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    重庆时时彩四星计划: 一种新型耳抑素抗体.pdf

    关 键 词:
    一种 新型 耳抑素 抗体
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610680614.8

    申请日:

    2016.08.16

    公开号:

    CN106674347A

    公开日:

    2017.05.17

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/18申请日:20160816|||公开
    IPC分类号: C07K16/18; G01N33/68; G01N33/577 主分类号: C07K16/18
    申请人: 滨州医学院
    发明人: 姜静; 王凌; 李伟伟
    地址: 264003 山东省烟台市莱山区观海路346号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610680614.8

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.09|||2017.05.17

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种新型的耳抑素抗体或其功能性片段,与耳抑素具有较强的亲和力,灵敏度高。本发明还提供了利用该新型的耳抑素抗体或其功能性片段在用于检测耳抑素及其偶联药物中的方法。

    权利要求书

    1.一种新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述抗体包含重链和轻链,其特征在
    于:
    (i)所述的重链至少包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:1、2、3、7、8、9、13、
    14、15所示的氨基酸序列;
    (ii)所述的轻链至少包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:4、5、6、10、11、12、
    16、17所示的氨基酸序列。
    2.根据权利要求1所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其特征在于:
    (a)所述重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列;
    所述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:4、5、6所示的氨基酸序列;或
    (b)所述重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:7、8、9所示的氨基酸序列;
    所述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:10、11、12所示的氨基酸序列;或
    (c)所述重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:13、14、15所示的氨基酸序
    列;所述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:16、5、17所示的氨基酸序列。
    3.根据权利要求1所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,其特
    征在于:
    (a)包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区;包含如SEQ ID NO:19所示
    的氨基酸序列的轻链可变区;或
    (b)包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变区;包含如SEQ ID NO:21所示
    的氨基酸序列的轻链可变区;或
    (c)包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链可变区;包含如SEQ ID NO:23所示
    的氨基酸序列的轻链可变区。
    4.根据权利要求1-3所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的抗体为单
    克隆抗体。
    5.根据权利1-3所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的功能性片段是
    指抗体片段如Fv、scFv、Fab、Fab’、scFv-Fc、F(ab’)2片段或者Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG。
    6.根据权利1-3所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的耳抑素为
    Dolastatin-10、Dolastatin-15、TZT-1027、MMAE、MMAF、西马多丁、他西多丁。
    7.根据权利要求6所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的耳抑素优选
    地为MMAE(Monomethyl Auristatin E)。
    8.包含权利要求1-3所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段的药物,检测试剂或试
    剂盒。
    9.一种检测耳抑素及其偶联药物的方法,其特征在于,使用权利要求1-3所述的耳抑素
    抗体或其功能性片段。
    10.根据权利要求12所述的检测耳抑素及其偶联药物的方法,其特征在于,权利要求1-
    3中所述的耳抑素抗体或功能性片段用于ELISA方法。

    说明书

    一种新型耳抑素抗体

    技术领域

    本发明涉及一种新型耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,本发明还
    涉及用所述抗体制备的试剂盒,以及所述抗体用于定量检测耳抑素及其偶联药物中的用
    途。

    技术背景

    耳抑素(dolastatin)也称海兔毒素,是从海洋无壳软体动物截尾海兔中提取了一
    类线性缩肽类毒素蛋白,有多种衍生物,常见的如:Dolastatin-10、Dolastatin-15、TZT-
    1027、MMAE(Monomethyl Auristatin E)、MMAF(Monomethyl Auristatin F)、西马多丁、他
    西多丁等(Bai RL,Pettit GR,Hamel E.Dolastatin 10,a powerful cytostaticpeptide
    derived from a marine animal.Inhibition of tubulinpolymerization mediated
    through the vinca alkaloid bindingdomain[J].Biochem harmacol,1990,39(12):
    1941-1949.)。耳抑素通过作用于微管蛋白发挥强大的细胞毒活性,多种海兔毒素衍生物已
    被开发用于药物治疗(Bai RL,Pettit GR,Hamel E.Binding of dolastatin 10
    totubulin at a distinct site for peptide anti-mitotic agents near
    theexchangeable nucleotide and vinca alkaloid sites[J].J BiolChem,1990,265
    (28):17141-17149.)。

