• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 9
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩分析网: 一种结合CRY2AD的环七肽及其编码基因和应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201710069279.2

    申请日:

    2017.02.08

    公开号:

    CN106674334A

    公开日:

    2017.05.17

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C07K 7/64申请日:20170208|||公开
    IPC分类号: C07K7/64; C12N15/11; G01N33/68 主分类号: C07K7/64
    申请人: 金陵科技学院
    发明人: 王耘
    地址: 211169 江苏省南京市江宁区弘景大道99号
    优先权:
    专利代理机构: 南京苏创专利代理事务所(普通合伙) 32273 代理人: 张学彪
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710069279.2

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.09|||2017.05.17

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用,属于生物技术领域。本发明的结合Cry2Ad的环七肽由SEQ??ID??NO.2所示的氨基酸序列构成。所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因的DNA序列如SEQ??ID??NO.1所示。本发明的结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以在Cry2Ad定性、定量检测中应用,可替代ELISA检测中的检测抗体应用于夹心和竞争ELISA免疫检测。本发明结合Cry2Ad的环七肽可以人工合成,简化了制备过程,节约了成本,具有广泛的应用前景。

    权利要求书

    1.一种结合Cry2Ad的环七肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
    2.如权利要求1所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因。
    3.根据权利要求2所述的编码基因,其特征在于:所述编码基因的DNA序列如SEQ ID
    NO.1所示。
    4.一种如权利要求1所述的结合Cry2Ad的环七肽的衍生物,其特征在于,所述的衍生物
    为将所述的结合Cry2Ad的环七肽采用异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧
    光标记物进行标记得到的检测元件。
    5.权利要求1或4所述的结合Cry2Ad的环七肽或其衍生物在Cry2Ad定性、定量检测中的
    应用。

    说明书

    一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用

    技术领域

    本发明涉及一种环七肽,尤其涉及一种结合Cry2Ad的环七肽及其应用,属于生物
    技术领域。

    背景技术

    近十年,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi,Bt)转基因作物商品化种植推
    广迅速,研究发现长期大面积种植后会造成杀虫基因逃逸,生物多样性下降以及对非目标
    生物的间接危害等风险,同时对土壤和水体生态系统也存在潜在的风险,因此,在进行转基
    因作物研究、开发和商业化的同时,必须建立恰当的方法对粮食及环境中转基因成分进行
    快速鉴定与检测。

    目前,转基因产品的检测技术主要有基于核酸检测的多种新型PCR技术和基于蛋
    白质的免疫检测,其中免疫检测以其准确、经济、便捷等优势已成为快速检测类应用最为广
    泛的方法,市场上用于检测Bt毒素的免疫试剂盒大多数是采用以多克隆或单克隆抗体为检
    测元件,其免疫过程比较繁琐,且受个体和免疫过程的影响较大。噬菌体展示技术可以克服
    上述缺点,该技术是对含有数以亿计克隆的随机片段进行快速高通量地筛选,获得的阳性
    克隆可被用于分子识别、快速检测试剂开发等领域。目前利用该技术获得的针对Cry1类毒
    素蛋白的单链抗体和纳米抗体在Bt毒素检测方面也已得到初步应用。但是基因工程抗体货
    架期较短,其合成受到氨基酸序列长度和空间结构的限制,因此有一定的制约,而噬菌体肽
    库很好的避开了上述的瓶颈,因此该技术的应用对开发Cry2Ad检测试剂具有广阔的前景。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是提供一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应
    用。

    为解决上述问题,本发明采用如下技术方案:

    本发明的结合Cry2Ad的环七肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

    所述结合Cry2Ad的环七肽的编码基因。

    所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

    本发明的结合Cry2Ad的环七肽的衍生物,所述的衍生物为将所述的结合Cry2Ad的
    环七肽采用异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-FAM)等荧光标记物进行标记得到的
    检测元件。

