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    重庆时时彩后三组三预测技巧: 借助LSPRSELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列及其应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611004668.9

    申请日:

    2016.11.15

    公开号:

    CN106636104A

    公开日:

    2017.05.10

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/115申请日:20161115|||公开
    IPC分类号: C12N15/115(2010.01)I; G01N33/68 主分类号: C12N15/115
    申请人: 河南省农业科学院
    发明人: 邓瑞广; 王方雨; 郝俊芳; 邢广旭; 余秋颖; 胡骁飞; 腊贵晓; 郅玉宝; 王晶; 李会珍; 赵东; 史西保; 陈鑫鑫
    地址: 450002 河南省郑州市金水区花园路116号
    优先权:
    专利代理机构: 郑州市华翔专利代理事务所(普通合伙) 41122 代理人: 张爱军
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611004668.9

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.06|||2017.05.10

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于食品免疫检测领域,主要涉及局域表面等离子体共振技术筛选到一条特异结合SA的核酸适配体及其应用。所述的核酸适配体序列如SEQ??ID??NO.3所示。本发明借助LSPR??SELEX技术,经过两轮对靶标物的核酸适配体筛选,得到可特异结合SA靶标物的多克隆株。挑选其克隆株进行序列测定,其适配体序列的总长度为114bp;结合CE实验进行亲和力表征,结果证明,此序列可与SA靶标物有很好的结合。与传统的核酸适配体筛选方法相比,本发明创建的LSPR??SELEX传感技术操作简单、灵敏度高、耗时短(15min)、响应速度快,最大的优势在于相互作用数据实时在线的呈现,能快速准确地获悉每一轮分子间的亲和力。

    权利要求书

    1.借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列,其特征在于,
    所述的核酸适配体序列为:
    AACTGAACGGTGACTGATGGGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGC
    GCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAGATGACGACCGACTGACTTC。
    2.根据权利要求1所述的借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配
    体序列,其特征在于,所述的核酸适配体序列的结构为:

    3.根据权利要求1所述的借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配
    体序列,其特征在于,以所述的核酸适配体序列为核心,任何对该核酸适配体序列的延长和
    修饰,修饰材料包括但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。
    4.一种如权利要求1-3任一项所述的核酸适配体序列在SA的定量和定性检测中的应
    用。

    说明书

    借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列及其应用

    技术领域

    本发明属于食品免疫检测领域,主要涉及局域表面等离子体共振(Localized
    Surface Plasmon Resonance technology,LSPR)技术筛选到一条特异结合SA的核酸适配
    体及其应用。

    背景技术

    核酸适配体(Aptamer)是一类长度小于100nt的单链DNA或RNA序列,其是应用新型
    组合化学技术—指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by
    Exponential Enrichment,SELEX)体外从随机寡核苷酸文库中筛选得到能够与靶标物高灵
    敏和特异性地结合的适配体。当目标分子存在时,适配体通过自身特殊而稳定的三维折叠
    形成特异性的靶物质结合位点,这使得适配体可以区分出在结构上仅有细微差异的结构相
    似的物质。核酸适配体又称为“人工抗体”,其亲和力强、稳定性好、无免疫原性,而且易于修
    饰和标记,已被广泛用于检测、分离纯化和医疗三大领域。

    局域表面等离子体共振(LSPR)是一种全新的、高灵敏度的蛋白及分子互作分析方
    法。由于生物分子易在纳米颗粒表面沉积,通常将1~100nm的超细粒子—纳米金颗粒
    (AuNPs)作为LSPR传感层固定在金属薄膜表面。LSPR的纳米金传感器(1.5mm2)比传统SPR使
    用的持续金膜小,其在可见光范围内可产生很强的共振吸收峰,使得颗粒周围的局域折射
    率高度敏感,因此LSPR具有更短的响应时间和更高的检测灵敏度。LSPR不仅能用于无标记
    实时监测许多种类生物分子之间的反应,还可以准确、灵敏、快速地检测出各种生化指标。
    鉴于LSPR技术的一系列卓越性能,它可以广泛地应用到食品、环境和分子生物学等领域,将
    直接成为实时观测生物分子间相互作用的主导技术。