    因耳抑素具有很强的细胞毒性,直接用药安全性较低,“治疗窗”较窄,因此最主要
    的策略之一是耳抑素的靶向用药治疗。通过制备成具有靶向功能的制剂或连接具有靶向功
    能的分子,将耳抑素载带到生物体的特定部位发挥药效。最常见的靶向用药形式为抗体偶
    联药物(Antibody Drug Conjugations,ADC),目前已有多个耳抑素的ADC药物开展临床研
    究,其中有1个药物(Adcetris,SGN-35)已批准上市(Deng CC,Pan BQ,Owen A.Brentuximab
    vedotin[J].Clin Cancer Res,2013,19(1):22-27.)。

    在开展耳抑素相关靶向药物的药效、药代、毒代研究中,定量药理研究是重要的研
    究方面之一。建立耳抑素偶联药物的定量检测方法是支持上述研究的

    关键,这些定量检测方法包括液相-质谱法(LC-MS,LC-MS/MS),酶联免疫法
    (ELISA)等。其中酶联免疫法(ELISA)是先将已知的抗原或抗体固定在固相载体表面,待测
    物通常相当于抗体或抗原,与结合在固相载体表面的抗原或抗体发生特异性结合,待测物
    连有酶,通过酶与底物发生的颜色反应(反应后颜色的深浅与待测物质的浓度呈一定比例
    关系)进行定量分析。

    对于检测耳抑素及其偶联药物,ELISA定量检测的主要策略之一就是利用抗药物
    抗体进行捕获或检测。在实施检测的过程中,特异性强、亲和力高的抗药物抗体的获得是关
    键,而大多数的小分子药物只有反应原性而无免疫原性,这就为ELISA定量检测耳抑素及其
    偶联药物带来了难以解决的困扰。

    本发明提供了解决上述问题的技术方案,制备了特异性结合耳抑素的抗体,特异
    性强,亲和力高,灵敏度高,可用于ELISA的定量检测。

    发明内容

    为了解决上述问题,本发明提供了一种新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其是
    通过将耳抑素与不同的载体蛋白进行偶联,形成人工抗原,进行动物免疫,再经筛选获得的
    与耳抑素药物分子具有高亲和力的抗体。其偶联策略主要是将药物分子的基团活化后,偶
    联不同的载体蛋白制备人工抗原,一种作为免疫抗原,而另一种用于筛选抗原,以保证产生
    的抗体是针对耳抑素分子而非载体蛋白。本发明还提供了利用该新型的耳抑素抗体或其功
    能性片段定量检测耳抑素或其偶联物的方法,及利用该新型的耳抑素抗体或其功能性片段
    用于制备检测游离耳抑素或耳抑素偶联药物的试剂盒。

    本发明具体的技术方案为:

    一方面,本发明提供了一种新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻
    链,特别的:(i)所述重链至少包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:1、2、3、7、8、9、
    13、14、15所示的氨基酸序列;和/或(ii)所述轻链至少包含三个CDR区,所述CDR区具有如
    SEQ ID NO:4、5、6、10、11、12、16、17所示的氨基酸序列。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,(i)所述
    重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列;和/或(ii)所
    述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:4、5、6所示的氨基酸序列。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,(i)所述
    重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:7、8、9所示的氨基酸序列;和/或(ii)所
    述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:10、11、12所示的氨基酸序列。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,特别的:
    (i)所述重链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:13、14、15所示的氨基酸序列;
    和/或(ii)所述轻链包含三个CDR区,所述CDR区具有如SEQ ID NO:16、5、17所示的氨基酸序
    列。

    更具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,(i)所
    述重链包含三个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID
    NO:2所示的氨基酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列;(ii)所述轻链包含三
    个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID NO:5所示的氨基
    酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

    更具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,(i)所
    述重链包含三个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID
    NO:8所示的氨基酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列;(ii)所述轻链包含三
    个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID NO:11所示的氨
    基酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

    更具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,(i)所
    述重链包含三个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID
    NO:14所示的氨基酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列;(ii)所述轻链包含
    三个CDR区,CDR1具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列,CDR2具有如SEQ ID NO:5所示的
    氨基酸序列,CDR3具有如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。

    进一步地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,其特征
    在于:(i)包含如SEQ ID NO:18、20、22所示的氨基酸序列的重链可变区;(ii)包含如SEQ ID
    NO:19、21、23所示的氨基酸序列的轻链可变区。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,其特征在
    于:(i)包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的重链可变区;(ii)包含如SEQ ID NO:19所
    示的氨基酸序列的轻链可变区。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,其特征在
    于:(i)包含如SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的重链可变区;(ii)包含如SEQ ID NO:21所
    示的氨基酸序列的轻链可变区。