    本发明的结合Cry2Ad的环七肽或其衍生物在Cry2Ad定性、定量检测中的应用。

    本发明以Cry2Ad为靶分子,将靶分子和BSA分别固相包被于酶标板上,先将噬菌体
    环七肽库投入BSA包被的板上进行负筛选,再将未结合的肽库与靶分子进行结合、洗脱,重
    复以上过程至特异性七肽明显富集,最终获得1个结合肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所
    示。

    本发明还涉及上述特异性抗Cry2Ad环七肽氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID
    NO.1所示。

    本发明提及的环七肽可以通过噬菌体噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合成
    的方式进行制备。噬菌体噬菌体扩增是通过生物扩增的方式大量增殖展示有结合Cry2Ad的
    环七肽噬菌体粒子?;蚬こ讨刈楸泶锸峭ü岷螩ry2Ad的环七肽基因与表达载体重组
    后进行表达。人工合成是通过化学合成多肽的方式进行制备。

    本发明还涉及结合Cry2Ad环七肽的衍生物。是指对多种制备方法获得的结合
    Cry2Ad的环七肽进行修饰的产物,主要包括异硫氰酸荧光素(FITC)或5-羧基荧光素(5-
    FAM)等荧光基团检测标签。

    本发明还涉及结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在免疫学检测中的应用。本发明结
    合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可替代ELISA检测中的检测抗体应用于夹心和竞争ELISA免
    疫检测。

    本发明所述的结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物在粮食样品中检测应用,其具体步
    骤为:

    (1)将500mg固体待测样品干燥磨粉过筛,加入1mL提取液(含0.15%(v/v)吐温20
    的磷酸缓冲液(PBS))4℃振荡2h后10000g离心10分钟取上清待测。

    (2)将10μg/mL小菜蛾刷状缘膜囊泡(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV)包
    被到96孔板中,每孔100μL,4℃过夜;次日洗涤后每孔加200μL MPBS(含3%脱脂奶粉PBS)室
    温孵育1.5h,再次洗涤后加入100μL步骤(1)制备的待测液,37℃孵育1h,PBST(含0.05%吐
    温20的PBS)洗涤3次,加入100μL 1011pfu七肽噬菌体上清液,37℃孵育1h后洗涤,再加入1:
    5000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗-M13噬菌体二抗孵育1h,洗涤后每孔加入100
    μL四甲基联苯胺(TMB)显色液,避光显色至蓝色加入50μL 2M硫酸终止显色。

    (3)96孔板在酶标仪上测定OD450nm,将检测结果代入公式y=0.1503ln(x)+
    0.8995,R2=0.997,计算Cry2Ad的浓度。

    本发明从公开的环七肽库中,筛选获得一种具有特异性识别Cry2Ad毒素的七肽,
    可用于该毒素的检测。

    有益效果:本发明具有下述有益效果:

    1.本发明结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以替换抗体作为检测元件,避免多克
    隆或单克隆抗体制备时的动物免疫,对比基因工程抗体更方便体外合成且货架期长。

    2.本发明结合Cry2Ad的环七肽及其衍生物可以和Cry2Ad毒素特异性结合,检测效
    果好,对开发快速检测试剂盒有重要的科学及现实意义。

    3.本发明结合Cry2Ad的环七肽可以人工合成,简化了制备过程,节约了成本,具有
    广泛的应用前景。

    附图说明

    图1为以结合Cry2Ad的环七肽建立的夹心ELISA标准曲线。

    具体实施方式

    下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

    本发明的结合Cry2Ad的环七肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

    本发明的结合Cry2Ad的环七肽可以通过噬菌体扩增、基因工程重组表达及人工合
    成的方式进行制备。噬菌体扩增是指利用噬菌体侵染大肠杆菌后释放出大量展示有环七肽
    的噬菌体;基因工程重组表达是指将该环七肽基因连接在表达载体后大量表达;人工合成
    是指利用环七肽的氨基酸序列化学合成。

    实施例中所涉及的试剂和培养基配方:

    (1)LB液体培养基:胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,用去离子水定容至
    1L,在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

