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    重庆时时彩怎样破解: 一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 测定 花生 叶片 茉莉 含量 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611076178.X

    申请日:

    2016.11.30

    公开号:

    CN106404962A

    公开日:

    2017.02.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20161130|||公开
    IPC分类号: G01N30/02 主分类号: G01N30/02
    申请人: 山东省花生研究所
    发明人: 李春娟; 单世华; 张浩; 闫彩霞; 张廷婷; 赵小波; 王娟; 贾伟
    地址: 266000 山东省青岛市李沧区万年泉路126号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611076178.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.06.29|||2017.03.15|||2017.02.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种花生叶片中茉莉酸的检测方法,包括以下步骤:(1)花生叶片样品制备;(2)标准曲线样品制备;(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液;(4)样品的萃取与富集;(5)LC?MS检测条件的建立;(6)样品检测。发明测试方法稳定性高,数据精确,检测结果可靠,化合物分离度较好。本发明方法能够快速检测花生叶中的茉莉酸含量,操作快速,效率高,具有重要的科学意义。

    权利要求书

    1.一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:包括以下步骤:
    (1)花生叶片样品制备;(2)标准曲线样品制备;(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢茉莉
    酸甲醇溶液;(4)样品的萃取与富集;(5)LC-MS检测条件的建立;(6)样品检测。
    2.根据权利要求1所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:包括以下
    步骤:
    (1)取1g花生叶,加入内标200ng DHJA,用液氮研磨;
    研磨物用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离
    心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于15ml离心管中;
    残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min离心
    5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于10ml离心管中,重复此过程1-3次;
    合并以上浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,定溶于1ml80%甲醇中;
    (2)取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,再用10ul注射器分别加入5ng/g、10ng/g、20ng/
    g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA标准品溶液,得到不同浓度的标准样
    品;将标准样品用液氮研磨,再用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后于4℃、9000-
    13000rpm/min离心5-20分钟,然后用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中;
    残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,于4℃、9000-13000rpm/min离心5-20分
    钟,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,重复2-3次;
    合并上述浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,将其定溶于1ml 80%甲醇中;
    (3)配置流动相:95%乙腈+5%水、95%水+5%乙腈以及1‰甲酸+5%乙腈+水的制备,
    分别制备1ppm、100ppm、1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液,制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇
    溶液,制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标;
    (4)样品的萃取与富集;
    (5)质谱条件的建立:使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物;
    色谱条件的建立:使用上述配置的流动相作为分析所用的色谱条件;
    (6)样品检测:用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定其特征子离
    子,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图,然后加入标准品50ng,进行检测。
    3.根据权利要求1所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:所述样品
    检测还包括定量及回收率测定,包括以下步骤:使用内标法,以DHJA作为内标物,每份样品
    加入内标200ngDHJA,用浓度分别为:5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、
    500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,绘制标准曲线;
    分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收率。
    4.根据权利要求1或2所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:所述
    样品采用固相微萃取方法进行萃取与富集,包括以下步骤:
    加2mL超纯水于5mL样瓶中,将样品转移到50mL样瓶中,加入带有磁性的ZZ-SBSE-04-1
    型PES涂层固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h;
    在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将上述固相微萃取搅拌棒放入并封口,然
    后放入超声仪中超声20min进行解吸,取丙酮解吸液待测。
    5.根据权利要求1所述的一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法,其特征在于:还包括花
    生叶干样处理过程,包括以下步骤:
    第一步:向试管中的样品加入1mL甲醇,充分震荡使其溶解;
    第二步:用移液枪转移至2mL PC管中;
    第三步:用离心机13000r离心10分钟;
    第四步:用移液枪吸取上清液,装于2mL样瓶中;
    第五步:用封口膜封口,放在零下20摄氏度保存。

    说明书

    一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法

    技术领域

    本发明涉及测定方法,具体地说是采用固相微萃取-液相色谱-质谱联用测定花生
    叶片茉莉酸含量的方法。

    背景技术

    目前,农药价格昂贵,并且过度使用农药会使害虫的抗药性增加,害虫天敌的数量
    不断减少甚至灭绝,还会造成环境的严重污染,农药的使用必然受到极大的限制,促使科学
    家找到一种方法,将农药用量降到最小化的同时达到抗虫的最佳效果,使农作物高产,高
    质,高营养。