    具体地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其包含重链和轻链,特别的:
    (i)包含如SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的重链可变区;(ii)包含如SEQ ID NO:23所示
    的氨基酸序列的轻链可变区。

    进一步地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的抗体为单克隆
    抗体。

    进一步地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的功能性片段是
    指Fv、scFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG。

    进一步地,所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段,其中所述的耳抑素为
    Dolastatin-10、Dolastatin-15、TZT-1027、MMAE(Monomethyl Auristatin E)、MMAF
    (Monomethyl Auristatin F)、西马多丁、他西多丁等,优选地为MMAE,MMAF。

    进一步地,所属新型耳抑素的抗体与MMAE亲和力为10-8~10-10之间。

    另一方面,本发明提供了能够编码上述所述的任一耳抑素抗体或其功能性片段的
    分离的多核苷酸。

    另一方面,本发明提供了表达载体,包含所述的分离的多核苷酸。

    另一方面,本发明提供了宿主细胞,包含所述的表达载体。

    另一方面,本发明还提供了含有所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片断的抗体
    偶联药物。

    另一方面,本发明还提供了含有所述的新型的耳抑素抗体或其功能性片段的药
    物,检测试剂或试剂盒。

    另一方面,本发明还提供了所述新型的耳抑素抗体或其功能性片段在检测耳抑素
    或其偶联药物中的应用,所述的应用是指耳抑素抗体在ELISA法中的应用。

    附图说明:

    图1显示了耳抑素单抗的特异性和灵敏度,抗耳抑素单抗在结合抗原的同时加入
    耳抑素作为竞争结合剂,评价其特异性和灵敏度。其中A为对照抗体(control),其与抗原无
    特异结合,加入不同浓度耳抑素后无明显竞争作用,B、C、D分别为1G1、2F10、4C3单抗的竞争
    结合效应。

    图2显示了耳抑素单抗建立的竞争ELISA法测定大鼠血清中耳抑素的标准曲线。

    图3显示了耳抑素单抗建立的ELISA法测定猴血清中耳抑素偶联物定量检测标准
    曲线。

    具体实施方式:

    定义:

    除非另有定义,本文所使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相
    同含义。关于本领域的定义及术语,专业人员具体可参考Current Protocols in
    Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基
    酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

    尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值,但是具体实施例中所示的
    数值尽可能准确的进行记载。然而,任何数值本来就必然含有一定的误差,其是由它们各自
    的测量中存在的标准偏差所致。另外,本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何
    和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)
    的任何和所有子范围;也就是说,所有以最小值1或更大起始的子范围,例如1至6.1,以及以
    最大值10或更小终止的子范围,例如5.5至10。另外,任何称为“并入本文”的参考文献应理
    解为以其整体并入。

    另外应注意,如本说明书中所使用的,单数形式包括其所指对象的复数形式,除非
    清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用,除非上下文另有清
    楚指明。

    本文使用的“CDR区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区,如Kabat et
    al.所定义(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5th
    Ed.,U.S.Department of Health and Human Services,NIH,1991,以及以后版本)。存在三
    个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况,本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、
    或者这些区域的几个或者甚至全部,所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力
    而负责结合的大部分氨基酸残基。

    对本发明来说,两种核酸或者氨基酸序列间的“一致性”、“同一性”或“相似性”是
    指,在最佳比对(最优比对)后所获得的、待比较的两序列之间相同核苷酸或相同氨基酸残
    基的百分数,该百分数是纯粹统计学的并且两种序列间的差异随机分布并覆盖其全长。两
    种核酸或者氨基酸序列之间的序列比较通常是在以最优方式使它们匹配以后,通过比较这
    些序列而进行,所述比较能够通过区段或者通过“比较窗”实施。除了能够手工实施外,用于
    比较序列的最优比对,还能够通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同
    源性算法、通过Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48:443]局部同源性算法、通过
    Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444)相似性搜索方法、通过使用
    这些算法的计算机软件实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics
    Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI,或者通过
    BLAST N or BLAST P比较软件)。