    发明内容

    本发明借助LSPR-SELEX技术,利用设计构建的寡核苷酸文库进行两轮筛选,最终
    得到可特异结合SA的适配体克隆株,挑选其克隆株进行序列测定,其适配体序列的总长度
    为114bp,并结合CE技术表征,结果证明LSPR-SELEX技术筛选的SBA与SA有良好的结合能力。
    借助本发明SBA序列,可用于对SA进行定量和定性的检测。

    为了实现上述目的,本发明所采用的技术方案是:

    借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列,所述的核酸
    适配体序列为:


    AACTGAACGGTGACTGATGGGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTC
    TTCCGCTTCCTCGCTCAGATGACGACCGACTGACTTC。

    所述的核酸适配体序列的结构见图2。

    所述的借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列,包括
    以所述的核酸适配体序列为核心,任何对该核酸适配体序列的延长和修饰,修饰材料包括
    但不局限于纳米材料、荧光材料、酶类、生物素及特定的蛋白质。

    一种所述的核酸适配体序列在SA的定量和定性检测中的应用。

    本发明的有益效果:

    (1)本发明借助LSPR-SELEX技术,经过两轮对靶标物的核酸适配体筛选,得到可特
    异结合SA靶标物的多克隆株。挑选其克隆株进行序列测定,其适配体序列的总长度为
    114bp;结合CE实验进行亲和力表征,结果证明,此序列可与SA靶标物有很好的结合。

    (2)本发明创建的LSPR-SELEX技术,利用固体芯片在检测过程中无需标记物,最大
    限度地保持了核酸适配体的空间结构和生物活性,且样品检测范围浓度低(0.1nM-1mM)。

    (3)与传统的核酸适配体筛选方法相比,本发明创建的LSPR-SELEX传感技术操作
    简单、灵敏度高、耗时短(15min)、响应速度快,最大的优势在于相互作用数据实时在线的呈
    现,能快速准确地获悉每一轮分子间的亲和力。

    (4)本发明借助LSPR传感器芯片的再生性能好,可重复利用80~100次,极大降低
    实验成本。

    附图说明

    图1:LSPR-SELEX筛选的适配体和靶标物的亲和力鉴定结果。其中,纵坐标代表传
    感器所检测到的信号值;横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。

    A图为第一轮筛选的核酸适配体和靶标物的亲和力鉴定结果;图中,从上到下各曲
    线对应的核酸适配体浓度逐渐降低(6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、0.375μM)。

    B图为第二轮筛选的核酸适配体和靶标物的亲和力鉴定结果。图中,从上到下各曲
    线对应的核酸适配体浓度逐渐降低(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)。

    图2:SBA的空间结构。

    图3:CE-SELEX表征SBA适配体。

    A:SA(250μg/mL)的电泳迁移;B:SBA(150μg/mL)的电泳迁移;C:SBA(75μg/mL)+SA
    (125μg/mL)的电泳迁移;D:BSA(250μg/mL)的电泳迁移;E:BSA(125μg/mL)+SBA(75μg/mL)的
    电泳迁移。

    具体实施方式

    以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

    实施例1 LSPR-SELEX的筛选方法

    (1)将寡核苷酸文库(两侧各含有20bp的上下游引物的固定序列,中间为80nt的随
    机序列)高速离心1min。再用ddH2O将其稀释成100μM的原液。寡核苷酸文库进行热变性(95
    ℃10min)以破坏核酸分子间形成的聚合物,冰浴5min,避免核酸发生聚合。试验中所用溶液
    使用前用0.22μm的微孔滤膜过滤。

    (2)实验仪器:Open-SPR(Nicoya,Ca),采用链霉亲和素(SA)包被的纳米金芯片,开
    始以150μL/min的流速运行10mM的PBS缓冲液(NaCl 4g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCl 0.1g、
    KH2PO4 0.1g、ddH2O定容至0.5L,pH7.4),至到达稳定的信号基线。

    (3)将100μM的寡核苷酸文库原液,用PBS缓冲液稀释至终浓度为10μM,作为样品。
    首先,注入250μL的寡核苷酸样品,以20μL/min的流速进样,与传感器相互作用5min,一旦相
    互作用时间结束,立即通入PBS缓冲液,以150μL/min的流速,高速冲洗系统5min,以清洗除
    去结合力弱或未结合的寡核苷酸分子;然后,用水冲洗进样系统,并用空气排空,防止样品
    在样品管内壁吸附;最后注入250μL的NaOH再生缓冲液(称取NaOH 0.4g,ddH2O定容至1L),
    在20μL/min低流速下与传感器芯片相互作用5min,洗脱回收与靶标物特异性结合的核苷酸
    分子。