    茉莉酸类物质是一类新型植物激素,能使植物引起多种生理反应,能够通过植物
    体直接或间接诱导产生并积累,能够促进相关基因表达,诱导产生各种有特殊功能的有机
    物,例如某些蛋白质,达到抗击病虫害的目的。

    茉莉酸是茉莉酸类化合物及其衍生物的前体,是一种内源信号分子,建立一种灵
    敏、稳定的花生叶中茉莉酸定量分析方法十分重要,利用高效液相色谱-质谱联用对花生叶
    样品进行分析,找出稳定的前处理纯化方法,建立起高效、稳定的花生叶内源茉莉酸的定量
    检测方法,并对方法进行优化,找到不同基因改造处理后花生叶中茉莉酸含量规律,对花生
    研究抗虫具有重要的科学意义。

    发明内容

    本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足,提供一种测定花生叶片茉
    莉酸含量的方法。

    本发明为实现上述目的采用的技术方案是:一种测定花生叶片茉莉酸含量的方
    法,包括以下步骤:

    (1)花生叶片样品制备;(2)标准曲线样品制备;(3)制备流动相以及茉莉酸、二氢
    茉莉酸甲醇溶液;(4)样品的萃取与富集;(5)LC-MS检测条件的建立;(6)样品检测。

    作为优选,本发明包括以下步骤:

    (1)取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,用液氮研磨;

    研磨物用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/
    min离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于15ml离心管中;

    残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后在0-4℃、9000-13000rpm/min
    离心5-20分钟,用移液枪移取2.5-5mL上清液于10ml离心管中,重复此过程1-3次;

    合并以上浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,定溶于1ml 80%甲醇中。

    (2)取1g花生叶,加入内标200ngDHJA,再用10ul注射器分别加入5ng/g、10ng/g、
    20ng/g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA标准品溶液,得到不同浓度的标
    准样品;将标准样品用液氮研磨,再用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,之后于4℃、
    9000-13000rpm/min离心5-20分钟,然后用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中;

    残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,于4℃、9000-13000rpm/min离心5-
    20分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,重复2-3次;

    合并上述浸提的上清液,于4℃条件下氮气吹干,将其定溶于1ml 80%甲醇中。

    (3)配置流动相:95%乙腈+5%水、95%水+5%乙腈以及1‰甲酸+5%乙腈+水的制
    备,分别制备1ppm、100ppm、1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液,制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲
    醇溶液,制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标;

    (4)样品的萃取与富集;

    (5)质谱条件的建立:使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物;

    色谱条件的建立:使用上述配置的流动相作为分析所用的色谱条件;

    (6)样品检测:用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定其特征子
    离子,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色谱图,然后加入标准品50ng,进行检
    测。

    更进一步的是:所述样品检测还包括定量及回收率测定,包括以下步骤:使用内标
    法,以DHJA作为内标物,每份样品加入内标200ngDHJA,用浓度分别为:5ppb(ng/g)、10ppb、
    20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,绘制标准曲线;

    分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收
    率。

    更进一步的是,所述样品的萃取与富集包括以下步骤:

    加2mL超纯水于5mL样瓶中,将样品转移到50mL样瓶中,加入带有磁性的ZZ-SBSE-
    04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h;

    在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将上述固相微萃取搅拌棒放入并封
    口,然后放入超声仪中超声20min进行解吸。取丙酮解吸液待测。

    上述中,本发明还包括花生叶干样处理过程,包括以下步骤:

    第一步:向试管中的样品加入1mL甲醇,充分震荡使其溶解;

    第二步:用移液枪转移至2mL PC管中;

    第三步:用离心机13000r离心10分钟;

    第四步:用移液枪吸取上清液,装于2mL样瓶中;