    术语“抗体”系指完整抗体和其任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或单链?!叭?br />长抗体”系指包含通过二硫键而互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白。每条重链
    包含一重链可变区(缩写为VH)和一重链恒定区。该重链恒定区包含三个域(domain),CH1、
    CH2和CH3。每条轻链包含一轻链可变区(缩写为VL)和一轻链恒定区。该轻链恒定区包含一
    个域,CL。VH 和VL区域还可再细分为具有高可变性的多个区,被称为互补决定区(CDR),其
    间散布有更为保守的被称为框架区(FR)的多个区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构
    成,按照以下顺序从氨基端至羧基端排布:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链
    的这些可变区包含与抗原相互作用的结合域??固宓暮愣ㄇ山榈济庖咔虻鞍子胨拗鞯淖?br />织或因子结合,包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
    嵌合或人源化抗体也涵盖在根据本发明的抗体中。

    术语“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合
    物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。

    本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F
    (ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中
    应能够增加半寿期的任何片段,所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙
    二醇化,PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab')2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇
    化片段)(“PEG”为聚乙二醇),所述片段具有耳抑素结合活性。优选地,所述功能片段将由其
    来源抗体的重或轻可变链的部分序列构成或者包含它们,所述部分序列足以保留与其来源
    抗体相同的结合特异性和充分的亲和力,对于耳抑素E,优选至少等于其来源抗体亲和力的
    1/100,在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸,优选其来源的
    抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。

    通常,为了制备单克隆抗体或其功能片段,尤其是鼠源的单克隆抗体或其功能片
    段,可以参考尤其描述在手册“Antibodies”中的技术(Harlow and Lane,Antibodies:A
    Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp.726,
    1988)或者参考Kohler和Milstein描述的从杂交瘤细胞制备的技术(Nature,256:495-497,
    1975)。

    本文使用的术语“耳抑素”,又称为“海兔毒素肽”是指分离自一种海洋生物截尾海
    兔(Dollabella auricularia)的多肽及其衍生物,其包括但不限于海兔毒素肽10
    (Dolastatin-10,耳抑素E)、海兔毒素肽15(Dolastatin-15,耳抑素F)。耳抑素(海兔毒素
    肽)是有丝分裂抑制剂,其表现出强的抗癌活性,因此被作为抗癌药物的候选。研究人员进
    一步发现和合成了许多海兔毒素肽的衍生物,例如耳抑素E(MMAE)和耳抑素F(MMAF),MMAE
    (Monomethyl Auristatin E)、MMAF(Monomethyl Auristatin F)、TZT-1027、西马多丁、他
    西多丁等。

    本文使用的术语“耳抑素及其偶联药物”中的“偶联药物”是指所有的与耳抑素偶
    联生成的药物,最常见的为抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugations,ADC)形式。

    以下实施例用来证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面,但这并
    不限制本发明的范围。

    实施例1抗耳抑素鼠源单克隆抗体的制备与序列分析

    1)耳抑素人工抗原的制备

    采用偶氮法或马来亚酰胺法进行药物分子的活化。其中偶氮法可参照文献
    (Erlanger BF.The preparation of antigenic hapten-carrier conjugate:a survey
    method in enzymology[M].New York:Academic Press.1980:85-103;)进行:取耳抑素
    (MMAE/MMAF)0.5%的储备液1.5ml于试管中,用1mol/L的盐酸调pH至pH2.5,另取亚硝酸钠
    溶液0.5ml逐滴加入,边加边摇动,4℃避光孵育1小时,加入2~3滴氨基磺酸氨溶液,除去游
    离亚硝酸根离子。最后量出体积计算耳抑素浓度与BSA进行偶联。按20:1(偶氮活化分子:
    BSA)的比例加入2%的BSA水溶液,用氢氧化钠调pH至7.5并在4℃孵育24小时,随后用
    0.01mol/L的PBS,pH7.4进行透析106倍,4℃保存,KLH,免疫球蛋白(IgG)偶联参照上述方
    法;采用马来亚酰胺偶联可参考文献(Greg T.Hermanson.Bioconjugate Techniques(2nd
    edition),Chapter19.Preparation of Hapten-carrier Immunogen
    Conjugates.Elsevier Inc.Academic Press.2008:746-782)进行耳抑素的连接子合成,并
    参照文献(Hamblett,K.J.,et al.,Effects of drug loading on the antitumor
    activity of a monoclonal antibody drug conjugate.Clin Cancer Res,2004.10(20):
    p.7063-70.)进行载体蛋白的偶联,1%的BSA蛋白溶液冷却至4℃,加终浓度25%DMSO,按照
    药物分子与蛋白摩尔比例20:1加入MC-linker-MMAE/MMAF (0.01mol/L,DMSO溶解),室温搅
    拌反应1h,透析106倍处理。4℃保存,KLH,IgG偶联参照上述方法。