    实施例2 PCR扩增及单链的制备

    (1)将洗脱回收的核苷酸分子作为次级文库,进行PCR富集。引物序列为:P1:5’-
    TTGACTTGCCACTGACTACC-3’(SEQ ID NO.1),P2:5’-GATGACGACCGACTGACTTC-3’(SEQ ID
    NO.2)。优化PCR的反应体系和程序如下:50μL的反应体系为:20μM P1 2μL、20μM P2 2μL、2
    ×Taq Master Mix 25μL、次级文库21μL;PCR程序为:95℃预变性5min;94℃变性30s,61.7
    ℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环;最后72℃延伸2min,4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝
    胶电泳鉴定,鉴定正确后进行纯化,其产物作为制备单链次级库的模板。

    (2)优化制备单链次级库的不对称PCR,50μL的反应体系为:20μM P2 4μL、2×Taq
    Master Mix 25μL、ddH2O 19μL、模板2μL;PCR程序为:95℃预变性5min;94℃变性30s,61.7
    ℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸2min,4℃保存。扩增产物用2%琼脂糖凝
    胶电泳,110V 30min,鉴定正确后对PCR产物进行纯化,以此进行下一轮筛选。同时以同样条
    件将PCR产物进行纯化、复性。每一轮筛选后,采用TraceDrawer数据处理分析软件进行KD的
    计算。

    结果表明,第一轮LSPR-SELEX筛选的核酸适配体与靶标物的KD值为107μM(见图
    1A)。第二轮LSPR-SELEX筛选的核酸适配体与靶标物的KD值为98nM(见图1B)。这说明,LSPR-
    SELEX技术仅需两轮筛选就能获得亲和力为98nM的核酸适配体。

    实施例3克隆与测序

    将第二轮LSPR-SELEX筛选得到的寡核苷酸序列连接到T载体上,进行克隆、测序,
    从而得到不同序列的适配体克隆株。最终以亲和力最高、特异性最强的序列作为理想的适
    配体进行研究,命名为SBA(测序结果如SEQ ID NO.3所示),结果见图2。

    实施例4毛细管电泳法表征(CE)

    (1)利用毛细管电泳法对LSPR-SELEX过程进行表征。实验仪器:G7100A(Agilent
    Technologies,USA);熔融石英毛细管内径50μM,长度56cm;运行缓冲液及样品稀释液均为
    PBS缓冲液(NaCl 8.5g、Na2HPO4 2.2g、NaH2PO4 0.1g、ddH2O定容至1L,pH 7.6)

    (2)使用前用1M NaOH(称取NaOH 4g,ddH2O定容至0.1L)、ddH2O依次冲洗5min、
    20min两遍,然后PBS缓冲液运行一次查看基线,待基线平稳后,进行样品分离。

    (3)每个样品不少于200μL,分别上样SA、SBA、SA与SBA的结合物(室温孵育30min)、
    BSA、BSA与SBA的结合物(室温孵育30min),进样压力为50mbar×10s,分离电压为20KV;样品
    分离20min。

    通过毛细管电泳法表征,结果表明,SA+SBA混合孵育后有复合物峰的出现,证实了
    SA和SBA存在相互作用(见图3A-C)。对照组BSA+SBA混合孵育后无复合物峰的出现,说明BSA
    和SBA不反应(见图3B、D-E)。

    SEQUENCE LISTING

    <110> 河南省农业科学院

    <120> 借助LSPR-SELEX方法筛选的特异结合链霉亲和素的核酸适配体序列及其应用

    <160> 3

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 1

    ttgacttgcc actgactacc 20

    <210> 2

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 2

    gatgacgacc gactgacttc 20

    <210> 3

    <211> 114

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 3

    aactgaacgg tgactgatgg gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 60

    ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcagatgac gaccgactga cttc 114

    关 键 词:
    借助 LSPRSELEX 方法 筛选 特异 结合 亲和 核酸 适配体 序列 及其 应用
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