• 浪潮孙丕恕从信息时代到智能时代 人工智能价值将爆发式释放 2019-12-21
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
    • / 14
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩龙虎怎么算: 一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法.pdf

    关 键 词:
    一种 蝼蛄 虫草 活性 成分 定量分析 检测 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201610831888.2

    申请日:

    2016.09.18

    公开号:

    CN106353427A

    公开日:

    2017.01.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20160918|||公开
    IPC分类号: G01N30/02; G01N30/06 主分类号: G01N30/02
    申请人: 广东海洋大学
    发明人: 王雅玲; 孙力军; 叶日英
    地址: 524088 广东省湛江市麻章区海大路1号
    优先权:
    专利代理机构: 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人: 张月光;林伟斌
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610831888.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.03.12|||2017.03.01|||2017.01.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于检测技术领域,公开了一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法,根据蝼蛄虫草的特性,从样品提取开始,分别优化出测定虫草酸、核苷和氨基酸的方法,最终获得了既快速准确,又节约成本测定条件,该方法的检测准确度高,样品添加回收率高,从而为蝼蛄虫草的检测建立了体系,填补了蝼蛄虫草活性成分检测的空白,具有广泛的应用价值。

    权利要求书

    1.一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (1)原料处理:将干净的蝼蛄虫草的虫体和草体分离,分别研磨成虫粉和草粉;
    (2)样品储备液的制备:将虫粉和草粉溶解后,在30~70℃下超声提取1~4h,超声的频
    率为20~40Hz,离心取上清液获得样品储备液;
    (3)虫草酸的含量测定:
    (4)核苷的含量测定:利用HPLC进行测定,所述HPLC的条件为:
    流动相:0min,甲醇-水体积比为5:95;3min,甲醇-水体积比为10:90;8min,乙腈-水体
    积比为10:90;10min,甲醇-水体积比为5:95;
    色谱柱:Apollo C18柱(250mm×4.6mm,5um);
    检测波长:260nm;
    柱温:35℃;
    流速:1mL/min;
    进样量:10uL;
    (5)氨基酸的含量测定。
    2.一种蝼蛄虫草中核苷类物质的定量分析检测方法,其特征在于,利用HPLC进行测定,
    所述HPLC的条件为:
    流动相:0min,甲醇-水体积比为5:95;3min,甲醇-水体积比为10:90;8min,乙腈-水体
    积比为10:90;10min,甲醇-水体积比为5:95;
    色谱柱:Apollo C18柱(250mm×4.6mm,5um);
    检测波长:260nm;
    柱温:35℃;
    流速:1mL/min;
    进样量:10uL。
    3.根据权利要求1所述的蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法,其特征在于,步骤(2)
    是针对虫粉和草粉分别进行提取,是将虫粉在50℃下,0~30Hz超声提取2h;或者是将草粉
    在60℃下30~40Hz超声提取3h。

    说明书

    一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法

    技术领域

    本发明涉及检测技术领域,更具体地,涉及一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法。

    背景技术

    蝼蛄(Gryllotalpa),俗名耕狗、拉拉蛄、扒扒狗、土狗崽(西南地区)、蠹蚍(度比
    仔),可入药,用于治疗水肿、石淋、小便不利、瘰疬、臃肿恶疮等。

    虫草属(Cordyceps)是指真菌寄生于昆虫,把虫体变成充满菌丝的僵虫,从僵虫前
    端生出有柄头状或棍棒状的子座,目前已经发现的虫草有400多种,多数都具有很高的药用
    及食用价值,它的生理功效主要有防动脉硬化、降血脂、?;ば哪宰橹驮銮棵庖吡?、抗癌、
    抗菌、抗病等。

    蝼蛄虫草(Gryllotalpa-Cordyceps)是在东北长白山地区发现的新物种,也称为
    朝鲜虫草,该虫草的虫体长约2厘米,草体5厘米左右,呈枯草黄。它是一种真菌与寄主昆虫
    (蝼蛄)的虫菌复合体,菌体寄生于蝼蛄体内,吸取其营养,虫身体内存满菌丝而死,菌丝从
    其头、腹部等部位长出,形似草,故称之为蝼蛄虫草。

