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    重庆时时彩即开奖: HSP27在舌癌化疗耐受诊治中的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611199169.X

    申请日:

    2016.12.22

    公开号:

    CN106636296A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/02申请日:20161222|||公开
    IPC分类号: C12Q1/02; G01N33/68; G01N33/574 主分类号: C12Q1/02
    申请人: 广州医科大学附属肿瘤医院
    发明人: 郑国沛; 贺智敏; 张志杰; 贾小婷; 彭聪; 罗凯
    地址: 510095 广东省广州市越秀区横枝岗路78号
    优先权:
    专利代理机构: 北京联瑞联丰知识产权代理事务所(普通合伙) 11411 代理人: 陈剑聪
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611199169.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,首次证实了化疗药物处理能上调舌癌细胞培养上清中Hsp27蛋白水平和舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平,且Hsp27在舌癌化疗耐受细胞中表达高于敏感细胞;干扰下调Hsp27表达增加耐药细胞的化疗敏感性,而过表达Hsp27则增加舌癌细胞的化疗耐受性等。本发明不仅为舌癌化疗耐受机制研究提供新的资料,而且为舌癌化疗敏感性预测提供新的检测标志物,以及为开发基于Hsp27为靶点的新治疗策略提供理论依据。

    权利要求书

    1.一种Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,化疗能诱导舌癌细胞和患者
    血清中Hsp27升高。
    2.根据权利要求1所述的Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,Hsp27能增
    加舌癌细胞化疗的耐受性。
    3.根据权利要求1所述的Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,细胞外
    Hsp27能活化舌癌细胞中NF-κB信号。
    4.根据权利要求1所述的Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,细胞外
    Hsp27通过与TLR5结合激活NF-κB信号。
    5.根据权利要求1所述的Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,细胞内
    Hsp27能抑制BAX和BIM功能抑制化疗诱导的凋亡信号。
    6.根据权利要求1所述的Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,其特征在于,Hsp27与舌
    癌患者预后呈负相关。

    说明书

    Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用

    技术领域

    本发明属于生物技术或医学领域,更具体的,本发明涉及Hsp27在舌癌化疗耐受诊
    治中的应用。

    背景技术

    热休克蛋白是一组在进化上高度保守的蛋白质,除高热外,缺血、组织损伤、病毒
    或细菌感染等也会产生,其在许多领域证实能发挥各种重要功能。以往人们对于热休克蛋
    白27(Heat shock protein 27,Hsp27)的研究主要集中在Hsp27抗凋亡、抗氧自由基等方面
    的作用(Small heat shock proteins and protection against injury.Ann N Y Acad
    Sci.199930;874:66-8.Review);目前还没有发现对Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用有
    了解和深入的研究。

    发明内容

    有鉴于此,本发明对Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用进行了深入的研究,不仅
    可以为舌癌化疗耐受机制研究提供新的资料,而且为舌癌化疗敏感性预测提供新的检测标
    志物,以及为开发基于Hsp27为靶点的新治疗策略提供理论依据。

    一种Hsp27在舌癌化疗耐受诊治中的应用,在此应用中,化疗能诱导舌癌细胞和患
    者血清中Hsp27升高。

    进一步地,Hsp27能增加舌癌细胞化疗的耐受性。

    进一步地,细胞外Hsp27能活化舌癌细胞中NF-κB信号。

    进一步地,细胞外Hsp27通过与TLR5结合激活NF-κB信号。

    进一步地,细胞内Hsp27能抑制BAX和BIM功能抑制化疗诱导的凋亡信号。

    进一步地,Hsp27与舌癌患者预后呈负相关。

    本发明的有益效果在于:

    本发明首次证实了化疗药物处理能上调舌癌细胞培养上清中Hsp27蛋白水平和舌
    癌患者血清中Hsp27蛋白水平,且Hsp27在舌癌化疗耐受细胞中表达高于敏感细胞;干扰下
    调Hsp27表达增加耐药细胞的化疗敏感性,而过表达Hsp27则增加舌癌细胞的化疗耐受性;
    在机制上,细胞外Hsp27可通过TLR5活化NF-κB信号介导化疗耐受,细胞内Hsp27抑制BAX和
    BIM功能抑制化疗诱导的凋亡信号,同时发现舌癌组织中Hsp27高表达与舌癌患者预后呈负
    相关。从而本发明不仅为舌癌化疗耐受机制研究提供新的资料,而且为舌癌化疗敏感性预
    测提供新的检测标志物,以及为开发基于Hsp27为靶点的新治疗策略提供理论依据。

    附图说明

    图1A-图1B为实施例1的实验结果图;

    图2A-图2C为实施例2的实验结果图;

    图3A-图3B为实施例3的实验结果图;

    图4A-图4D为实施例4的实验结果图;

    图5A-图5E为实施例5的实验结果图;

    图6A-图6C为实施例6的实验结果图;

