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    重庆时时彩定位胆技巧稳赚: 一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610967801.4

    申请日:

    2016.11.01

    公开号:

    CN106636006A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20161101|||公开
    IPC分类号: C12N5/20; C07K16/16; G01N33/94; G01N33/577 主分类号: C12N5/20
    申请人: 江南大学
    发明人: 胥传来; 姚蕾珺; 匡华; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 吴晓玲; 宋珊珊; 胡拥明
    地址: 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院
    优先权:
    专利代理机构: 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 代理人: 时旭丹;张仕婷
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610967801.4

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用,属于食品安全免疫检测领域。本发明罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC??No.12031。所述罂粟碱单克隆抗体由所述保藏编号为CGMCC??No.12031的罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3分泌产生。此细胞株分泌的单克隆抗体,对罂粟碱具有较好的特异性和检测灵敏度,为食品中罂粟碱残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。

    权利要求书

    1.一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员
    会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.12031。
    2.罂粟碱单克隆抗体,其特征在于:它由所述保藏编号为CGMCC No.12031的罂粟碱单
    克隆抗体杂交瘤细胞株YH3分泌产生。
    3.权利要求2所述罂粟碱单克隆抗体的应用,其特征在于:用于食品安全检测中罂粟碱
    残留的分析检测。

    说明书

    一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用

    技术领域

    本发明涉及一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3及其应用,属于食品安全免
    疫检测领域。

    背景技术

    罂粟碱是罂粟壳的主要成分之一。罂粟壳是罂粟的干燥成熟果壳,具有药用价值,
    但久服易成瘾,对人体的肝脏、心脏、神经系统具有毒害作用。由于其易成瘾性,有些不法商
    贩将其加入到食品中,例如火锅底料、方便面调料等,以达到吸引顾客、牟取暴利的目的。为
    此,国家药品监督管理局将罂粟碱列入麻醉药品管制品种,通过检测罂粟壳中含有的吗啡
    和罂粟碱等主要成分以实现对罂粟壳使用情况的监督。

    为了有效监督监测食品中使用罂粟壳情况,需要寻找一种特异性好、灵敏度高的
    测定方法,而目前检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等,分离纯化过程冗长,
    灵敏度低,加上食品中干扰物多,难以获得准确结果。因此建立快速简便的罂粟碱检测方法
    具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法,检测时对样本
    的纯度要求不高而且操作简便,适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测
    方法,筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。

    发明内容

    本发明的目的是提供一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3,由该细胞株制备
    的抗体对罂粟碱具有较好特异性和检测灵敏度,可以用来建立罂粟碱的免疫学检测方法。

    本发明的技术方案,一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3,已保藏于中国微生
    物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.12031。

    所述罂粟碱单克隆抗体,由所述保藏编号为CGMCC No.12031的罂粟碱单克隆抗体
    杂交瘤细胞株YH3分泌产生。

    所述罂粟碱单克隆抗体的应用,用于食品安全检测中罂粟碱残留的分析检测。

    本发明提供的罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3的制备基本步骤为:

    (1)半抗原的合成:


    将化合物1(2g,5.89mmol)溶解在48%溴化氢(10mL)中,55℃下搅拌过夜,向溶液中加
    入水并用乙酸乙酯萃取,将有机层用盐水洗涤,用硫酸钠干燥并浓缩,得到粗产物。通过制
    备型高效液相色谱纯化粗产物,得到化合物2(700mg,36.6%)。

    将化合物2(700mg,2.15mmol)溶解在乙腈(10mL)和2-溴乙酸乙酯(536mg,
    3.23mmol)的溶液中,加入碳酸钾(595mg,4.31mmol),并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入
    水并用乙酸乙酯萃取,将有机层用盐水洗涤,用硫酸钠干燥并浓缩,得到粗产物。 通过制备
    型高效液相色谱纯化粗产物,得到化合物3(100mg,11.3%)

    将化合物3(100mg,0.24mmol)溶解在四氢呋喃(3mL)和水(2mL)中,加入氢氧化锂
    (25.5mg,0.61mmol),并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤,用
    硫酸钠干燥并浓缩,得到粗产物,将其通过制备型高效液相色谱纯化,得到半抗原PAPA
    (30mg,32.3%);