    2)免疫及杂交瘤的制备

    使用上述制备的耳抑素-载体蛋白作为抗原免疫小鼠制备单克隆抗体。免疫反应、
    杂交瘤细胞融合和初筛都按照标准步骤(参考文献:WHO Technical Report Series,
    No.822,1992 Annex 3)进行。取6只Balb/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司),
    随机分成2组,每组3只。一组用耳抑素-BSA免疫注射,另一组用耳抑素-KLH进行免疫。首次
    免疫分别取1mg/ml的免疫原50μL,与等量的弗氏完全佐剂充分乳化,小鼠颈部皮下注射,间
    隔2周后进行第2次注射,用弗氏不完全佐剂(Difco Lab),抗原量为25-50μg/0.05ml/只小
    鼠,间隔3周后进行第3次注射,注射剂量同第2次,第3次注射后10天取血。用酶联免疫吸附
    试验(ELISA)检测小鼠的血清,检测抗原采用耳抑素偶联不同于免疫抗原载体蛋白的人工
    抗原。将血清中抗耳抑素抗体滴度最大的小鼠的脾脏取出,然后与骨髓瘤细胞P3X63Ag8
    (ATCC CRL-1580)融合。将融合细胞稀释到10块96孔板上,根据与耳抑素抗体-耳抑素的结
    合能力用ELISA方法进行初筛。在典型的ELISA实验中,用耳抑素-BSA/KLH(0.2-1(g/ml)包
    被Nunc Maxisorb 96孔板,然后用梯度稀释的小鼠血清或杂交瘤上清液(100μL)孵育。鼠源
    的抗耳抑素抗体用辣根过氧化物酶偶联的山羊F(ab')2抗鼠IgG Fc特异的二抗
    (Invitrogen公司)进行检测。

    用ELISA法对400个杂交瘤细胞株的上清液进行筛选,其中36个表现出强的耳抑
    素–ECD结合力。选择耳抑素结合能力最强的十株杂交瘤细胞,通过有限稀释方法筛选亚克
    隆杂交瘤细胞株。通过悬浮亚克隆杂交瘤细胞株培养,蛋白纯化,用ELISA确定耳抑素的结
    合亲和力,用耳抑素分子的竞争ELISA法进一步测试其对耳抑素的结合能力。最终通过序列
    分析确定了3株杂交瘤细胞系:1G1、2F10、4C3,它们具有强的耳抑素结合能力,后续通过
    ELISA和细胞试验对其做进一步的分析。

    3)抗耳抑素杂交瘤细胞克隆的序列分析

    上述杂交瘤细胞克隆重链和轻链的可变区的序列利用商业试剂盒SMARTTM RACE
    cDNA Amplification Kit(Clontech公司)快速扩增5’末端进行测序而获得。用RNApure
    Tissue Kit(北京康威世纪生物科技有限公司)从杂交瘤细胞中提取总RNA,使用
    SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit进行总RNA的反转录,以总RNA为模板,利用试剂盒中
    的引物,加入反转录酶SMARTScribeTM Reverse Transcriptase,按照试剂盒提供的步骤进
    行反转录获得RACE-Ready第一链cDNA,然后进行两轮PCR,第一轮PCR以获得的cDNA为模板,
    试剂盒中提供的UPM为5’端引物,3’端引物。PCR反应条件为:94℃预变性5min;25个扩增循
    环(94℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸2min);最后72℃延伸10min。第二轮PCR,以第一轮
    PCR的产物为模板,以试剂盒中提供的NUP为5’端引物,3’端引物,PCR反应条件为:94℃预变
    性5min;25个扩增循环(94℃变性30s,68℃退火30s,72℃延伸2min);72℃延伸10min?;竦?br />上述杂交瘤细胞克隆重链和轻链的可变区。三个细胞株表达单抗序列如表1所示:

    表1抗耳抑素单克隆抗体的可变区氨基酸序列





    PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化,并亚克隆到pCR2.1TOPO克隆载体上
    (Invitrogen公司)。通过PCR,获得独立克隆的质粒DNA,进而用M13正向和反向引物测序?;?br />补决定区(CDR)的氨基酸序列通过Kabat编码表定义,并在表2中列出。

    表2抗耳抑素单克隆抗体CDR的氨基酸序列



    实施例2.耳抑素单抗的专属性和灵敏度

    为检测耳抑素单抗的专属性和灵敏度,将偶联有耳抑素的IgG蛋白包被于96孔板
    中(300ng/well),将单克隆抗体(1G1、2F10、4C3)梯度稀释(1:500,1:1000,1:2000,1:5000,
    1:10000,1:50000)加入孔内,每种梯度在加入抗体的同时加入3种浓度的耳抑素(10ng/ml,
    50ng/ml,500ng/ml)进行竞争孵育,加入检测HRP偶联的羊抗鼠IgG进行检测,同时加入不相
    关抗体进行对照检测。结果如图1所示,结果表明:2F10、4C3、1G1在加入耳抑素后都会影响
    其与耳抑素偶联IgG的亲和且随耳抑素浓度的增加竞争增加,在抗体1:2000的稀释度下
    500ng的耳抑素几乎可完全竞争抗体与偶联耳抑素的结合。由此可表明抗耳抑素抗体的特
    异性强,灵敏度高。

    实施例3.耳抑素单抗检测耳抑素(偶联耳抑素及耳抑素)

    1)耳抑素分子定量检测的竞争ELISA方法建立

    竞争ELISA是将高特异性抗体吸附于固体载体上,使游离的耳抑素与化学合成耳
    抑素偶联物(兔IgG偶联耳抑素)顺次竞争结合抗体的结合位点,当吸附的抗体量和耳抑素
    偶联物量固定时,待测样品中游离耳抑素的量愈多,结合于抗体上的耳抑素偶联物愈少,那
    么与羊抗兔酶标二抗结合的少,从而使底物显色愈浅,使待测耳抑素的量与吸光度值成反
    比关系。


    经过包被抗体与耳抑素偶联-兔IgG配比、检测二抗浓度的优化筛选,确定竞争
    ELISA方法操作流程并用于大鼠血清中耳抑素浓度的检测。操作程序及结果如下:

    操作程序:

    1)单抗包被:将纯化单抗2F10和4C3用碳酸盐缓冲液(pH9.4~9.8)按摩尔比1:1混
    合后稀释至5μg/ml进行包被,100μL/孔,2~8℃过夜(16~18小时)。

    2)洗板:取出酶标版,用洗板液(PBS+0.05%吐温20,pH7.2~7.4)350μL/孔洗板3
    次。

    3)封闭:加入封闭液(1%BSA+1%明胶PBS溶液),200μL/孔,25±3℃封闭2小时。

    4)洗板:参照步骤(2)

    5)样品配制:A标准曲线:用大鼠血清将耳抑素梯度稀释为0.25ng/mL,0.5ng/mL,
    1ng/mL,2ng/mL,4ng/mL,8ng/mL,16ng/mL,32ng/mL的耳抑素标准溶液,作为检测标曲样本。
    B标准曲线:用大鼠血清将耳抑素稀释为0.8ng/mL,5ng/mL,25ng/mL的低、中、高三个浓度,
    作为检测质控样本。

    6)样品处理:将标准曲线样本、质控样本及待检测样本用稀释液(1%BSA-PBS溶
    液)按1:10(如:30μL样品+270μL稀释液→300μL)前处理。

    7)加样:将预处理好的所有样品入孔,100μL/孔,37℃孵育1小时。

    8)加入偶联耳抑素:按步骤(2)洗板后,加入兔IgG偶联耳抑素8μg/mL,100μL/孔,
    37℃孵育1小时。

    9)加检测二抗:洗板后,加入1:5000稀释的HRP偶联羊抗兔酶标抗体,100μL/孔,37
    ℃孵育1小时。

    10)加底物:按步骤(2)洗板后,加入新配制的TMB底物工作液,100μL/孔,室温避光
    孵育10-15分钟。

    11)终止反应:加入2M的硫酸溶液,50μl/孔。

    12)检测:酶标仪OD450读数。

    13)采用四参数拟合法对标曲进行拟合,计算获得各样本的浓度,并对标准曲线及
    质控样本进行回收率计算。

    结果显示建立的大鼠血清耳抑素的定量标准曲线范围为0.25-32ng/mL,各浓度点
    与曲线的吻合度良好(标准曲线图例见图2)。经多批次分析,标准曲线批间重现性良好,准
    确度RE%范围为:-2.4%≤RE%≤5.2%;各浓度点复孔之间重现性好,精密度CV%≤
    5.5%。低、中、高浓度的质控样品板间的准确度RE%范围为:-13.5%≤RE%≤-13.1%,板
    间精密度CV%≤10.2%。数据表明,该方法可用于大鼠血清中耳抑素的定量检测。

