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    重庆时时彩什么时候开售: 用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201710154098.X

    申请日:

    2017.03.15

    公开号:

    CN106892981A

    公开日:

    2017.06.27

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效 IPC(主分类):C07K 16/40申请日:20170315|||公开
    IPC分类号: C07K16/40; C07K16/06; G01N33/531 主分类号: C07K16/40
    申请人: 武汉大学深圳研究院
    发明人: 杜海宁; 程晓庆; 赵梦洁
    地址: 518057 广东省深圳市南山区科技园南区科苑南路武汉大学深圳产学研大楼A304室
    优先权:
    专利代理机构: 广东德而赛律师事务所 44322 代理人: 叶秀进
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710154098.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2019.03.29|||2017.06.27

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,包括以下步骤:用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子并提取被免疫兔子的血清;用Affi??Gel偶联的GST标签的全长SETD3蛋白纯化兔子的血清。本发明的SETD3抗体可用于免疫印迹(WB)、免疫荧光(IF)、免疫组化(IHC)、以及免疫沉淀(IP)多种用途,且效价和特异性较高。

    权利要求书

    1.一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
    a)用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子并提取被免疫兔子的血清;
    b)用Affi-Gel偶联的GST标签的全长SETD3蛋白纯化兔子的血清。
    2.根据权利要求1所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,用N端
    6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子时间为:主注射、主注射后的第28天、主注射后
    的第42天、主注射后的第60天、主注射后的第78天。
    3.根据权利要求2所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,免疫
    主注射后的第102天提取被免疫兔子的血清。
    4.根据权利要求2所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,主注
    射0.5mg抗原、主注射后的第28天注射0.6mg抗原、主注射后的第42天注射0.6mg抗原、主注
    射后的第60天注射0.4mg抗原、主注射后的第78天注射0.4mg抗原。
    5.根据权利要求2所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,N端
    6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白为经镍柱树脂纯化后蛋白。
    6.根据权利要求1所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,用
    Affi-Gel偶联GST标签的全长SETD3蛋白步骤包括:
    c)用谷胱甘肽树脂纯化GST标签的全长SETD3蛋白;
    d)将GST标签纯化的SETD3蛋白透析两次,将透析后GST标签纯化的SETD3蛋白蛋白质与
    事先用冷水平衡的Affi-Gel 15树脂在4摄氏度下偶联十二小时;
    e)用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子;
    f)用柠檬酸钠溶液清洗柱子并用该溶液平衡Affi-Gel柱子;
    g)将平衡后Affi-Gel柱子与庚二亚氨酸二甲酯在室温下反应30分钟;
    h)用Tris-HCl溶液终止反应2小时后,并用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。
    7.根据权利要求6所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,加入
    兔子的血清到Affi-Gel柱子上,并与Affi-Gel柱子在4摄氏度孵育十二小时。
    8.根据权利要求7所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,用
    TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子,用Glycine溶液洗脱结合的抗体,收集的抗体用Tris-HCl溶
    液中和洗脱液。
    9.根据权利要求8所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,测定
    所收集抗体的浓度,并浓缩抗体到1mg/ml的浓度,用PBS溶液透析浓缩的抗体十二小时后,
    在其中加入10%的甘油,分装后零下80摄氏度保存。
    10.根据权利要求1所述用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,其特征在于,N端
    6xHis标签的全长SETD3和GST标签的全长人源SETD3蛋白均为克隆基因,并在大肠杆菌中进
    行表达。

    说明书

    用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法

    技术领域

    本发明涉及免疫学技术领域,特别是涉及一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的
    制备方法。

    背景技术

    SETD3是一个具有经典SET保守结构(Su(var)3-9,Enhancer-of-zeste以及
    Trithorax)的一个甲基化转移酶。SETD3自身还包含有一个称为Rubis-subs-bind的结构
    域。SETD3首次被发现是因为其转录本水平在喂食过程中被调控。研究发现,斑马鱼中的
    SETD3具有对组蛋白H3K36位残基的单、双、三甲基化功能以及通过诱导caspase-3的激活进
    而抑制细胞生存能力的功能。最近的研究显示,鼠源的SETD3可以通过结合在肌生因子
    myogenin的启动子处来诱导肌肉细胞的分化过程,因此鼠源的SETD3在此处扮演了转录因
    子的角色,相对应的,鼠源的SETD3被证明具有组蛋白H3K4和H3K36位的甲基化转移酶活性。
    人源的SETD3蛋白被发现可以跟很多蛋白质发生相互作用,其中可以甲基化转录因子
    FoxM1。两者的结合可以抑制VEGF的转录。