    (2)完全抗原PAPA-KLH的制备:称取4mg PAPA,1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
    盐酸盐(EDC)7mg,N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)4mg,用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解
    (称为A液),室温搅拌反应8h。取匙孔血蓝蛋白KLH 1mL(6.8mg/mL),加入等体积硼酸缓冲溶
    液(称为B液),在室温条件,逐滴将A液加入到B液中,室温反应过夜,即得偶联物PAPA-KLH混
    合液,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原,并通过紫外吸收扫描方法鉴定;

    (3)小鼠的免疫:PAPA-KLH完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,通过背部皮下注射免
    疫BALB/c小鼠。首次免疫用罂粟碱完全抗原与等量完全弗氏佐剂,多次加强免疫用不完全
    弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月,多次加强免疫之间间隔21天。最后
    一次用PAPA-KLH完全抗原(不含佐剂)冲击免疫;通过间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测
    血清效价和抑制;

    (4)细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细
    胞融合,通过HAT培养基培养,利用间接竞争酶联免疫法(ic-ELISA)检测阳性细胞孔,并进
    一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果,通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞
    孔进行三次亚克隆,最终筛选获得罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3;

    (5)杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。

    取高效价低IC50小鼠的脾细胞,通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合,经过间接竞
    争酶联免疫法筛选和三次亚克隆,得到一株杂交瘤细胞株。

    本发明的有益效果:本发明提供的细胞株YH3分泌的单克隆抗体,对罂粟碱具有较
    好的特异性和检测灵敏度(IC50值为0.1ng/mL),可实现对水、果蔬、谷物中罂粟碱残留量的
    检测,为食品中罂粟碱残留的免疫检测提供了原料,具有实际应用价值。

    生物材料样品保藏:一株罂粟碱单克隆抗体杂交瘤细胞株YH3,已保藏于中国微生
    物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院
    3号,中国科学院微生物研究所,保藏日期2016年1月20日,保藏编号为CGMCC No. 12031,分
    类命名为单克隆细胞株。

    附图说明

    图1是YH3单克隆抗体对罂粟碱的抑制标准曲线。

    具体实施方式

    本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明,不能作为本发明的限定内
    容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

    本发明通过将罂粟碱完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养,
    通过ic-ELISA筛选细胞上清,最终得到了对罂粟碱有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂
    交瘤细胞株。

    实施例1 杂交瘤细胞株YH3的制备

    (1)半抗原的合成:将化合物1(2g,5.89mmol)溶解在48%溴化氢(10mL)中,55℃下搅拌
    过夜,向溶液中加入水并用乙酸乙酯萃取,将有机层用盐水洗涤,用硫酸钠干燥并浓缩,得
    到粗产物。通过制备型高效液相色谱纯化粗产物,得到化合物2(700mg,36.6%)。

    将化合物2(700mg,2.15mmol)溶解在乙腈(10mL)和2-溴乙酸乙酯(536mg,
    3.23mmol)的溶液中,加入碳酸钾(595mg,4.31mmol),并在室温下搅拌过夜。向溶液中加入
    水并用乙酸乙酯萃取,将有机层用盐水洗涤,用硫酸钠干燥并浓缩,得到粗产物。 通过制备
    型高效液相色谱纯化粗产物,得到化合物3(100mg,11.3%)。

    将化合物3(100mg,0.24mmol)溶解在四氢呋喃(3mL)和水(2mL)中,加入氢氧化锂
    (25.5mg,0.61mmol),并在室温下搅拌2h。反应溶液用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤,用
    硫酸钠干燥并浓缩,得到粗产物,将其通过制备型高效液相色谱纯化,得到半抗原PAPA
    (30mg,32.3%)。

    (2)完全抗原的合成:称取4mg PAPA,EDC 7mg,NHS 4mg,用300μL无水DMF溶解(称
    为A液),室温搅拌反应8h。取KLH 1mL(6.8 mg/mL),加入等体积BB溶液(称为B液),在室温条
    件,逐滴将A液加入到B液中,室温反应过夜,即得偶联物PAPA-KLH混合液,通过透析分离完
    全抗原和未偶联的小分子半抗原,并通过紫外吸收扫描方法鉴定。

