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    网易重庆时时彩真的么: 一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 南极 磷虾 提取 纯度 海洋 磷脂 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611146703.0

    申请日:

    2016.12.13

    公开号:

    CN106588977A

    公开日:

    2017.04.26

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07F 9/10申请日:20161213|||公开
    IPC分类号: C07F9/10 主分类号: C07F9/10
    申请人: 山东省科学院生物研究所
    发明人: 刘可春; 李晓彬; 韩利文; 何秋霞; 楚杰; 王荣春; 陈锡强; 张轩铭; 王莹; 靳梦
    地址: 250000 山东省济南市历下区科院路19号
    优先权:
    专利代理机构: 济南诚智商标专利事务所有限公司 37105 代理人: 朱彩霞
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611146703.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.06.29|||2017.05.24|||2017.04.26

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其步骤包括:将南极磷虾匀浆,复合酶酶解;固液分离,固体部分加入碱性乙醇液超声辅助提??;水沉除油后,进行聚苯乙烯凝胶柱层析;冰乙醇液洗涤,得到高纯度磷脂。本发明原料采用菠萝蛋白酶和几丁质酶复合酶酶解,用碱性乙醇液进行高效提取,提高了磷脂的提取效率,全程温度不超过50℃,不损失磷脂的生理活性,提取的磷脂纯度高于95%,较现有方法有显著提高。

    权利要求书

    1.一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,步骤如下:
    1)将南极磷虾加入0.5~2倍量水,匀浆,调节pH至6.5,40~45℃条件下加入复合酶水
    解2~4小时;
    2)酶解液固液分离,固体部分经85~100%的碱性乙醇液超声辅助提取2次,每次15~
    30min,提取液合并后,进行减压抽滤和减压浓缩;
    3)搅拌并加热提取浓缩物,向提取浓缩物中缓慢、均匀的掺入蒸馏水,掺水时间为
    15min,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;
    4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后,过滤,经聚苯乙烯凝胶柱层析,环己烷-乙酸乙酯洗
    脱剂洗脱,收集洗脱液,薄层色谱检测后,合并洗脱液,减压浓缩;
    5)浓缩物经冰乙醇液洗涤,干燥,得到高纯度磷脂。
    2.如权利要求1所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,具体地,
    步骤如下:
    1)将南极磷虾加入0.5~2倍量水,匀浆5~20min,调节pH至6.5,40~45℃条件下加入
    原料重量0.5~1%的复合酶水解2~4小时;
    2)酶解液固液分离,固体部分按照质量体积比1:6~1:12加入重量百分比浓度为85~
    100%的碱性乙醇液超声辅助提取2次;提取液合并后,经减压抽滤和减压浓缩得提取浓缩
    物;
    3)以每分钟60转的速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每分钟
    25转,缓慢、均匀的掺入蒸馏水,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分钟60转,待
    絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;
    4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后,过滤,经Bio-Beads S-X8聚苯乙烯凝胶柱层析,环己
    烷洗脱除去小极性杂质后,环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例洗脱,洗脱速度为每小时0.5~
    1.5倍柱体积;收集洗脱液,薄层色谱检测后,合并洗脱液,减压浓缩;
    5)浓缩物按照质量体积比1:0.5~1:2加入55~65%的冰乙醇液洗涤,干燥,得到高纯
    度磷脂。
    3.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤1)复合酶为菠萝蛋白酶和几丁质酶按重量比为1:2混合。
    4.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤2)碱性乙醇液的乙醇比例为90~95%,pH为9.0~10.0。
    5.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤2)超声功率为30~40KHZ,超声温度为25~40℃,每次超声时间为15~30min。
    6.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤3)蒸馏水的掺入量为提取浓缩物重量的3%,水温为30℃。
    7.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤2)和4)中所述的减压浓缩温度为40~50℃。
    8.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,所述
    步骤4)薄层分析检测条件为:正相GF254硅胶薄层板;展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲
    烷-无水乙醇-三乙胺-水体系;显色剂为10%浓硫酸-乙醇溶液;110℃加热显色。
    9.如权利要求1或2所述的从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法,其特征是,磷脂
    的纯度在95%以上。