    鉴于SETD3蛋白的多种功能,研究该蛋白的重要工具——抗体的优劣决定了实验
    结果的可靠性。目前商品化的SETD3兔多克隆抗体有Abcam(ab177582),abcam(ab200950),
    Sigma(HPA003639),Thermo fisher(PA5-43675),Atlas(HPA003591);鼠单克隆抗体有
    Thermo Fisher(730058)。这些抗体除了Atlas抗体显示可以用于免疫荧光外,其他抗体都
    只能用于Western blot实验。但是Atlas抗体的效价不高,稀释比例均大于1:1000。

    发明内容

    为了解决上述技术问题,本发明提供了一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制
    备方法。

    本发明的技术方案如下:一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法,包括以
    下步骤:

    a)用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子并提取被免疫兔子的血清;

    b)用Affi-Gel偶联的GST标签的全长SETD3蛋白纯化兔子的血清。

    优选地,用N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白免疫兔子时间为:主注射、主注
    射后的第28天、主注射后的第42天、主注射后的第60天、主注射后的第78天。

    优选地,免疫主注射后的第102天提取被免疫兔子的血清。

    优选地,主注射0.5mg抗原、主注射后的第28天注射0.6mg抗原、主注射后的第42天
    注射0.6mg抗原、主注射后的第60天注射0.4mg抗原、主注射后的第78天注射0.4mg抗原。

    优选地,N端6xHis标签的全长SETD3表达的蛋白为经镍柱树脂纯化后蛋白。

    优选地,用Affi-Gel偶联GST标签的全长SETD3蛋白步骤包括:

    c)用谷胱甘肽树脂纯化GST标签的全长SETD3蛋白;

    d)将GST标签纯化的SETD3蛋白透析两次,将透析后GST标签纯化的SETD3蛋白蛋白
    质与事先用冷水平衡的Affi-Gel 15树脂在4摄氏度下偶联十二小时;

    e)用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子;

    f)用柠檬酸钠溶液清洗柱子并用该溶液平衡Affi-Gel柱子;

    g)将平衡后Affi-Gel柱子与庚二亚氨酸二甲酯在室温下反应30分钟;

    h)用Tris-HCl溶液终止反应2小时后,并用PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。

    优选地,加入兔子的血清到Affi-Gel柱子上,并与Affi-Gel柱子在4摄氏度孵育十
    二小时。

    优选地,用TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子,用Glycine溶液洗脱结合的抗体,收集的
    抗体用Tris-HCl溶液中和洗脱液。

    优选地,测定所收集抗体的浓度,并浓缩抗体到1mg/ml的浓度,用PBS溶液透析浓
    缩的抗体十二小时后,在其中加入10%的甘油,分装后零下80摄氏度保存。

    优选地,N端6xHis标签的全长SETD3和GST标签的全长人源SETD3蛋白均为克隆基
    因,并在大肠杆菌中进行表达。

    本发明的有益效果是:本发明的SETD3抗体可用于免疫印迹(WB)、免疫荧光(IF)、
    免疫组化(IHC)、以及免疫沉淀(IP)多种用途,且效价和特异性较高。

    下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

    附图说明

    图1是检测本发明优选实施例兔源SETD3抗体特异性的分析图;

    图2是免疫荧光实验检验本发明优选实施例兔源SETD3抗体的分析图。

    具体实施方式

    为了更充分理解本发明的技术内容,下面结合具体实施例对本发明的技术方案进
    一步介绍和说明。

    一种用于免疫荧光检测的SETD3抗体的制备方法优选实施例:

    1、克隆N端6xHis和GST标签的全长人源SETD3蛋白基因,并在大肠杆菌中进行表
    达。

    2、用镍柱树脂纯化N端6xHis标签SETD3蛋白,用谷胱甘肽树脂纯化GST标签的
    SETD3蛋白各5mg。

    3、用纯化N端His标签SETD3蛋白同时免疫两只新西兰大兔子,主注射0.5mgN端His
    标签SETD3蛋白抗原、在主注射后第28天注射0.6mgN端His标签SETD3蛋白抗原、在主注射后
    第42天注射0.6mgN端His标签SETD3蛋白抗原、在主注射后第60天注射0.4mgN端His标签
    SETD3蛋白抗原、在主注射后第78天注射0.4mgN端His标签SETD3蛋白抗原,共5次免疫新西
    兰大白兔。在免疫后第102天处死兔子后提取血清。

    4、将5mg的GST标签纯化的SETD3蛋白在0.1M MOPS、pH7.5的溶液中透析两次。将透
    析后的蛋白质与事先用冷水平衡的Affi-Gel 15树脂在4摄氏度偶联十二小时。

    5、用10个柱体积的PBS溶液清洗Affi-Gel柱子5次,然后用0.2M的柠檬酸钠溶液
    (pH9.0)清洗Affi-Gel柱子一次并用该溶液平衡柱子,再行加入20mM的庚二亚氨酸二甲酯
    DMP,在室温(17至25摄氏度)下反应30分钟,然后用1M Tris-HCl pH 7.7的溶液终止反应2
    小时,并用10个柱体积的PBS溶液清洗Affi-Gel柱子。

    6、加入15ml的所提取的兔子血清到Affi-Gel柱子上,与

    Affi-Gel柱子在4摄氏度下孵育十二小时后,用TBS-T溶液清洗Affi-Gel柱子10
    次,再用0.1M Glycine、pH 2.5的溶液洗脱结合的抗体,每1ml组分收集为一管,并用2M
    Tris-HCl、pH 8.5的溶液中和洗脱液。

    7、测定所收集抗体浓度,并浓缩抗体到1mg/ml的浓度,用PBS

    溶液透析抗体十二小时,然后将抗体溶液中加入10%的甘油,分装后下零下80摄
    氏度保存。

    将上述步骤所获得抗体兔源SETD3抗体进行特异性分析,所得结果如图1所示:

    A图在Hela细胞中,分别构建了稳转空载(shControl)或敲低SETD3(shSETD3)的稳
    定细胞系,用自己制备的抗体Western Blot检测两种细胞中的SETD3的蛋白表达水平,其中
    GAPDH为内参。SETD3抗体稀释比例:1:5000

    B图在经过抗原亲和层析纯化的SETD3抗体中分别加入BSA以及原核表达纯化的
    His标签的SETD3蛋白,然后将这两种抗体作为一抗分别与A图中构建的稳定细胞系样品进
    行抗体孵育2个小时,Western Blot检测空载和shSETD3细胞系中SETD3的蛋白表达水平,其
    中GAPDH为内参。结论:本发明的兔源SETD3抗体特异性较高,可以有效识别内源的SETD3蛋
    白。

    免疫荧光实验检验上述兔源SETD3抗体,所得结果如图2所示;在稳定转染空载
    (shControl)或敲低SETD3(shSETD3)的细胞中用制备的SETD3抗体进行免疫荧光反应实验。
    DAPI代表细胞核的染色情况;SETD3代表本发明所制备的SETD3抗体免疫检测细胞内源的
    SETD3蛋白定位情况(一抗稀释比例:1:2000);MERGE代表前两张免疫信号的叠加。
    shControl代表对照组,shSETD3代表用shRNA特异性敲低内源SETD3蛋白。由图2可见,敲低
    SETD3后,SETD3在细胞质中的定位信号明显减弱。结论:敲低SETD3的样品证明抗体识别的
    高特异性。

    以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容,以便于读者更容易理解,
    但不代表本发明的实施方式仅限于此,任何依本发明所做的技术延伸或再创造,均受本发
    明的?;??;诒痉⒚髦械氖凳├?,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所
    获得的所有其他实施例,都属于本发明?;さ姆段?。

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    用于 免疫 荧光 检测 SETD3 抗体 制备 方法
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