    第五步:用封口膜封口,放在零下20摄氏度保存。

    本发明优点在于:本发明测试方法稳定性高,数据精确,检测结果可靠,化合物分
    离度较好。本发明方法能够快速检测花生叶中的茉莉酸含量,操作快速,效率高。通过检测
    花生叶中茉莉酸含量,科研人员对花生的抗虫能力、生长过程中农药用量、产量甚至环境的
    ?;?、恢复生态平衡、?;ど锒嘌缘冉邢低车难芯?,其具有重要的科学意义。

    附图说明

    图1采用流动相体系(a)时的液相色谱图;

    图2茉莉酸标准曲线;

    图3 JH1012ck浓度-时间曲线;

    图4 JH1012han浓度-时间曲线;

    图5 J11han浓度-时间曲线;

    具体实施方式

    下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

    本实施例使用安捷伦公司生产的型号为(Agilent)1290-6430.的液相色谱-三重
    四级杆质谱联用仪;Thermo公司生产的2.1mm×150mm×5μm Accucore XL C18色谱柱;安捷
    伦生产的2.1mm×100mm×1.8μm ZORBAX SB-Aq色谱柱;Mettle-toledo公司生产的型号为
    EL204-IC的电子天平;sigma公司生产的型号为1-14的小型离心机;90014-S-B手套;
    eppendorf、smartpipette型移液枪;江苏金坛市环宇科学仪器厂生产的型号为CJJ-931的
    数显四联恒温磁力搅拌器;上海思博明生产的Vortex-Genie-2型小型漩涡振荡器;昆山生
    产的5200E单频超声波清洗器。固相微萃取搅拌棒采用青岛贞正分析仪器有限公司生产的
    ZZ-SBSE-04-1型PES涂层固相微萃取搅拌棒。

    选用两种花生品种,分别为J11、JH1012,利用两种不同的基因改造方法,对花生进
    行基因改造,分别编号为J11han、JH1012han、JH1012ck,每个实验样品做三个平行实验样
    品。通过本发明检测J11han,JH1012han,JH1012ck实验样品中的茉莉酸含量。

    1.1样品制备及分析方案:

    第一步:取1g花生叶(每份样品做3份平行实验),加入内标200ngDHJA(用10ul注射
    器加入2ul的100ug/ml内标溶液)。

    第二步:用液氮研磨。

    第三步:研磨液用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心
    10分钟,用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。

    第四步:残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心
    10min,用移液枪移取2.5mL上清液于10ml离心管中,此过程重复1次。

    第五步:合并第三、四步3次浸提的上清液,4℃条件下氮气吹干。

    第六步:定溶于1ml 80%甲醇中。

    1.2标准曲线样品制备、分析方案:

    第一步:取1g花生叶(每份样品做3份平行实验),加入内标200ngDHJA(用10ul注射
    器加入2ul的100ug/ml内标溶液),用10ul注射器分别加入不同量的JA标准品溶液,得到不
    同浓度的标准样品:

    5ng/g标准样品(加入1ug/ml,5ul)

    10ng/g标准样品(加入1ug/ml,10ul)

    20ng/g标准样品(加入10ug/ml,2ul)

    50ng/g标准样品(加入10ug/ml,5ul)

    100ng/g标准样品(加入10ug/ml,10ul)

    200ng/g标准样品(加入100ug/ml,2ul)

    500ng/g标准样品(加入100ug/ml,5ul)

    1000ng/g标准样品(加入100ug/ml,10ul)

    第二步:液氮研磨。

    第三步:用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心10分钟,
    用移液枪移取2.5mL上清液于15ml离心管中。

    第四步:残渣用3mL冷80%甲醇于4℃冰箱中浸泡过夜,4℃、13000rpm/min离心
    10min,用移液枪移取2.5mL上清液放入10ml离心管中,此过程重复1次。

    第五步:合并第三、四步3次浸提的上清液,4℃条件下氮气吹干。

    第六步:定溶于1ml 80%甲醇中。

    1.3制备流动相

    95%乙腈+5%水:

    第一步:用500ml量筒取475ml乙腈于流动相瓶中。

    第二步:用100ml量筒取25ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中,充分震荡后放入超声波
    清洗器中超声20min。