    说明书

    一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法

    技术领域

    本发明涉及一种从南极磷虾中提取海洋磷脂的方法,属于海洋活性物质技术领
    域。

    背景技术

    南极磷虾是一种生活在南大洋的甲壳类浮游动物,是地球上最大的单种生物资源
    之一,其现存量高达6.5~10.0亿吨,成熟虾年产量为3~5亿吨,年可捕获量可达1.3亿吨,
    使其成为巨大的潜在渔业资源。我国目前已经将南极磷虾列为今后远洋渔业发展的主要开
    发品种之一。南极磷虾中磷脂的含量丰富,其磷脂的脂肪酸组成以EPA和DHA为主,含量占磷
    脂中脂肪酸总量的40%以上。因此,南极磷虾中高纯度磷脂的制备必然是深加工南极磷虾
    中最关键的技术之一。

    磷脂是一类含磷酸根的类脂化合物,是组织细胞的基本组成成分,包括鞘磷脂和
    甘油磷脂两大类。前者主要见于高等动物的红细胞膜中,后者在动物肝脏、脑及卵巢中含量
    丰富。磷脂不仅具有较高的营养价值,还具有生理调节机能,促进人体新陈代谢、增强免疫
    力、预防疾病等作用。现在,美国、欧洲、日本等发达国家已将磷脂应用于临床中,预防脑、
    心、肝、肿瘤等疾病。此外,磷脂还具有乳化、润湿、抗氧化、改善物料粘度、防止淀粉老化等
    特征,使其在食品工业、轻工、化工等领域有着广泛的应用。

    目前,市场上磷脂产品主要是大豆磷脂和蛋黄磷脂。大豆磷脂虽然存在广泛,价格
    低廉,但其脂肪酸组成相对简单,不饱和程度较低;蛋黄磷脂的磷脂酰胆碱纯度较高,但生
    产成本高,缺少对人体有益的多不饱和脂肪酸。海产动物来源的磷脂因其侧链中富含二十
    碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等丰富的ω-3多不饱和脂肪酸,具有显著的降血
    脂、抗衰老、促进神经传导、提高大脑活力、预防心脑血管疾病,保肝、增强免疫力、抑制肿瘤
    细胞生长等多种功能,开发利用前景广阔。

    国内外对磷脂的提取纯化进行了很多的研究,常用的方法有:溶剂提取法、吸附色
    谱法、超临界萃取法、酶解法、无机盐复合沉淀法、微波提取法、膜分离法等。但是,这些方法
    存在很多的技术缺陷:原料方面主要从大豆和蛋黄中提取, 从而和人类抢夺食物资源;超
    临界萃取法、膜分离法等工艺较为复杂,操作成本高;无机盐沉淀法引入金属离子(Zn2+、Cd2
    +等),具有一定的毒性,影响磷脂的质量等等。

    目前,针对南极磷虾中提取的磷脂多以磷虾油的产品形式存在,提取方法大多为
    酶解法和溶剂提取法,其得到的磷脂含量较低,最高仅达50~60%。专利CN102603790A利用
    90~100%乙醇提取后,正己烷萃取、丙酮沉淀的方式得到高纯度磷脂酰胆碱。专利
    CN103509047A将南极磷虾头进行煎煮和无水乙醇提取后,经膜分离、硅胶或大孔树脂柱层
    析获得磷脂酰胆碱产品。但是,以上均是针对磷脂类的单一成分,并非是存在于南极磷虾中
    的种类丰富的磷脂组合。专利CN102559368A将新鲜南极磷虾低温自溶后进行酶解,再用乙
    醇进行提取得到初步的磷脂产品。专利CN104531332A利用乙酸乙酯和正丁醇组成的混合溶
    剂提取南极磷虾中的总磷脂,其磷脂含量为27~45%之间。因此,进一步开发研究从南极磷
    虾中提取高纯度磷脂的方法,对于扩大海洋磷脂的生产来源和提升南极磷虾的利用价值具
    有重要意义。

    发明内容

    本发明针对现有技术的不足,提供一种操作简便,安全环保的从南极磷虾中提取
    高纯度海洋磷脂的方法。

    为了实现上述发明目的,本发明提供的技术方案是,一种从南极磷虾中提取高纯
    度海洋磷脂的方法,步骤如下:

    1)将南极磷虾加入0.5~2倍量水,匀浆,调节pH至6.5,40~45℃条件下加入复合
    酶水解2~4小时;