    (2)LB固体培养基:在1L的LB液体培养中加入15g琼脂,在15psi高压下蒸汽灭菌
    20min。

    (3)PBS溶液:称氯化钠8g,十二水合磷酸氢二钠2.9g,氯化钾0.2g,磷酸二氢钾
    0.2g,充分溶解后定容至1L。

    (4)PBST溶液:在PBS溶液中加入体积比为0.05%的吐温20。

    (5)PEG/NaCl溶液:称20g PEG 8000,氯化钠14.61g,定容到100mL,在15psi高压下
    蒸汽灭菌20min。

    (6)CBS溶液:碳酸钠1.59g,碳酸氢钠2.94g,定容到1L,在15psi高压下蒸汽灭菌
    20min。

    (7)TMB溶液:10g四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜中。

    (8)底物显色液:9.875mL CPBS,100μL TMB溶液,25μL体积比为20%H2O2。

    (9)TBS溶液:1mol/L Tris/HCl(pH7.5)10mL,氯化钠8.8g定容到1L,在15psi高压
    下蒸汽灭菌20min。

    (10)TBST溶液:TBS溶液中加入不同体积比的吐温20。

    (11)MPBS溶液:3%(w/v)脱脂奶粉溶于PBS溶液中。

    (12)环七肽库、-96gⅢ测序引物和E.Coil ER2738购于NEB公司。

    实施例1.结合Cry2Ad的环七肽的淘选及鉴定

    1.结合Cry2Ad的环七肽亲和淘选具体方法:

    a.第一轮淘?。阂?00μg/mL BSA和100μg/mL Cry2Ad包被6孔酶标板,4℃孵育过
    夜。次日用0.1%(v/v)吐温20(Tween-20)TBST洗涤6次后,以BSA为负筛选靶标进行预筛选,
    再与活化的Cry2Ad毒素结合,结合后0.1%TBST洗涤10次,并以竞争洗脱方式进行洗脱。洗
    脱液感染20mL对数期的E.coil ER2738进行扩增4.5h,用PEG/NaCl过夜沉淀噬菌体,次日离
    心后重悬,获得次级文库。

    b.进一步筛?。褐馗床街鑑的方法再进行三轮淘选,在第二至第四轮淘选中,
    Cry2Ad包被浓度分别为75、50、25μg/mL,第1轮洗涤条件是体积比0.1%的Tween20,第2和第
    3轮Tween-20浓度变为0.3%(v/v)各洗20次,第四轮Tween-20浓度为0.5%(v/v)洗涤25次。
    每轮洗脱时间减短。降低包被浓度、加强洗涤强度增加多肽的亲和力。

    2.结合Cry2Ad的环七肽的鉴定:从第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑
    选25个噬菌斑,侵染ER2738进行扩增,扩增后的噬菌体测定滴度,采用间接ELISA进行七肽
    结合活性的鉴定,靶蛋白用CBS进行稀释,以10μg/mL Cry2Ad蛋白包被酶标板,4℃过夜,BSA
    作为阴性对照。次日封闭2h,每孔分别加入1011pfu噬菌体室温孵育1h,洗涤后加入HRP-M13
    抗体(1:5000稀释)结合1h,洗去未结合的抗体,加入底物TMB显色,测定吸光值A450,选取A450
    大于阴性对照3倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

    阳性克隆的菌液DNA测序由上海生工生物技术公司完成,引物为-96gⅢ。

    实施例中涉及的核苷酸序列:

    ACCTCCACCGCAACTCTGATTATGCTGACTCGAACAAGC

    使用DNAMAN和Swiss数据库序列进行分析?;竦孟嘤Φ陌被嵝蛄校?br />

    ACSSQHNQSCGGG

    实施例2.结合Cry2Ad的环七肽特异性检测

    采用棋盘滴定确定Cry2Ad的最佳包被浓度以及阳性噬菌体克隆的最佳稀释倍数
    (1012、1011、1010、109、108pfu)。按最佳Cry2Ad浓度包被微孔,4℃过夜,MPBS封闭后,加入孵育
    过夜的毒素与多肽的混合物(取50μL最佳稀释倍数的噬菌体阳性克隆与50μL Cry2Ad毒素
    混匀,毒素浓度为320μg/mL开始4倍往下稀释8个梯度),同时以BSA作为阴性对照,加入HRP
    标记抗M13,TMB显色后测定A450值。做3次平行重复试验,计算抑制率。抑制率计算方法:抑制
    率=(抑制前A450-抑制后A450)/抑制前A450×100%。分别以类似物Cry1C、Cry1B、Cry1Ab作
    为竞争抑制物,测定交叉反应率(CR),评价该方法的特异性,交叉反应率数据如表1所示:

    表1特异性七肽对Cry1Ab、Cry1B、Cry1C的交叉反应率



    实施例3.以结合Cry2Ad的环七肽为检测元件的夹心ELISA方法建立

    (1)以噬菌体扩增的方式大量制备特异性环七肽

    将展示有特异性环七肽的噬菌体加入20mL培养至对数生长期的ER2738中,37℃培
    养4.5h。12000g离心10min,取16mL上清液加入1/6体积的PEG/NaCl,4℃静置1h,10000rpm离
    心15min,沉淀用1mL TBS重悬,即为扩增液。

    (2)标准曲线的建立

    用棋盘法确定BBMV的最佳包被浓度以及阳性噬菌体克隆的最佳稀释倍数。BBMV包
    被浓度为10μg/mL噬菌体稀释度为1011pfu。BBMV包被过夜后用PBST洗3次,1%BSA室温封闭
    1h。PBST洗涤后加入梯度稀释的Cry2Ad(10-0.01μg/mL),BSA为阴性对照,孵育1h。PBST洗3
    次,加入1011pfu噬菌体扩增液,37℃孵育1h。加入100μL 1:5000倍稀释的HRP标记的抗M13二
    抗孵育1h,TMB显色后H2SO4终止,测定A450,绘制标准曲线。最低检测限为空白对照值加上三
    倍的标准差。标准曲线如附图1所示。

    实施例4.夹心ELISA在玉米样品添加回收试验中的应用

    (1)将500mg固体待测样品干燥磨粉过筛,加入1mL提取液(含0.15%吐温20的PBS)
    4℃振荡2h后10000g离心10分钟取上清待测。

    (2)将10μg/mL BBMV包被到96孔板中,每孔100μL,4℃过夜;次日洗涤后每孔加200
    μL MPBS(含3%脱脂奶粉PBS)室温孵育1.5h,再次洗涤后加入100μL步骤(1)制备的待测液,
    37℃孵育1h,PBST洗涤3次,加入100μL 1011pfu七肽噬菌体上清液,37℃孵育1h后洗涤,再加
    入1:5000倍稀释的HRP标记的抗-M13二抗孵育1h,洗涤后每孔加入100μL TMB显色液,避光
    显色至蓝色加入50μL 2M硫酸终止显色。

    (3)96孔板在酶标仪上测定OD450nm,将检测结果代入公式y=0.1503ln(x)+
    0.8995,R2=0.997,计算Cry2Ad的浓度,检测结果如表2所示。

    表2夹心ELISA测定Cry2Ad毒素在玉米中的添加回收率



    SEQUENCE LISTING

    <110> 金陵科技学院

    <120> 一种结合Cry2Ad的环七肽及其编码基因和应用

    <130> 2017

    <160> 2

    <170> PatentIn version 3.3

    <210> 1

    <211> 39

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 1

    acctccaccg caactctgat tatgctgact cgaacaagc 39

    <210> 2

    <211> 39

    <212> PRT

    <213> 人工序列

    <400> 2

    Ala Leu Ala Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Gly Leu Asn His

    1 5 10 15

    Ile Ser Ala Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Gly Leu

    20 25 30

    Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr

    35

    关 键 词:
    一种 结合 CRY2AD 环七肽 及其 编码 基因 应用
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:一种结合CRY2AD的环七肽及其编码基因和应用.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6083011.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03