    图7A-图7C为实施例7的实验结果图。

    具体实施方式

    下面将结合附图,对本发明进行清楚、完整地描述。

    实施例1:化疗能诱导舌癌细胞和患者血清中Hsp27升高

    结果显示,耐药细胞Tca8113/PYM中Hsp27蛋白水平明显高于正??谇徽衬は赴?br />Hacat和Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27等化疗相对较敏感的舌癌细胞(图1A),同
    时耐药细胞培养液中Hsp27蛋白水平亦明显高于Hacat、Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及
    CAL-27细胞培养液(图1A);我们分别用PYM(80mg/L)和cDDP(5mg/L)处理上述细胞,发现化
    疗均能不同程度的诱导各细胞中和细胞培养液中Hsp27蛋白水平升高(图1A);此外,我们检
    测了30例正常健康人和50例舌癌患者血清中Hsp27的蛋白水平,50例舌癌患者血清包括28
    例首诊患者血清和22例经过以PYM和/或cDDP化疗前后的患者血清,发现舌癌患者血清中
    Hsp27蛋白水平明显高于正常健康患者血清,同一舌癌患者中化疗后血清中的Hsp27蛋白水
    平明显高于化疗前(图1B),提示化疗本身可能上调舌癌细胞中的Hsp27表达。

    实施例2:Hsp27增加舌癌细胞化疗耐受性的体外实验

    为了观察Hsp27在舌癌化疗耐受中的作用,我们通过shRNA技术沉默Tca8113/PYM
    细胞中Hsp27表达,其中sh-1#和sh-2#干扰效果最明显(图2A),故我们选取sh-1#和sh-2#进
    行后续实验,建立Hsp27稳定低表达细胞系Tca8113/PYM-sh-1#和Tca8113/PYM-sh-2#以及
    对照细胞系Tca8113/PYM-sh-con,用MTS实验检测药物敏感性,发现干扰Hsp27表达后,
    Tca8113/PYM细胞对PYM和cDDP的敏感性增加(图2A);同时,为了观察分泌的Hsp27是否参与
    舌癌细胞的化疗耐受,用Hsp27中和抗体处理Tca8113/PYM细胞后,同样能增加化疗敏感性
    (图2A)。反之,通过转染pLEX-Hsp27载体在Tca8113和SCC-25细胞中建立Hsp27稳定过表达
    细胞系以及相应对照细胞系,发现过表达Hsp27后,Tca8113(图2B)和SCC-25(图2C)细胞对
    化疗的敏感性降低;同时,用重组的人Hsp27蛋白(rhHsp27)处理亦能增加Tca8113(图2B)和
    SCC-25(图2C)细胞的化疗耐受性。

    实施例3:Hsp27增加舌癌细胞化疗耐受性的体内实验

    上述体外细胞水平实验表明Hsp27能参与舌癌细胞的化疗耐受,在此,我们在裸鼠
    体内实验进一步验证Hsp27在舌癌化疗中的作用,将Tca8113/pLEX-con和Tca8113/pLEX-
    Hsp27细胞接种于裸鼠前腋下成瘤后,接种后第15天开始,分别给予腹腔注射等量生理盐水
    (0.2ml)、PYM(30mg/kg)和cDDP(3mg/kg),每3天1次,共处理10次,每3天测量一次肿瘤的长
    径及宽径而计算出肿瘤体积,并绘制成肿瘤生长曲线,实验结束后断颈处死裸鼠,剥离肿
    瘤,测量末次体积并称重。结果显示过表达Hsp27能增加Tca8113细胞的体内化疗耐受性,在
    化疗条件下,Hsp27过表达组的肿瘤体积大于对照组(图3A),瘤重重于对照组(图3B)。

    实施例4:细胞外Hsp27活化舌癌细胞中NF-κB信号

    通过NF-κB活性的报告基因实验和WB检测相关蛋白水平发现耐药细胞Tca81113/
    PYM中NF-κB活性高于Hacat、Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27细胞,同时,Tca8113/
    PYM的核p65蛋白水平高于其他细胞,且Tca8113/PYM中NF-κB经典靶基因Survivin和IL-6的
    mRNA和蛋白水平高于基他细胞(图4A,p<0.0001),提示耐药细胞Tca8113/PYM细胞中NF-κB
    信号通路活化。再者,发现Tca8113/PYM细胞中p-IκBα水平高于其他细胞,而总IκBα蛋白水
    平则低于其他细胞(图4A);干扰沉默Hsp27表达和用Hsp27中和抗体处理均能下调Tca8113/
    PYM细胞中NF-κB活性和核p65蛋白水平,同时下调NF-κB靶基因Survivin和IL6表达(图4B,p
    <0.0001);而过表达Hsp27和用rhHsp27处理则能上调Tca8113和SCC-25细胞的NF-κB活性和
    p65的核蛋白水平,以及Survivin和IL6表达水平(图4C,p<0.0001)。再者,在舌癌组织中
    Hsp27蛋白水平与p65核移位水平呈正相关,而与IκBα蛋白水平呈负相关(图4C,图4D)。为了
    观察细胞外Hsp27是否通过活化NF-κB信号而在舌癌细胞中发挥功能,我们采用转染IκBα显
    性负突变载体(pBabe-IκBα)或使用NF-κB抑制剂BAY11-7082(通过抑制IκBα磷酸化而抑制
    NF-κB信号)处理Tca8113和SCC-25细胞后,再用rhHsp27处理,发现转染pBabe-IκBα和使用
    BAY11-7082处理均能明显逆转rhHsp27诱导舌癌细胞中NF-κB活化(图4D,p<0.0001)。这些
    实验结果提示分泌的Hsp27能通过下调IκBα而活化舌癌细胞中NF-κB信号。