    2)酶解液固液分离,固体部分经85~100%的碱性乙醇液超声辅助提取2次,每次
    15~30min,提取液合并后,进行减压抽滤和减压浓缩;

    3)搅拌并加热提取浓缩物,向提取浓缩物中缓慢、均匀的掺入蒸馏水,掺水时间为
    15min,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;

    4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后,过滤,经聚苯乙烯凝胶柱层析,环己烷-乙酸乙
    酯洗脱剂洗脱,收集洗脱液,薄层色谱检测后,合并洗脱液,减压浓缩;

    5)浓缩物经冰乙醇液洗涤,干燥,得到高纯度磷脂。

    具体地,步骤如下:

    1)将南极磷虾加入0.5~2倍量水,匀浆5~20mi n,调节pH至6.5,40~45℃条件下
    加入原料重量0.5~1%的复合酶(菠萝蛋白酶和几丁质酶)水解2~4小时;

    2)酶解液固液分离,固体部分按照质量体积比1:6~1:12加入重量百分比浓度为
    85~100%的碱性乙醇液超声辅助提取2次;提取液合并后,经减压抽滤和减压浓缩得提取
    浓缩物;

    3)以每分钟60转的速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每
    分钟25转,缓慢、均匀的掺入蒸馏水,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分钟60
    转,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;

    4)总磷脂用少量二氯甲烷溶解后,过滤,经Bio-Beads S-X8聚苯乙烯凝胶柱层析,
    环己烷洗脱除去小极性杂质后,环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例洗脱,洗脱速度为每小时0.5
    ~1.5倍柱体积;收集洗脱液,薄层色谱检测后,合并洗脱液,减压浓缩;

    5)浓缩物按照质量体积比1:0.5~1:2加入55~65%的冰乙醇液洗涤,干燥,得到
    高纯度磷脂。

    所述的南极磷虾原料为新鲜或冷冻的南极磷虾。

    所述的碱性乙醇液为向乙醇液中添加碱性物质,使其pH达到9.0~10.0;所述的碱
    性物质为氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠或醋酸钠等。

    所述步骤1)复合酶中菠萝蛋白酶和几丁质酶的重量比为1:2。

    所述步骤2)碱性乙醇液中的乙醇比例优选90~95%;超声功率为30~40KHZ,超声
    温度为25~40℃,每次超声时间为15~30min。

    所述步骤3)蒸馏水的掺入量为提取浓缩物重量的3%,水温为30℃。

    所述步骤4)薄层分析检测条件为:正相GF254硅胶薄层板;展开剂为10:11.3:
    11.7:2.7的二氯甲烷-无水乙醇-三乙胺-水体系;显色剂为10%浓硫酸-乙醇溶液;110℃加
    热显色。

    所述步骤2)和4)中所述的减压浓缩温度为40~50℃。

    与现有技术相比,本发明具有以下优点:

    1)本发明方法得到的南极磷虾中磷脂纯度极高,磷脂的纯度在95%以上。

    2)在提取过程中通过向乙醇中添加碱性物质,对磷脂起到增溶作用,提高了收率,
    提取效率远高于现有常规方法。

    3)原料前处理过程中采用菠萝蛋白酶和几丁质酶复合的方式进行酶解,有利于磷
    脂更高效率的释放,提高了磷脂的提取率。

    4)提取过程中温度均控制在50℃以下,产品活性功能不受损失,尤其适合海洋磷
    脂(富含ω-3多不饱和脂肪酸侧链)的提取。

    5)提取过程操作简便,提取效率高。柱层析死吸附较少,填料机械强度好,可重复
    使用。

    附图说明

    图1为本发明对比例2用不同含醇量乙醇液提取得到的磷脂纯度图。

    图2为磷酸二氢钾的标准曲线。

    具体实施方式

    下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行
    进一步的阐述,下述说明仅是为了解释本发明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本
    发明教导所作的任何变换或替换,均属于本发明的?;し段?。

