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    重庆时时彩杀号走势图: 杂交瘤细胞株XA272919、抗体及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610888034.8

    申请日:

    2016.10.11

    公开号:

    CN106636005A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20161011|||公开
    IPC分类号: C12N5/20; C07K16/18; G01N33/68; G01N33/577; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C12N5/20
    申请人: 中国人民解放军第四军医大学
    发明人: 易蔚; 谭延振; 孙阳; 赵达君; 段维勋; 俞世强; 宋朝君; 金伯泉
    地址: 710032 陕西省西安市长乐西路169号
    优先权:
    专利代理机构: 西安恒泰知识产权代理事务所 61216 代理人: 史玫
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610888034.8

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及杂交瘤细胞株XA272??919、抗体及其应用。所涉及的杂交瘤细胞株,的保藏编号为CCTCC??NO:C2016111。所涉及的抗体为本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗体。所涉及的应用为本发明的抗体用于检测人CTRP9的应用以及本发明的抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。

    权利要求书

    1.杂交瘤细胞株,其特征在于,该杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO:C2016111。
    2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌产生的抗人CTRP9单克隆抗体。
    3.如权利要求2所述的抗体,其特征在于,该抗体的序列为:重链可变区如SEQ.ID.NO.1
    所示,轻链可变区如SEQ.ID.NO.2所示。
    4.权利要求2或3所述抗体用于检测人CTRP9的应用。
    5.权利要求2或3所述抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。
    6.一种人CTRP9检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括权利要求2或3所述抗体。
    7.权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:样品稀释液、底物稀释
    液、底物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。

    说明书

    杂交瘤细胞株XA272-919、抗体及其应用

    技术领域

    本发明涉及杂交瘤细胞株、抗体及其应用,具体涉及用于检测人CTRP9的杂交瘤细
    胞株、抗体及其应用。

    背景技术

    C1q and tumor necrosis factor related protein 9(CTRP9)是主要由脂肪细
    胞分泌的脂肪细胞因子,作用于肌肉和肝脏,调节全身葡萄糖和脂质代谢等。在肾脏、小肠、
    肺脏及成纤维细胞等器官、组织细胞中也有所表达。

    CTRP9由分泌信号肽、短N端可变区域、胶原区域及C端球状结构域构成,成熟蛋白
    不含其N端信号肽(19个氨基酸残基)。C端球状结构域与C1q结构类似,与脂联素高度相似,
    可以与其他蛋白或者受体相互作用,因此被认为是其功能结构域。

    CTRP9是具有诸多生理功能的新型脂肪因子,具有降低血糖、舒张血管及心肌?;?br />等诸多生理作用。骨骼肌细胞中,CTRP9可以长期激活AMPK通路,增加线粒体的含量和上调
    脂肪酸氧化相关基因的表达,从而降低了脂肪组织的形成。在股动脉损伤模型中,CTRP9过
    量表达可以激活cAMP/PKA/ERK通路,抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移,大幅度降低新生内
    膜的形成。人脐静脉内皮细胞和新分离血管环中,重组CTRP9蛋白可以通过AMPK/eNOS通路
    提高一氧化氮产量使血管扩张。同时,CTRP9具有显著的缺血心肌及血管?;ぷ饔?,尤其是
    在心肌及血管组织表达分泌量是脂联素的100倍以上,而心肌缺血损伤时其心肌分泌及血
    浆含量均显著降低,具有很高的特异性,CTRPs是潜在的肥胖相关心脏病病情评估的生物标
    记物及干预靶点,有望在治疗代谢综合征和心力衰竭等方面发挥重要作用。

    目前用于人CTRP9定量检测的方法只有ELISA法,较为可靠的产品只有BioVendor
    的产品,但是也存在偏差较高、价格昂贵、操作时间长、不利于大规模检测人CTRP9含量等缺
    点。

    发明内容

    针对现有技术的缺陷或不足,本发明提供了一种用于产生抗人CTRP9单克隆抗体
    的杂交瘤细胞株XA272-919,该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号:
    CCTCC NO:C2016111,地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏时间:2016年6月16日。

    本发明的杂交瘤细胞株产生的抗体的序列为:重链可变区:
    QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSS
    TAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS;CDR1序列:TYNIH;CDR2序列:
    AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT;CDR3序列:GGNAMDY;轻链可变区:
    DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
    TLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK;CDR1序列:KSSRTLLYSSNQKNYLA;CDR2序列:
    WASTRES;CDR3序列:LQYYSYVT。

