ID NO.3);

    反向引物为5’-ATGTGTTAGGAGAGTTGTC-3’(SEQ ID NO.4)。

    GAPDH基因:

    正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5);

    反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

    (2)配制25μl PCR反应体系:

    向无菌EP管中加入去离子水8.5μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、正
    (反)向引物1μl、SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl、模板2μl混合均匀;其中,SYBR
    Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

    (3)PCR反应条件:95℃10min,(95℃15s,60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为
    荧光标记物,在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确
    定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。

    5、统计学方法

    实验采用3次重复实验,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,使用
    SPSS13.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统
    计学意义。

    6、结果

    结果如图1所示,与正常人血液相比,HEMGN基因在哮喘患者血液中的表达下调,差
    异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致。

    实施例3蛋白水平验证HEMGN的差异表达

    按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒
    检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测HEMGN蛋白变化,各组实验均重复3次,
    以β-actin为内参,做HEMGN蛋白条带吸光度定量分析,表达量以HEMGN蛋白/β-actin吸光度
    的比值代表。

    结果如图2所示,与正常人相比,哮喘患者中HEMGN的蛋白水平显著升高,差异具有
    统计学意义(P<0.05)。

    上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本
    领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进
    和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的?;し段?。

    SEQUENCE LISTING

    <110> 常州市第二人民医院

    <120> 一种用于诊断哮喘的分子标志物

    <160> 6

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 1455

    <212> DNA

    <213> 人源

    <400> 1

    atggatttgg gaaaggacca atctcatttg aagcaccatc agacacctga ccctcatcaa 60

    gaagagaacc attctccaga agtcattgga acctggagtt tgagaaacag agaactactt 120

    agaaaaagaa aagctgaagt gcatgaaaag gaaacatcac aatggctatt tggagaacag 180

    aaaaaacgca agcagcagag aacaggaaaa ggaaatcgaa gaggcagaaa gagacaacaa 240

    aacacagaat tgaaggtgga gcctcagcca cagatagaaa aggaaatagt ggagaaagca 300

    ctggcaccta tagagaaaaa aactgagcca cctgggagca taaccaaagt atttccttca 360

    gtagcctccc cgcaaaaagt tgtgcctgag gaacactttt ctgaaatatg tcaagaaagt 420

    aacatatatc aggagaattt ttctgagtac caagaaatag cagtacaaaa ccattcttct 480

    gaaacatgcc aacatgtgtc tgaacctgaa gacctctctc ctaaaatgta ccaagaaata 540

    tctgtacttc aagacaattc ttccaaaata tgccaagaca tgaaggaacc tgaagacaac 600

    tctcctaaca catgccaagt aatatctgta attcaagacc atcctttcaa aatgtaccaa 660

    gatatggcta aacgagaaga tctggctcct aaaatgtgcc aagaagctgc tgtacccaaa 720

    atccttcctt gtccaacatc tgaagacaca gctgatctgg caggatgctc tcttcaagca 780

    tatccaaaac cagatgtgcc taaaggctat attcttgaca cagaccaaaa tccagcagaa 840

    ccagaggaat acaatgaaac agatcaagga atagctgaga cagaaggcct ttttcctaaa 900

    atacaagaaa tagctgagcc taaagacctt tctacaaaaa cacaccaaga atcagctgaa 960

    cctaaatacc ttcctcataa aacatgtaac gaaattattg tgcctaaagc cccctctcat 1020

    aaaacaatcc aagaaacacc tcattctgaa gactattcaa ttgaaataaa ccaagaaact 1080

    cctgggtctg aaaaatattc acctgaaacg tatcaagaaa tacctgggct tgaagaatat 1140

    tcacctgaaa tataccaaga aacatcccag cttgaagaat attcacctga aatataccaa 1200

    gaaacaccgg ggcctgaaga cctctctact gagacatata aaaataagga tgtgcctaaa 1260

    gaatgctttc cagaaccaca ccaagaaaca ggtgggcccc aaggccagga tcctaaagca 1320

    caccaggaag atgctaaaga tgcttatact tttcctcaag aaatgaaaga aaaacccaaa 1380