    (3)动物免疫:选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取罂粟碱完全抗原与
    等量弗氏佐剂混合乳化后,通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐
    剂,之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月,多次加强免疫
    之间间隔21天。第三次免疫后7天采血,使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制,选择效价
    高抑制好的小鼠,在第五次免疫后21天冲击免疫,腹腔注射,要求冲免剂量减半且不含任何
    佐剂。

    (4)细胞融合:在冲击免疫三天后,按照常规PEG(聚乙二醇,分子量为4000)方法进
    行细胞融合,具体步骤如下:

    a、摘眼球取血,颈椎脱臼法处死小鼠后,立即放入 75% 酒精中消毒,浸泡 5 min左右,
    无菌操作取出小鼠的脾脏,用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬
    液,收集,离心(1200rpm,8 min),用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次,最后一次离心后,将
    脾细胞稀释到一定体积,计数,备用;

    b、收集SP2/0细胞: 融合前 7-10 天,将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS(胎牛血清)RPMI-
    1640 培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 1~ 4×107,保证融合前
    SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时,收集瘤细胞,悬浮于RPMI-1640基础培养液中,进行
    细胞计数;

    c、融合过程7min。第1min,将1mL的PEG 1500 由慢到快滴加到细胞中;第2min,静置;第
    3min 和第4min,在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基;第5min 和第6min,在1min内滴加2mL
    RPMI-1640 培养基;第7min,每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5 min。
    离心(800 rpm,8 min),弃上清,重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养
    液中,按照200μL/孔加到 96 孔细胞板,置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

    (5)细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选
    培养液半换液,第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全
    换液,在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步:第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔,
    第二步选用罂粟碱为标准品,用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对罂粟碱标
    准品均有较好抑制的细胞孔,采用有限稀释法进行亚克隆,用同样的方法进行检测。重复三
    次,获得细胞株YH3。

    (6)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射无菌石
    蜡油1mL;7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞,从第七天开始收集腹水,将腹水通过
    辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下,正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂
    蛋白,然后离心,弃沉淀;再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体,离心,弃
    上清,用0.01 M PBS溶液(pH7.4)溶解后,透析脱盐,最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20
    ℃保存。

    6.1包被:将包被原PAPA-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀
    释,100μL/孔,37℃反应2h;

    6.2洗涤:将板内溶液倾去,并用洗涤液洗涤3次,每次3min;

    6.3封闭:拍干后,加入200μL /孔封闭液,37℃反应2h;洗涤后烘干备用;

    6.4加样:将抗血清从1:1000开始倍比稀释,并加入到各稀释度的包被孔中,100μL /
    孔,37℃反应30min;充分洗涤后,加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG,100μL/孔,37℃反应
    30min;

    6.5显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100μL的TMB显色液,37℃避光反应
    15min;

    6.6终止和测定:每孔加入50μL终止液以终止反应,然后用酶标仪测定各孔的OD 450
    值。

    用ic-ELISA测定单克隆抗体罂粟碱的IC50为0.1 ng/mL,说明对罂粟碱有很好的灵
    敏度,可用于罂粟碱免疫分析检测。

    溶液的配置:碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59 g,NaHCO3 2.93 g,分别溶于
    少量双蒸水后混合,加双蒸水至约800mL混匀,调pH值至9.6,加双蒸水定容至1000mL,4℃贮
    存备用;

    磷酸盐缓冲液(PBS):8.00g NaCl,0.2g KCl,0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12 H2O,溶
    于800mL纯水中,用NaOH或HCl调pH到7.2~7.4,定容至1000mL;

    PBST:含0.05 % 吐温 20的PBS;

    TMB显色液:A液:Na2HPO4.12H2O 18.43g,柠檬酸 9.33g,纯水定容至1000mL;B液:60mg
    TMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液,现用现混。

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    罂粟碱 单克隆抗体 杂交瘤 细胞株 YH3 及其 应用
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