    本发明杂交瘤细胞株分泌产生的抗人CTRP9单克隆抗体。

    本发明抗体用于检测人CTRP9的应用。

    本发明抗体用于制备人CTRP9检测试剂盒的应用。

    本发明还提供了人CTRP9检测试剂盒。所提供的人CTRP9检测试剂盒包括上述抗
    体。

    本发明的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:样品稀释液、底物稀释液、底
    物、洗涤液、标准品和非离子活性剂。

    附图说明

    图1为重组人CTRP9蛋白的电泳图,1、Marker;2、破碎上清;3、镍柱流穿液;4、500mM
    咪唑洗脱液;5、重组人CTRP9蛋白。

    具体实施方式

    以下通过实施例对本发明做进一步的阐述。实施例是对本发明进行详细说明,但
    本发明并不受这些的任何限定。

    以下实施例中使用的辣根过氧化物酶(HRP)购自上海生工生物工程技术服务有限
    公司;基因序列优化、合成克隆由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成;抗体测序由北京安
    必奇生物科技有限公司完成;Ni-NTA纯化柱购自GE公司;内毒素去除柱购自赛默飞世尔(中
    国)有限公司;DMEM高塘培养基、胎牛血清为Hycolon公司产品。

    实施例1:本发明杂交瘤细胞株的制备

    根据人CTRP9序列(GenBank ACCESSION NM_030945)开放阅读框序列,进行针对大
    肠杆菌偏好性进行密码子优化,人CTRP9全基因合成(序列为:ATGCAGGATACCTGCAGACAGGGTC
    ACCCAGGTATTCCAGGTAACCCTGGTCATAATGGTCTGCCAGGTAGAGATGGTCGTGATGGTGCCAAAGGTGACAAA
    GGTGATGCTGGAGAGCCAGGTAGACCAGGTTCACCTGGTAAGGATGGAACCTCTGGTGAGAAGGGAGAACGTGGTGC
    CGACGGTAAAGTGGAAGCCAAGGGTATCAAGGGTGACCAGGGTTCTCGTGGTTCTCCAGGTAAACACGGTCCTAAAG
    GTTTGGCCGGTCCTATGGGAGAAAAGGGTCTGAGAGGTGAGACTGGTCCACAGGGA CAGAAAGGTAACAAGGGTGA
    CGTTGGTCCTACTGGTCCTGAGGGTCCTCGTGGTAATATTGGTCCACTGGGTCCTACCGGTCTGCCAGGTCCAATGG
    GTCCAATTGGTAAGCCAGGTCCAAAGGGTGAAGCTGGTCCTACCGGACCACAGGGAGAACCAGGTGTGCGTGGTATT
    AGAGGTTGGAAGGGTGATCGTGGAGAGAAGGGTAAAATCGGTGAGACCCTGGTGCTGCCAAAATCTGCCTTTACCGT
    TGGTCTGACCGTGCTGTCTAAGTTTCCTTCTTCTGATATGCCAATTAAATTTGACAAAATTCTGTACAACGAGTTCA
    ACCATTATGACACTGCCGCCGGTAAGTTCACCTGCCATATCGCCGGTGTTTACTACTTTACCTATCATATTACCGTG
    TTCTCTCGTAACGTTCAGGTGTCTCTGGTGAAGAACGGTGTGAAGATCCTGCACACCAAGGACGCCTACATGTCTTC
    TGAGGACCAGGCTTCTGGTGGTATCGTGCTGCAGCTGAAACTGGGTGATGAGGTGTGGCTGCAGGTTACTGGTGGTG
    AACGTTTCAACGGTCTGTTTGCCGACGAAGATGACGACACCACCTTCACTGGATTCCTGCTGTTCTCATCTCCTTAA
    ),将合成的基因连接于pET30a(+),采用IPTG(终浓度1mM)进行25℃,200rpm过夜诱导表达,
    4000g离心收获菌体。超声破碎后,12000g离心取上清。上清经过镍柱亲和纯化,采用咪唑浓
    度梯度洗脱后,通过透析更换为PBS缓冲液,采用Millipore Utral-15浓缩,除去内毒素后,
    即为重组人CTRP9蛋白(参见图1)。

    选取6-8周龄Balb/C雌性小鼠,前述CTRP9蛋白作为抗原,为获得高亲和力抗体,采
    用小剂量(约1μg)、长时程,多次免疫的方法,选择免疫10天后,采用间接ELISA方法检测血
    清效价(包被抗原为酶切并纯化的蛋白),效价达到1∶5万以上准备融合。