    采用相同竞争原理,所建立的猴和人血清耳抑素标准曲线定量范围分别为0.39-
    50ng/mL和0.625-40ng/mL,方法验证结果显示,均可应用于相应血清基质中耳抑素的定量
    检测。

    2)偶联耳抑素定量检测的双抗夹心ELISA方法建立

    双抗夹心ELISA是将高特异性抗体吸附于固体载体上,使耳抑素偶联物(人IgG偶
    联耳抑素)的耳抑素结合于抗体的结合位点,待测样品中耳抑素偶联物的量愈多,结合于抗
    体上的耳抑素偶联物愈多,那么与羊抗人酶标二抗结合的多,从而使底物显色愈深,使待测
    耳抑素偶联物的量与吸光度值成正比关系。


    经过包被抗体与检测二抗浓度的优化筛选,确定了双抗夹心ELISA方法操作流程
    并用于猴血清中耳抑素偶联物浓度的检测。操作程序及结果如下:

    操作程序:

    1)单抗包被:将纯化单抗2F10和4C3用碳酸盐缓冲液(pH9.4~9.8)按摩尔比1:1混
    合后稀释至4μg/mL进行包被,100μL/孔,2~8℃过夜(16~18小时)。

    2)洗板:取出酶标版,用洗板液(PBS+0.05%吐温20,pH7.2~7.4)350μL/孔洗板3
    次。

    3)封闭:加入封闭液(3%BSA-PBS溶液),200μL/孔,25±3℃封闭2小时。

    4)洗板:参照步骤(2)

    5)样品配制:A标准曲线:用猴血清将耳抑素偶联物梯度稀释为6.25ng/mL(锚定
    点),12.5ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,400ng/mL,800ng/mL(锚定点)的耳
    抑素标准溶液,作为检测标曲样本。B标准曲线:用猴血清将耳抑素偶联物稀释为32ng/mL,
    80ng/mL,320ng/mL的低、中、高三个浓度,作为检测质控样本。

    6)样品处理:将标准曲线样本、质控样本及待检测样本用稀释液(1%BSA-PBS)按
    1:10(如:30μL样品+270μL稀释液→300μL)前处理。

    7)加样:将预处理好的所有样品入孔,100μL/孔,37℃孵育1小时。

    8)加检测二抗:洗板后,加入1:10000稀释的HRP偶联羊抗兔酶标抗体,100μL/孔,
    37℃孵育1小时。

    9)加底物:按步骤(2)洗板后,加入新配制的TMB底物工作液,100μL/孔,室温避光
    孵育10-15分钟。

    10)终止反应:加入2M的硫酸溶液,50μL/孔。

    11)检测:酶标仪OD450读数。

    12)采用四参数拟合法对标曲进行拟合,计算获得各样本的浓度,并对标准曲线及
    质控样本进行回收率计算。

    结果显示建立的猴血清耳抑素的定量标准曲线范围为12.5-400ng/mL,各浓度点
    与曲线的吻合度良好(标准曲线图例见图3)。经多批次分析,标准曲线批间重现性良好,准
    确度RE%范围为:-0.9%≤RE%≤3.8%;各浓度点复孔之间重现性好,精密度CV%≤
    2.1%。低、中、高浓度的质控样品板间的准确度RE%范围为:-10.8%≤RE%≤-4.3%,板间
    精密度CV%≤10.5%。数据表明,由耳抑素抗体建立的方法准确度非常高,该方法可用于猴
    血清中耳抑素偶联物的定量检测。

    采用双抗夹心ELISA法,所建立的大鼠和人血清耳抑素偶联物标准曲线定量范围
    分别为6.25-800ng/mL和39.06-500ng/mL,方法验证显示,均可应用于相应血清基质中耳抑
    素偶联物的定量检测。

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