    虫草中主要含有的活性成分包括肌苷、腺苷等核苷类物质、虫草酸(D-甘露醇)和
    氨基酸等。核苷类物质能通过与嘌呤或嘧啶受体物质的结合参与到人体众多生理过程的调
    节中,而且,它作为形成核酸的前体物质,还能够帮助提高人体的免疫能力。现代许多研究
    均表明虫草素是虫草所特有的有效成分,且具有许多生物活性,氨基酸是构成生物体蛋白
    质并同生命活动有关的最基本的物质,也是生物体内不可缺少的营养成分之一;基于这些
    特殊的生理活性,使得现有技术中对虫草的核苷类物质、虫草酸和氨基酸的提取、纯化、检
    测方法成为研究重点。

    目前对两种虫草的研究较多,一种是冬虫夏草,另一种是蛹虫草。衡量虫草质量的
    重要指标是有效成分虫草酸和虫草核苷,目前这两种主要有效成分的测定方法很多,且都
    已比较成熟;但不同的虫草的成分及不同成分之间的含量也有较大的区别,所用到的检测
    方法也都有所不同。现有技术中并没有蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷,提供一种蝼蛄虫草
    活性成分定量分析检测方法。

    本发明还提供一种蝼蛄虫草中核苷类物质的定量分析检测方法。

    本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:

    一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法,包括以下步骤:

    (1)原料处理:将干净的蝼蛄虫草的虫体和草体分离,分别研磨成虫粉和草粉;

    (2)样品储备液的制备:将虫粉和草粉溶解后,在30~70℃下超声提取1~4h,超声的频
    率为20~40Hz,离心取上清液获得样品储备液;

    (3)虫草酸的含量测定:

    (4)核苷的含量测定:利用HPLC进行测定,所述HPLC的条件为:0min,甲醇-水体积比为
    5:95;3min,甲醇-水体积比为10:90;8min,乙腈-水体积比为10:90;10min,甲醇-水体积比
    为5:95;

    色谱柱:Apollo C18柱(250mm×4.6mm,5um);

    检测波长:260nm;

    柱温:35℃;

    流速:1mL/min;

    进样量:10uL;

    (5)氨基酸的含量测定。

    优选地,步骤(2)还可具体分为虫粉和草粉的样品储备液的制备,若是虫粉,即将
    虫粉在50℃下,0~30Hz超声提取2h;若是草粉,即将草粉在60℃下30~40Hz超声提取3h。

    本发明还提供一种蝼蛄虫草中核苷类物质的定量分析检测方法,是利用HPLC进行
    测定,所述HPLC的条件为:

    流动相:0min,甲醇-水体积比为5:95;3min,甲醇-水体积比为10:90;8min,乙腈-水体
    积比为10:90;10min,甲醇-水体积比为5:95;

    色谱柱:Apollo C18柱(250mm×4.6mm,5um);

    检测波长:260nm;

    柱温:35℃;

    流速:1mL/min;

    进样量:10uL。

    本发明针对蝼蛄虫草,将虫体与草体分别检测,利于了解虫体及草体各自的活性
    含量,并设置适宜的提取条件,减少长时间高频率超声对有效成分的损失,以提高蝼蛄虫草
    的应用价值最大化。

    与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

    本发明提供了一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法,根据蝼蛄虫草的特性,从样
    品提取开始,分别优化出测定虫草酸、核苷和氨基酸的方法,最终获得了既快速准确,又节
    约成本测定条件,该方法的检测准确度高,样品添加回收率高,从而为蝼蛄虫草的检测建立
    了体系,填补了蝼蛄虫草活性成分检测的空白,具有广泛的应用价值。

    附图说明

    图1为D-甘露醇标准曲线。

    图2到图5分别是腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷的标准曲线图。

    图6为蝼蛄虫草-虫粉的腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷HPLC图。

    图7为蝼蛄虫草-草粉的腺苷、鸟苷、尿苷、肌苷HPLC图。

    具体实施方式

    下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本
    发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的简单
    修改或替换,均属于本发明的范围;若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术
    人员所熟知的常规手段。

    实施例1

    一、原料处理

    将蝼蛄虫草用洁净软毛刷轻刷,除去表面泥沙,用剪刀将虫体和草体分离,分别称取虫
    体和草体0.6~0.7g,置于平面皿中,烘箱40℃,24h烘干称量干重。虫体和草体分开进行液
    氮研磨,将研磨好的粉末保存于封口带中,置于4℃冰箱保存,计算含水率,结果显示虫体和
    草体的含水量都不多,且二者差别不大(表1)。