    95%水+5%乙腈

    第一步:用500ml量筒取475ml娃哈哈纯净水于流动相瓶中。

    第二步:用100ml量筒取25ml乙腈于流动相瓶中,充分震荡后再用超声波清洗器中
    清洗二十分钟。

    1‰甲酸+5%乙腈+水:

    用移液枪取0.5mL甲酸,用100ml量筒取25ml乙腈,用500ml量筒取474.5ml娃哈哈
    纯净水于流动相瓶中,充分震荡后再用超声波清洗器中清洗二十分钟。

    制备完成流动相后将量筒晾干,倒置,防止污染。

    1.4制备茉莉酸和/或二氢茉莉酸甲醇溶液

    制备1000ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

    第一步:用电子天平称取10μgH2JA于100mL量筒中。

    第二步:用甲醇定容,小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色瓶中。

    第三步:封口放于-20℃保存。

    制备100ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

    第一步:用移液枪移取1000ppm二氢茉莉酸溶液于20ml样瓶中(分9次,每次1ml甲
    醇等比例稀释),用振荡器混匀。

    第二步:用移液枪移取1ml装入2ml样瓶中小型漩涡振荡器充分震荡后转移至棕色
    瓶中。

    第三步:封口放于-20℃保存。

    制备10ppm茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液

    方法同上,封口膜封口,-20℃保存。

    制备1ppm二氢茉莉酸甲醇溶液

    方法同上,封口膜封口,-20℃保存。

    制备500ppb茉莉酸、二氢茉莉酸甲醇溶液混标

    方法同上,封口膜封口,-20℃保存。

    1.5样品的萃取与富集

    采用固相微萃取搅拌棒进行萃取富集。方法如下:

    第一步:加2mL超纯水于5mL样瓶中。

    第二步:将样品转移到50mL样瓶中。

    第三步:加入固相微萃取搅拌棒搅拌1.5h。

    第四步:在2mL样瓶中加入内套管,并加入250μL丙酮,将第四步搅拌棒放入,封口。

    第五步:放入超声仪中超声20min,进行解吸,解吸液待测

    1.6质谱条件的建立

    试验使用二氢茉莉酸作为茉莉酸的内标物。分别使用10ppm茉莉酸和二氢茉莉酸,
    再分别于正、负电离模式下,分别确定茉莉酸和二氢茉莉酸的母离子分子量,并选择定量子
    离子。

    1.7色谱条件的建立

    比较流动相系统,选出上述配置的流动相中能使茉莉酸、二氢茉莉酸出峰效果最
    好的流动相系统作为分析所用的色谱条件。

    1.8样品的定性检测

    用1ppm茉莉酸和1ppm二氢茉莉酸进行碎片离子扫描,确定它们的特征子离子。在
    已经确定的离子模式(负离子模式)条件下,利用三重四级杆获取茉莉酸母离子209m/z的色
    谱图,确定分离效果。

    然后加入标准品50ng,高效液相色谱检测,确定保留时间,同时用质谱得到特征子
    离子。

    1.9定量及回收率测定

    定量使用内标法,以DHJA作为内标物,每份样品加入内标200ngDHJA,用浓度分别
    为:5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液,
    绘制标准曲线。

    分别设定5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,进行HPLC-MS检测,计算回收
    率。

    本实验添加二氢茉莉酸为内标,为排除花生叶中原本存在二氢茉莉酸形成干扰,
    设置六个空白花生叶样品进行HPLC-MS检测。

    2.0实验数据的分析

    2.0.1多反应离子监测(MRM)参数优化

    采用Optimizer软件自动优化MS检测条件,结果见表1:

    表1 MRM检测参数设置



    本实施例检测使用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18,2.1mm×100mm
    ×1.8μm)分离,可将茉莉酸与相邻干扰峰完全分离。本实施例质谱用负离子模式对茉莉酸
    (JA)和二氢茉莉酸(DHJA)检测,灵敏度较高,而且干扰峰少。

    流动相的选择

    由于茉莉酸和二氢茉莉酸为酸性化合物,采用C18色谱柱进行分离,通常在流动相
    加入0.1%甲酸,用于增加目标组分在色谱柱固定相上的保留时间,从而改善分离度。