    实施例1

    称取冷冻保存的南极磷虾100g,加入50mL水,粉碎匀浆18min,用醋酸-醋酸钠缓冲
    液调节pH至6.5,加热至40℃,加入复合酶0.5g,水解约3h;将酶解液离心,固体部分经
    1000mL 93%的乙醇液(醋酸钠调其pH为9.0),30℃下超声提取2次,每次30min,超声频率为
    30KHz,合并提取液,减压抽滤后,滤液经45℃减压浓缩,得到提取浓缩物;以每分钟60转的
    速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每分钟25转,缓慢、均匀的掺入
    蒸馏水,掺水量为油重量的3%,水温30℃,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分
    钟60转,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;少量二氯甲烷溶
    解总磷脂,过滤后,滤液上Bio-Beads S-X8层析柱,环己烷-乙酸乙酯按比例1:1等度洗脱,
    流速为每小时1.0倍柱体积,用薄层层析 法检识,展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-
    无水乙醇-三乙胺-水体系,根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分,45℃减压浓缩洗
    脱液;100mL 60%的冰乙醇液洗涤浓缩物,真空干燥,得到高纯度磷脂,其收率为5.2%(对
    投料冷冻南极磷虾计),磷脂纯度为95.78%。

    取本实施例得到的高纯度磷脂样本50mg,加200μL水,匀浆三次,每次5500RPM,20
    秒,氮气?;?。加400μL MTBE、80μL甲醇和200μL水。涡旋30秒,超声10分钟。离心15min,取上
    层MTBE层蒸干。用100μL二氯甲烷:甲醇(1:1)复溶后进行HPLC-MS分析,经鉴定其所含各类
    磷脂中主成分结构为PC(16:0/22:6),PE(20:1/20:5),CP(20:2/16:1/18:2/18:1),SM(d18:
    1/14:0),LPC(16:0),LPE(20:1),LPI(20:5),PA(18:0/20:5),PG(16:0/18:1),PI(18:0/20:
    5),PS(18:0/20:5)。

    实施例2

    称取新鲜南极磷虾100g,加入100mL水,粉碎匀浆12min,用醋酸-醋酸钠缓冲液调
    节pH至6.5,加热至45℃,加入复合酶0.7g,水解约4h;将酶解液离心,固体部分经1200mL
    95%的乙醇液(碳酸氢钠调其pH为9.0),室温下超声提取2次,每次15min,超声频率为
    30KHz,合并提取液,减压抽滤后,滤液经45℃减压浓缩,得到提取浓缩物;以每分钟60转的
    速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每分钟25转,缓慢、均匀的掺入
    蒸馏水,掺水量为油重量的3%,水温30℃,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分
    钟60转,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;少量二氯甲烷溶
    解总磷脂,过滤后,滤液上Bio-Beads S-X8层析柱,环己烷-乙酸乙酯按比例1:1洗脱,流速
    为每小时0.5倍柱体积,用薄层层析法检识,展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲烷-无水
    乙醇-三乙胺-水体系,根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分,45℃减压浓缩洗脱
    液;80mL 62%的冰乙醇液洗涤浓缩物,真空干燥,得到高纯度磷脂,其收率为6.4%(对投料
    新鲜南极磷虾计),磷脂纯度为96.75%。

    实施例3

    称取新鲜南极磷虾100g,加入200mL水,粉碎匀浆8min,用醋酸-醋酸钠缓冲液调节
    pH至6.5,加热至43℃,加入复合酶0.8g,水解约2h;酶解液固 液分离,固体部分经600mL
    90%的乙醇液(碳酸氢钠调其pH为10.0),35℃下超声提取2次,每次20min,超声频率为
    40KHz,合并提取液,减压抽滤后,滤液经43℃减压浓缩,得到提取浓缩物;以每分钟60转的
    速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每分钟25转,缓慢、均匀的掺入
    蒸馏水,掺水量为油重量的3%,水温30℃,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分
    钟60转,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;少量二氯甲烷溶
    解总磷脂,过滤后,滤液上Bio-Beads S-X8层析柱,环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例进行洗
    脱,流速为每小时1.5倍柱体积,用薄层层析法检识,展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲
    烷-无水乙醇-三乙胺-水体系,根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分,43℃减压浓
    缩洗脱液;150mL 65%的冰乙醇液洗涤浓缩物,真空干燥,得到高纯度磷脂,其收率为6.2%
    (对投料新鲜南极磷虾计),磷脂纯度为96.39%。