    表1 蝼蛄虫草含水率


    二、样品储备液的制备

    分别取蝼蛄虫草-虫粉,蝼蛄虫草-草粉供试品0.5g,置于50mL离心管中,用超纯水水
    溶,蝼蛄虫草-虫粉在50℃下0~30 Hz超声提取2h,草粉在60℃下30~40Hz超声提取3h。用
    超纯水补足失重,离心(4000r,5min),取上清液于50mL离心管,再离心(4000r,5min),取上
    清液于100mL容量瓶中定容,置于100mL棕色储液瓶,4℃冰箱保存,即为样品储备液。

    实施例2 虫草酸含量测定

    1、标准曲线制作

    准确称取 0.15 g D-甘露醇标准品于50 mL棕色容量瓶中,以超纯水溶解并定容,摇
    匀。制成虫草酸标准溶液储备液(浓度为3000.0 μg/mL)。用超纯水将标准溶液储备液梯度
    稀释成浓度为 15、30、45 、60、75和 90 μg/mL的标准工作溶液,取标准工作溶液1 mL加入
    试管中,空白对照管加蒸馏水1 mL,然后每管加入0.015 mol/L高碘酸钾液1 mL,混匀,室温
    放置10min,每个试管加0.1%鼠李糖2 mL,充分混匀后,加入Nash试剂4 mL,53℃水浴保温15
    min,即刻冷却,分光光度计413 nm处测光吸收,根据甘露醇标准品的光吸收计算样品中的
    甘露醇含量。

    得出标准曲线的R2等于0.9976,试验数据与拟合函数之间的吻合程度较高。结果
    准确度高(图1,表2)。


    2、方法验证

    以已知含量北虫草为添加基质,按样品中D-甘露醇含量的80%、100%和 120%(以实际操
    作为准)三个水平进行添加回收试验。每个添加水平重复三次试验。

    准确度系指测定的结果与真实值相符合的程度,可用来反映系统误差的大小,一
    般通过加样回收率实验来考察。通过回收率实验,可以检查分析过程中测试成分的损失情
    况,从而评价此分析方法的可靠性和准确度。在加样回收率实验中应该注意对照品的加入
    量,被测成分含有量与对照的加入量比值应该适当:过小则引起较大的相对误差,过大则干
    扰成分。同时应该保证次定量分析过程中,测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正比关
    系,即控制对照的加入量与供试品中被测成分的量之和必须在标准曲线线性范围之内。

    由表3可知,D-甘露醇的添加回收率介于91.43~103.05%,该方法下的添加回收效
    果均较好,能够满足分析要求。


    3、样品测定

    取步骤二制备的储备液过0.45μm微孔滤膜,取0.03 mL,补水至1 mL,计算D-甘露醇含
    量,结果如表4,表4的结果是样品湿重情况下的D-甘露醇含量,其含量草粉中高于虫粉,但
    都处于高含量水平。


    实施例3 核苷类化合物含量测定

    1、标准品溶液制备

    分别准确称取1 mg标准品(腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷四种核苷)于棕色进样瓶中,加入1
    mL甲醇,涡旋混匀,制成单标储备液。各取0.2 mL单标储液于1 mL棕色进样瓶,涡旋混匀,制
    成混标储备液,置于4℃冰箱保存。

    2、HPLC条件的选择

    文献报道腺苷、肌苷、尿苷、鸟苷四种核苷在250~260 nm的波长范围内吸收峰最显著。
    于是将标准混合液分别在200~400 nm的范围内以二极管阵列检测器进行扫描。最终吸收
    峰最显著波长为260 nm。

    本文采用纯水提取方法,通过改变流动相中水和乙腈的比例随时间的变化规律,
    使 4 种标准物质的混合溶液达到分离。最终确定梯度洗脱程序。

    通过反复试验,调整流动相梯度,优化色谱条件,最终得到了既快速准确,又节约
    成本的色谱条件(表5)。


    HPLC条件:色谱柱:Apollo C18柱(250mm×4.6mm,5um)、检测波长:260nm、柱温:35
    ℃、流速:1mL/min、进样量:10uL。