    采用超高压液相色谱柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18 2.1mm×100mm×1.8μm),对
    比流动相体系(a)A:水相(含0.1%甲酸和5%乙腈),B:乙腈相(含5%水)和流动相体系(b)
    A:水相(含5%乙腈),B:乙腈相(含5%水)的分离效果,如图1所示。结果表明:(1)采用流动
    相体系(a)时,JA和DHJA的保留时间均较流动相体系(b)有所增加,然而采用流动相体系(b)
    时,JA和DHJA也可以达到基线分离;(2)采用流动相体系(a)时,JA和DHJA的灵敏度有所下
    降,原因为当MS采用负离子检测模式时,流动相体系(a)中的甲酸会降低JA和DHJA的离子化
    效率,导致灵敏度下降。综合考虑,本检测采用不加甲酸的流动相体系(b)。

    从图1中得出流动相梯度最佳为:0~8分钟,A:B比值变化情况为4:1~1:9;8~13
    分钟,A:B=1:9;13~14分钟,A:B比值变化情况为1:9~4:1;14~20分钟,A:B=4:1。

    2.0.2标准曲线绘制

    利用八种不同浓度加内标的茉莉酸样品,以JA浓度为横坐标,JA峰面积与DHJA峰
    面积平均值之比为纵坐标,绘制标准曲线,如图2所示,R2达到0.9988。

    本发明方法评价结果,以信噪比(S/N)为3确定茉莉酸的检出限(LOD)如表2所示:

    表2 方法评价结果


    数据明显呈线性相关,可以根据标准曲线对花生叶样品中的茉莉酸进行定量。

    2.0.3加标回收率

    设置5ppb、10ppb、100ppb三个标准品添加水平,花生叶内源茉莉酸的平均添加回
    收率在83.26%~92.57%,表明本实验检测的可靠性较高。

    2.0.4实验数据

    空白样品检测结果

    对六个空白样品进行检测的结果,其MRM色谱图显示出空白样品中均不含有二氢
    茉莉酸,此方法适合用于花生叶的检测,并且大大降低了检测成本。

    本实施例样品检测结果

    分别对JH1012ck,JH1012han,J11han三种类型共48个样品编号进样检测,测得每
    个样品中茉莉酸的实际浓度,并计算平均浓度,结果见表3:

    表3 实际花生叶中茉莉酸检测结果



    图3是JH1012ck浓度-时间曲线图,由图3可知经过此种基因处理方法处理花生
    叶---JH1012ck中的茉莉酸含量,从12小时开始递减,36小时达到最低浓度,之后又逐渐升
    高。图4是JH1012han浓度-时间曲线图,由图4可知经过此种基因处理方法处理花生叶—
    JH1012han中茉莉酸含量,随处理时间变化没有明显规律,但在处理12小时时达到最低浓
    度,几乎为零,之后逐渐升高。图5是J11han浓度-时间曲线,由图5可知经过此种基因处理方
    法处理花生叶—J11han中茉莉酸含量,先随处理时间的增长而减少,在处理12小时时达到
    最低点,几乎为零,之后逐渐升高。对比以上两种处理的样品可知,JH1012han和J11han花生
    叶中茉莉酸含量在处理12小时左右会达到最低值。

    表4所示,为本实施例1、2、3以及对照组的数据对比数据。其本实施例1、2、3的不同
    之处仅仅是样品处理中的固相微萃取搅拌棒涂层种类的不同,其余步骤及试剂均相同。而
    对照组没有选择萃取的过程。以上的最低检出限经过测量最高为4,最低为0.5。而对照组的
    最低检出限是40,与实施例对比明显。

    表4 最低检出限数据比较


    通过对上述花生叶片中的茉莉酸含量,科研人员可进行数据分析及结果推算,给
    科研人员带来极大的方便。并且,采用上述检测方法,实验数据准确,检测方法科学合理。

    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人
    员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为
    本发明的?;し段?。

    关于本文
    本文标题:一种测定花生叶片茉莉酸含量的方法.pdf
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