    取经加强免疫的小鼠脾脏,研磨破碎,过滤洗涤之后,制成细胞悬液并计数;骨髓
    瘤SP2/0细胞生长至对数期,离心收集并洗涤,与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合,室温下采
    用PEG进行促融合,将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,置37℃,5%CO2,相对
    饱和湿度培养箱中培养。在融合24小时后,依次采用5×HAT选择培养液、1×HAT/HT选择培
    养液和1×HT培养液进行融合骨髓瘤细胞筛选。采用间接ELISA方法阳性克隆(包被抗原为
    酶切并纯化的蛋白)并进行连续克隆化。最终筛选得到能够稳定分泌抗CTRP9单克隆抗体的
    杂交瘤细胞株,分别命名为XA272-907和XA272-919,均保藏于中国典型培养物保藏中心,地
    址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏编号分别为:CCTCC NO:C2016110和CCTCC NO:
    C2016111。

    实施例2:人CTRP9单克隆抗体XA272-919的制备

    编号为CCTCC NO:C2016111的杂交瘤细胞以106个/只的量,腹腔注射预先致敏8-
    10周龄BABL/C雌性小鼠,7-10天后,采集小鼠腹水,用间接ELISA方法检测单抗的效价。

    腹水4℃、12000rpm离心15min,与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M,pH4.8)混合,逐滴
    加入正辛酸,室温搅拌30min,4℃静置其充分沉淀。

    离心后取上清过滤,加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.4),并用2M NaOH调
    节pH至7.4。

    采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀,离心后取沉淀,用含有0.2mM EDTA磷酸盐缓冲液溶
    解,并透析过夜。

    采用离子交换层析进行纯化,所用缓冲液:平衡缓冲液为20mM pH7.5的Tris-HCl
    缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液。NaCl浓度梯度洗脱结
    合的抗体蛋白,检测A280,收集洗脱的抗体蛋白。

    抗体的测序由北京安必奇生物科技有限公司完成,其步骤为:杂交瘤细胞采用
    RPMI 1640加20%血清培养24h,离心,弃去上清,采用TriZol重悬细胞,106个细胞/mL。提取
    DNA后,采用RT-PCR扩增重链和轻链基因,克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为:单克
    隆抗体XA272-919,抗体序列为:重链可变区:QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTTYNIHWVKQ
    TPGQGLEWIGAIYPGKGDTSYSPNFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGGNAMDYWGQGTSVTVSS
    ;CDR1序列:TYNIH;CDR2序列:AIYPGKGDTSYSPNFKGKAT;CDR3序列:GGNAMDY;轻链可变区:
    DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSRTLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDF
    TLTISSVKAEDLAVYYCLQYYSYVTFGAGTKLELK;CDR1序列:KSSRTLLYSSNQKNYLA;CDR2序列:
    WASTRES;CDR3序列:LQYYSYVT。

    实施例3:人CTRP9单克隆抗体XA272-907的制备

    保藏号为:CCTCC NO:C2016110(保藏地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学,保藏时
    间:2016年6月16日)杂交瘤细胞以106个/只的量,腹腔注射预先致敏8-10周龄BABL/C雌性
    小鼠,7-10天后,采集小鼠腹水,用间接ELISA方法检测单抗的效价。腹水4℃、12000rpm离心
    15min,与2倍体积的醋酸缓冲液(0.06M,pH4.8)混合,逐滴加入正辛酸,室温搅拌30min,4℃
    静置其充分沉淀。离心后取上清过滤,加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.1M,pH7.4),并用2M
    NaOH调节pH至7.4。采用硫酸铵沉淀将抗体沉淀,离心后取沉淀,用含有0.2mM EDTA磷酸盐
    缓冲液溶解,并透析过夜。采用离子交换层析进行纯化,所用缓冲液:平衡缓冲液为20mM
    pH7.5的Tris-HCl缓冲液、洗脱缓冲液为含1.0M NaCl的20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液。
    NaCl浓度梯度洗脱结合的抗体蛋白,检测A280,收集洗脱的抗体蛋白??固宓牟庑蛴杀本┌?br />必奇生物科技有限公司完成,其步骤大致为:杂交瘤细胞采用RPMI 1640加20%血清培养
    24h,离心,弃去上清,采用TriZol重悬细胞,106个细胞/mL。提取DNA后,采用RT-PCR扩增重
    链和轻链基因,克隆至T载体后进行DNA测序。该抗体命名为:抗体XA272-907,该抗体的序列
    为:重链可变区:


    DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSNFSWHWIRQFPGNKLEWMGYIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKN
    QFFLQLNSVTTEDTATYYCACFDYWGQGTSLTVSS;CDR1序列:NFSWH;CDR2序列:

    YIHYSGGTNYNPSLKSRIS;CDR3序列:FDY;轻链可变区:


    DVLMTQTPLSLPVILGAQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT
    LKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK;CDR1序列:RSSQTIVHSNGNTYLE;CDR2序列:
    KVSNRFS;CDR3序列:FQGSHVPFT。

    实施例4:人CTRP9ELISA试剂盒

    试剂盒组成:人CTRP9单克隆抗体XA272-919包被的酶标板,标准品(纯化的CTRP9
    蛋白,冻干粉),检测抗体:抗体XA272-907,酶标亲和素HRP-链霉素,样品稀释液,TMB酶底物
    显色液,洗涤液及反应终止液。TMB酶底物显色液:0.03%过硼酸钠,用之前10min加入TMB盐
    酸盐,终浓度0.01%;反应终止液:1mol/L硫酸溶液;样品稀释液:含0.1%BSA及0.1%
    Tween-20的PBS缓冲液;洗涤液:含有0.1%Tween-20的PBS缓冲液。

    (1)酶标板包被:

    (1.1)杂交瘤细胞株XA272-919所产生单克隆抗体XA272-919作包被用抗体,用
    50mM、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至2μg/mL加至96孔板,100μL/孔,4℃包被过夜;

    (1.2)洗涤:用300μL含0.1%吐温的磷酸盐缓冲液洗板3次,甩干;

    (1.3)干燥保存:存于加干燥剂的密封袋中,4℃保存备用。

    (2)检测抗体酶标

    辣根过氧化物酶(HRP)5mg/1mL加入0.2mL 0.1M过碘酸钠,室温下避光搅拌20min。
    将上述溶液对1mM pH4.4醋酸钠缓冲液4℃透析过夜。20μL 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节
    pH到9.0-9.5加入10mg抗体XA272-907(由杂交瘤细胞株XA272-907产生),室温避光轻轻搅
    拌2h。加0.1mL硼氢化钠溶液(4mg/mL),混匀静置2小时,4℃透析过夜。逐滴加入等体积饱和
    硫酸铵溶液4℃静置1小时,离心30min,弃去上清。沉淀物少量0.15M pH7.4的磷酸盐缓冲液
    并透析,上清即为酶标抗体XA272907-HRP

    (3)样品加入:将标准品(待测样本)加入包被孔内,室温振荡反应1h。

    (4)酶联反应:洗涤4次后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体XA272907-HRP
    100μl/孔,反应1h。

    (5)显色反应:洗涤4次后再加入底物液(含0.03%过硼酸钠和0.01%盐酸TMB)100
    μl,振荡显色10分钟。

    (6)终止反应:以1mol/L硫酸终止反应。

    (7)拟合曲线与读值:在酶标仪上读波长为405nm的OD值得出标准曲线和浓度。

    利用标准品测定本试剂盒相关指标:

    1.线性范围:该试剂盒检测CTRP9含量的线性范围为8.0pg/ml~15ng/ml。

    2.回收率:采用1ng/ml,10ng/ml,15ng/ml的CTRP9溶液(溶剂为样品稀释液),测的
    平均回收率为98.87%(n=9)。

    3.批内差异:平均为4%。

    4.批间差异:平均为8%。

    实施例5:用本发明试剂盒检测急性心肌梗死患者及正常对照组血清中CTRP9含量

    采用本发明所述试剂盒,检测50例正常人和50例急性心肌梗死患者血清中CTRP9
    含量,其结果如表1所示。

    表1血清中CTRP9的检测结果(x±s,ng/ml)

    血清中CTRP9含量
    正常组
    急性心肌梗死患者
    ng/mL
    7.04±1.56
    3.04±2.31


    P<0.001

    急性心肌梗死患者血清中CTRP9含量明显低于正常人,差异显著(p<0.01)。以上
    结果表明,利用本发明试剂盒能定量检测出体液标本中CTRP9的含量,对临床检测具有较高
    的敏感性和特异性,对诊断该病具有重要参考价值,为及早防治该病提供了一个有效途径。

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    杂交瘤 细胞株 XA272919 抗体 及其 应用
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