    实施例5:细胞外Hsp27通过与TLR5结合激活NF-κB信号

    经检测发现舌癌细胞中TLR5蛋白水平高于正??谇徽衬ど掀は赴?图5A);采用
    sh-RNA技术干扰下调Tca8113/PYM细胞中TLR5表达,其中sh-3#和sh-4#干扰效果较好,选取
    sh-3#和sh-4#用于进一步实验(图5B);Tca8113/PYM细胞中,干扰TLR5表达后,NF-κB活性、
    核p65蛋白水平和IκBα磷酸化水平降低,而总IκBα水平升高,作为NF-KB靶基因Survivin和
    IL6的mRNA表达水平降低(图5C,p<0.0001);干扰Tca8113和SCC-25细胞中TLR5表达后,再用
    rhHsp27处理,发现干扰沉默TLR5表达能逆转rhHsp27诱导的IκBα磷酸化和总IκBα蛋白水平
    降低、NF-κB活性和核p65蛋白水平升高、以及Survivin和IL-6表达升高(图5D,p<0.0001);
    进而,我们采用免疫共沉淀实验观察Hsp27是否可以直接与TLR5相互作用,用rhHsp27
    (10ug/ml)处理Tca8113和SCC-25细胞1h后,抽提细胞总蛋白,先用Hsp27抗体沉淀蛋白后,
    用TLR5抗体行western blot实验发现Hsp27能与TLR5结合,同样地,用TLR5抗体沉淀蛋白
    后,用Hsp27抗体行westernblot实验发现TLR5能与Hsp27结合(图5E)。这些实验结果提示外
    源性的Hsp27能与TLR5结合,从而在活化舌癌细胞中NF-κB信号。

    实施例6:细胞内Hsp27抑制BAX和BIM功能抑制化疗诱导的凋亡信号

    为了观察Hsp27在化疗诱导凋亡中的作用,首先检测了Hsp27表达干预条件下化疗
    对凋亡相关分子表达和活性的影响,发现无论Hsp27表达干预与否,即使在Tca8113/PYM耐
    药细胞中,化疗能诱导舌癌细胞中BAX、BAD和BIM的表达、线粒体上BAX、BAD和BIM水平的增
    加、以及细胞质中cytochromeC(Cyto C)水平的升高(图6A-图6C);但过表达Hsp27明显抑制
    Tca8113和SCC-25细胞中化疗诱导线粒体上BAX和BIM水平的升高,同时抑制化疗诱导细胞
    质中Cyto C水平的升高(图6A);在Tca8113/PYM细胞中,干扰Hsp27表达则增加化疗诱导线
    粒体上BAX和BIM水平的升高,同时增加化疗诱导细胞质中Cyto C水平的升高(图6B);为了
    观察Hsp27是否通过结合BAX和BIM从而抑制化疗诱导凋亡条件下BAX和BIM向线粒体移位,
    通过免疫共沉淀实验发现在Tca8113和SCC-25细胞中,Hsp27能与BAX和BIM结合,且其结合
    水平在化疗条件下随着Hsp27表达增加而增加(图6C)。这些结果提示胞内Hsp27可能通过与
    BAX和BIM结合而抑制化疗条件下其向线粒体移位,从而抑制线粒体释放Cyto发明C而诱导
    细胞凋亡。

    实施例7:Hsp27与舌癌患者预后呈负相关

    我们在84例来源于广州医科大学附属肿瘤医院(患者具有预后随访资料)的经有
    PYM和/或cDDP化疗的舌癌组织中用免疫组化方法检测Hsp27及其相关分子的蛋白表达。发
    现有48舌癌组织例呈现Hsp27高表达,36例舌癌组织呈现Hsp27低表达(图7A)。免疫组化显
    示TLR5在舌癌组织中普遍呈现高丰度表达状态(图7A)。无论Hsp27表达丰度的高低,化疗均
    能诱导舌癌组织细胞中BAX和BIM的表达,并发现Hsp27高表达与p65核移位呈正相关,而与I
    κBα蛋白水平和Caspase3活化呈负相关(图7A和图7B)。且根据Hsp27蛋白水平进行预后分析
    发现Hsp27高表达的舌癌患者预后较差(图7C)。

    上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明,
    它们并非用以限制本发明的?;し段?,凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更
    均应包含在本发明的?;し段е?。

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    HSP27 舌癌 化疗 耐受 诊治 中的 应用
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