    实施例4

    称取冷冻南极磷虾虾头100g,加入150mL水,粉碎匀浆10min,用醋酸-醋酸钠缓冲
    液调节pH至6.5,加热至45℃,加入复合酶1.0g,水解约3h;酶解液离心后,固体部分经
    1000mL 95%的乙醇(醋酸钠调其pH为10.0),25℃下超声提取2次,每次25min,超声频率为
    40KHz,合并提取液,减压抽滤后,滤液经48℃减压浓缩,得到提取浓缩物;以每分钟60转的
    速度搅拌提取浓缩物,加热其温度至35℃,降低搅拌速度至每分钟25转,缓慢、均匀的掺入
    蒸馏水,掺水量为油重量的3%,水温30℃,掺水时间为15min,掺水后,搅拌速度恢复至每分
    钟60转,待絮状物沉淀出现停止搅拌,静置12h,离心,沉淀物即为总磷脂;少量二氯甲烷溶
    解总磷脂,过滤后,滤液上Bio-Beads S-X8层析柱,环己烷-乙酸乙酯按1:1的比例进行洗
    脱,流速为每小时1.0倍柱体积,用薄层层析法检识,展开剂为10:11.3:11.7:2.7的二氯甲
    烷-无水乙醇-三乙胺-水体系,根据Rf值和显色特征来判断、合并含磷脂部分,48℃减压浓
    缩洗脱液;50mL 58%的冰乙醇液洗涤浓缩物,真空干燥,得到高纯度磷脂,其收率为5.5%
    (对投料冷冻南极磷虾计),磷脂纯度为95.92%。

    对比例1

    实验处理过程同实施例1,其不同在于南极磷虾酶解后经碱性乙醇液提取方 式为
    搅拌提取,提取时间为2小时,其得到的磷脂纯度为92.02%,产品收率为3.6%(对投料冷冻
    南极磷虾计)??杉?,相同的原料和制备过程,超声辅助提取相对于普通搅拌提取,缩短了提
    取时间,提高了产品收率和磷脂纯度。

    对比例2

    实验处理过程同实施例3,其不同在于碱性乙醇液的含醇量不同,实验结果如表1
    和图1所示??杉?,含醇量为90~95%之间时,得到的磷脂纯度较为理想(大于95%),当用
    100%乙醇提取时,其磷脂纯度反而降低。

    表1



    对比例3

    对比例3-1至对比例3-4的提取液为不加碱性物质的乙醇液,乙醇的浓度及实验处
    理过程分别与实施例1至实施例4相同。其得到的磷脂纯度和产品收率如下??杉?,相同的原
    料和制备过程,碱性物质的添加有利于磷脂的提取。

    表2



    对比例4

    实验处理过程同实施例4,其不同在于南极磷虾酶解过程中使用的酶为单独的菠
    萝蛋白酶(酶加入量同实施例4),其得到的磷脂纯度为92.86%,产品收率为3.8%(对投料
    冷冻南极磷虾计)??杉?,相同的原料和制备过程,几丁质酶的添加有利于磷脂的提取,提高
    了产品收率和磷脂纯度。

    本发明方法中磷脂的测定方法如下:

    采用分光光度法(钼蓝比色法)测定磷脂的含量。做出的磷酸二氢钾的标准曲线方
    程为:y=0.0935x-0.0052(R2=0.9992)。标准曲线如图2所示。

    准确量取0.3mL磷脂样品溶液(0.5mg/mL的二氯甲烷溶液)置于10mL的刻度试管中
    (空白对照量取0.3mL二氯甲烷溶剂),水浴挥干溶剂,加入4滴浓硫酸、3滴高氯酸于电炉上
    消化至无色澄清,冷却后补水至2mL,加入1滴酚酞指示剂,用50%氢氧化钠溶液中和至溶液
    显红色,缓慢滴加稀硫酸(5/200,v/v)使红色消失,补水至5mL,摇匀,依次加入1.0mL调节酸
    度的硫酸,摇匀,1.0mL钼酸铵溶液,摇匀,0.6mL抗坏血酸溶液,补水至10mL,加塞混匀,迅速
    放入70℃的水浴中显色30min取出置冷水中冷却10min,以0mL为参比,在波长820nm处测定
    吸光值,代入标准曲线,得到无机磷的含量,再乘以系数26.3即得总磷脂的含量。

    以上所述,仅是本发明的优选实施方式,并非是对本发明作其它形式的限制,对于
    本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,依据本发明的技术实质
    对以上实施例还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也属于本发明的?;し段?。

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    本文标题:一种从南极磷虾中提取高纯度海洋磷脂的方法.pdf
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