    3、标准品线性方程

    用单标确定保留时间;用超纯水将混标储备液梯度稀释成系列浓度的标准混合溶液
    (5、10、20、50、100μg/mL),待上样。每个浓度标准混合溶液连续进样 3 次,取平均值计算。

    在上述HPLC条件下4种核苷类标准混合溶液的色谱图如图2到图5。

    4、回收率实验

    以蝼蛄虫草-虫粉和蝼蛄虫草-草粉样品为添加基质,按各样品中各核苷类物质含量的
    50%、100%和150%三个水平进行添加回收试验。称样后添加上定量的标准品,涡旋混匀后室
    温放置8min,之后按上面的提取、检测方法进行含量测定。每个添加水平重复三次试验。

    由表6得蝼蛄虫草-虫粉中肌苷、鸟苷、腺苷和尿苷的平均回收率在86.5~99.7%之
    间,RDS在1.0~6.4%之间。该方法下的回收率效果较好,能够满足分析要求。因此表明该方
    法的准确度可靠。


    5、精密度试验

    取蝼蛄虫草-虫粉提取液和蝼蛄虫草-草粉提取液连续进样 5 次,考察标准品和提取
    液中各目标物在出峰时间、峰面积上的差异性。

    由表7可知,样品提取液在进行 HPLC 测定时,无论出峰时间还是峰面积的精密度
    都很好,虫粉和草粉中四种核苷的出峰时间的相对标准偏差(RSD)分别在0.05~0.14%之间
    和0.09~0.23%之间,峰面积的RSD在0.12~0.84%之间和0.11~0.93%之间,说明该方法下
    测定虫草中虫粉和草粉中核苷类物质的精密度都很好。


    6、样品测定

    取步骤二制备的样品储备液,将储备液分别稀释10倍、100倍。再将原储备液和稀释后
    储备液分别过0.45μm微孔滤膜,置于2mL进样瓶中,各做3个平行,上机分析。

    通过计算得出蝼蛄虫草-虫粉含有尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷分别为2.862、0.431、
    2.117、0.1729 mg/g,草粉含有尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷分别为3.532、0.891、3.512、1.39 mg/
    g。结果显示的最终含量是样品湿重时含量。通过比较可以看出草粉中四种核苷的含量明显
    高出虫粉中四种核苷的含量。其中腺苷含量高出近10倍(表8)。从HPLC图谱可以看出,样品
    分离效果良好(图6和图7)。


    实施例4 氨基酸测定

    17种氨基酸测定:按照GB/T 5009.124-2003的方法进行测定。

    通过分析得蝼蛄虫草-虫粉含粗蛋白为50.51%。蝼蛄虫草-草粉含粗蛋白为
    18.92%。都含有天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、缬、蛋、异亮、亮、苯丙、酪、赖、组、胱、半胱、精等17
    种氨基酸,其中以谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、组氨酸含量最高,同时均含有8种人体
    必须氨基酸。且虫粉中氨基酸各指标都明显高于草粉中含量。



    通过以上对蝼蛄虫草虫体和草体中的虫草酸、四种核苷以及氨基酸的定量和定性
    的分析,可以得知蝼蛄虫草虫体和草体中均含大量的核苷,其中草体中的核苷含量要高于
    虫体。同时虫体和草体中还含有大量种类丰富的氨基酸,虫体中氨基酸含量要高于草体。虫
    草酸(D-甘露醇)的含量在虫体和草体也含量较高。因此蝼蛄虫草是具有很高的营养和药用
    价值。

    通过计算得出蝼蛄虫草-虫体中虫草酸含量为10.96%,草体中虫草酸含量为
    12.75%。处于一个较高水平。

       内容来自专利网重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn转载请标明出处

    关于本文
    本文标题:一种蝼蛄虫草活性成分定量分析检测方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6014536.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 浪潮孙丕恕从信息时代到智能时代 人工智能价值将爆发式释放 2019-12-21
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • nba新浪体育直播 即时赔率彩富网 魔兽世界赚钱的副职业好 pk10牛牛计划 nba直播免费哪里看 中国竞彩比分直播360 25选7中奖规则玩法 2011年排列三走势图 皇冠足球指数全讯网 上海天天彩选4开奖查询 安徽十一选五今天 安徽快3怎样计算预测 上海天天彩开奖结果 北京pK10手机开奖记录 吉林时时彩预测 手机赌钱麻将平台