    gaagagccag gaataccagc aattctgaat gagagtcatc cagaaaatga tgtctatagt 1440

    tatgttttgt tttaa 1455

    <210> 2

    <211> 484

    <212> PRT

    <213> 人源

    <400> 2

    Met Asp Leu Gly Lys Asp Gln Ser His Leu Lys His His Gln Thr Pro

    1 5 10 15

    Asp Pro His Gln Glu Glu Asn His Ser Pro Glu Val Ile Gly Thr Trp

    20 25 30

    Ser Leu Arg Asn Arg Glu Leu Leu Arg Lys Arg Lys Ala Glu Val His

    35 40 45

    Glu Lys Glu Thr Ser Gln Trp Leu Phe Gly Glu Gln Lys Lys Arg Lys

    50 55 60

    Gln Gln Arg Thr Gly Lys Gly Asn Arg Arg Gly Arg Lys Arg Gln Gln

    65 70 75 80

    Asn Thr Glu Leu Lys Val Glu Pro Gln Pro Gln Ile Glu Lys Glu Ile

    85 90 95

    Val Glu Lys Ala Leu Ala Pro Ile Glu Lys Lys Thr Glu Pro Pro Gly

    100 105 110

    Ser Ile Thr Lys Val Phe Pro Ser Val Ala Ser Pro Gln Lys Val Val

    115 120 125

    Pro Glu Glu His Phe Ser Glu Ile Cys Gln Glu Ser Asn Ile Tyr Gln

    130 135 140

    Glu Asn Phe Ser Glu Tyr Gln Glu Ile Ala Val Gln Asn His Ser Ser

    145 150 155 160

    Glu Thr Cys Gln His Val Ser Glu Pro Glu Asp Leu Ser Pro Lys Met

    165 170 175

    Tyr Gln Glu Ile Ser Val Leu Gln Asp Asn Ser Ser Lys Ile Cys Gln

    180 185 190

    Asp Met Lys Glu Pro Glu Asp Asn Ser Pro Asn Thr Cys Gln Val Ile

    195 200 205

    Ser Val Ile Gln Asp His Pro Phe Lys Met Tyr Gln Asp Met Ala Lys

    210 215 220

    Arg Glu Asp Leu Ala Pro Lys Met Cys Gln Glu Ala Ala Val Pro Lys

    225 230 235 240

    Ile Leu Pro Cys Pro Thr Ser Glu Asp Thr Ala Asp Leu Ala Gly Cys

    245 250 255

    Ser Leu Gln Ala Tyr Pro Lys Pro Asp Val Pro Lys Gly Tyr Ile Leu

    260 265 270

    Asp Thr Asp Gln Asn Pro Ala Glu Pro Glu Glu Tyr Asn Glu Thr Asp

    275 280 285

    Gln Gly Ile Ala Glu Thr Glu Gly Leu Phe Pro Lys Ile Gln Glu Ile

    290 295 300

    Ala Glu Pro Lys Asp Leu Ser Thr Lys Thr His Gln Glu Ser Ala Glu

    305 310 315 320

    Pro Lys Tyr Leu Pro His Lys Thr Cys Asn Glu Ile Ile Val Pro Lys

    325 330 335

    Ala Pro Ser His Lys Thr Ile Gln Glu Thr Pro His Ser Glu Asp Tyr

    340 345 350

    Ser Ile Glu Ile Asn Gln Glu Thr Pro Gly Ser Glu Lys Tyr Ser Pro

    355 360 365

    Glu Thr Tyr Gln Glu Ile Pro Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Pro Glu Ile

    370 375 380

    Tyr Gln Glu Thr Ser Gln Leu Glu Glu Tyr Ser Pro Glu Ile Tyr Gln

    385 390 395 400

    Glu Thr Pro Gly Pro Glu Asp Leu Ser Thr Glu Thr Tyr Lys Asn Lys

    405 410 415

    Asp Val Pro Lys Glu Cys Phe Pro Glu Pro His Gln Glu Thr Gly Gly

    420 425 430

    Pro Gln Gly Gln Asp Pro Lys Ala His Gln Glu Asp Ala Lys Asp Ala

    435 440 445

    Tyr Thr Phe Pro Gln Glu Met Lys Glu Lys Pro Lys Glu Glu Pro Gly

    450 455 460

    Ile Pro Ala Ile Leu Asn Glu Ser His Pro Glu Asn Asp Val Tyr Ser

    465 470 475 480

    Tyr Val Leu Phe

    <210> 3

    <211> 18

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 3

    atgtgtctga acctgaag 18

    <210> 4

    <211> 19

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 4

    atgtgttagg agagttgtc 19

    <210> 5

    <211> 21

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 5

    ctctggtaaa gtggatattg t 21

    <210> 6

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 6

    ggtggaatca tattggaaca 20

    关 键 词:
    一种 用于 诊断 哮喘 分子 标志
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