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    玩重庆时时彩怎样防骗: 一种冰结构蛋白的冰晶观察方法.pdf

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    一种 结构 蛋白 冰晶 观察 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610726903.7

    申请日:

    2016.08.25

    公开号:

    CN106404614A

    公开日:

    2017.02.15

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 15/00申请日:20160825|||公开
    IPC分类号: G01N15/00 主分类号: G01N15/00
    申请人: 哈尔滨商业大学
    发明人: 曲敏; 刘羽佳; 董正婷; 陈凤莲; 鲍欢
    地址: 150076 黑龙江省哈尔滨市道里区通达街138号
    优先权:
    专利代理机构: 哈尔滨市松花江专利商标事务所 23109 代理人: 侯静
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610726903.7

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.03.15|||2017.02.15

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,涉及一种冰结构蛋白的冰晶观察方法。本发明为了解决现冰结构蛋白溶液冰晶形态的观察只能通过生物低温显微镜进行,成本高的问题。本发明冰晶观察方法:一、取冰结构蛋白粉,溶解于水或磷酸盐缓冲溶液中,离心,取30uL滴加于血球计数板的凹槽内,并置于冰箱冷冻;二、取出冷冻的血球计数板,转移至于普通光学显微镜下在40×镜观察,拍照。本发明利用冰结构蛋白具有吸附冰晶表面改变冰晶形态的特点并结合普通光学显微镜,很好地观察到了冰结构蛋白的冰晶形态,方法简便,解决了必须借助于专用仪器设备如低温显微镜观察冰晶的难题,克服了仪器设备昂贵,检测方法复杂的缺点。本发明适用于冰结构蛋白的冰晶观察。

    权利要求书

    1.一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于该按以下步骤进行:
    一、样品的准备
    取冰结构蛋白粉,溶解于水或磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为10~30mg/mL的冰结构蛋
    白溶液,离心处理,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18℃冰箱冷冻20~
    30min;
    二、冰晶的观察
    从冰箱中取出冷冻的血球计数板,在5~10s内转移至于普通光学显微镜下,首先在10
    ×镜下,调节光源,寻找目标物,待目标物清晰,转40×镜观察,拍照。
    2.根据权利要求1所述的一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于:步骤一所述磷
    酸盐缓冲溶液的pH为6.0~8.5,磷酸根浓度为10~150mmol/L。
    3.根据权利要求1所述的一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于:步骤一所述磷
    酸盐缓冲溶液的pH为6.0~8.5,磷酸根浓度为40mmol/L。
    4.根据权利要求1所述的一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于:步骤一所述离
    心处理时,离心机的转速为4000~6000r/min。
    5.根据权利要求1所述的一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于:步骤一所述离
    心处理时,离心时间为10~15min。
    6.根据权利要求1所述的一种冰结构蛋白的冰晶观察方法,其特征在于:步骤一所述取
    冰结构蛋白粉,溶解于磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为30mg/mL的冰结构蛋白溶液,离心处
    理,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18℃冰箱冷冻20min。

    说明书

    一种冰结构蛋白的冰晶观察方法

    技术领域

    本发明涉及一种冰结构蛋白的冰晶观察方法。

    背景技术

    冰结构蛋白(ice structuring proteins,ISPs),又称为不冻蛋白、抗冻蛋白
    (antifreeze proteins,AFPs),是一类由某些鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌为抵抗外界环
    境应激反应所产生的多肽,具有阻止冰晶形成、修饰冰晶形态及抑制重结晶的能力,它具有
    一定的热滞活性,即能够以非依数性形式降低溶液的冰点,但对熔点的影响较小,从而使溶
    液的冰点与熔点之间出现差值。冰结构蛋白特有的性质保证生物在低温条件下得以生存。
    2006年,我国卫生部公布冰结构蛋白可作为新型食品添加剂应用于冷藏食品中;冰结构蛋
    白具有吸附冰晶表面改变冰晶形态的特点,可使冰晶产生各种不同形状,且大小不一,主要
    形态为四边形、五边形、六角形、菱形、椭圆形、梭形、棒状和针状等。

    现有技术对冰结构蛋白溶液冰晶形态的观察一般采用生物低温显微镜技术或改
    进的低温显微镜技术。低温显微镜是利用液态乙烷来快速冷冻蛋白溶液,仪器及其维护成
    本高昂,限制了低温显微镜的推广。改进的低温显微技术,是将其冷源系统采用液氮冷却;
    或是在显微镜上加装独立的温度控制冷热台装置;或改进普通光学显微镜为控温载玻片。
    利用以上技术观察冰结构蛋白溶液的冰晶时,仪器设备繁琐受限,成本高。

    发明内容

    本发明为了解决现有技术中冰结构蛋白溶液冰晶形态的观察只能通过生物低温
    显微镜进行,设备繁琐受限,成本高的问题,提出了一种冰结构蛋白的冰晶观察方法。

    本发明冰结构蛋白的冰晶观察方法按以下步骤进行:

    一、样品的准备

    取冰结构蛋白粉,溶解于水或磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为10~30mg/mL的冰结
    构蛋白溶液,离心处理,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18℃冰箱冷冻20~
    30min;所述磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0~8.5,磷酸根浓度为10~150mmol/L。

    二、冰晶的观察

    从冰箱中取出冷冻的血球计数板,在5~10s内转移至于普通光学显微镜下,首先
    在10×镜下,调节光源,寻找目标物,待目标物清晰,转40×镜观察,拍照;其中,由于冰结构
    蛋白大多是白色略带颜色,其溶液是无色或浅色形成,在观察冰晶形态时,要适当调低光源
    亮度。

    本发明具备以下有益效果:

    1、冰结构蛋白具有吸附冰晶表面改变冰晶形态的特点,可使冰晶产生各种不同形
    状,且大小不一,主要形态为四边形、五边形、六角形、菱形、椭圆形、梭形、棒状和针状等;本
    发明利用该特点并结合普通光学显微镜,很好地观察到了冰结构蛋白的冰晶形态,方法简
    便,使用普通光学显微镜即可进行冰晶观察,观察效果好,解决了必须借助于专用仪器设备
    如低温显微镜观察冰晶的难题,克服了仪器设备昂贵,检测方法复杂的缺点;

    2、本发明方法中采用的血球计数板为优质厚玻璃制成,玻璃载片厚、凹槽深,利用
    血球计数板观察液体的冰晶形态,便于室温下保持冰冻液体的温度,有利于观察;

    3、氯化钠和蔗糖是常用的冷冻?;ぜ?。氯化钠和蔗糖溶液的冰晶形态特点是冰晶
    小、数量多,而水的冰晶非常大,这些都是常见的冰晶形态;本发明观察时利用氯化钠、蔗糖
    和水进行对照是可以验证冰结构蛋白冰晶的形态丰富多样,对冰晶形态的修饰作用显著,
    同时也是对本发明实用性和冰晶观察结果的验证;

    4、冰结构蛋白的抗冻活性特性包括修饰冰晶形态、数量及重结晶形态,利用本发
    明方法可以应用普通光学显微镜对其抗冻活性进行鉴定,并且鉴定结果真实可靠,准确性
    与低温显微镜相同;

    5、利用本发明冰晶观察方法可以了解液体溶液的固化过程,在此过程中冰晶的形
    成与生长,冰晶的再结晶冻结过程中冰晶的生长属性和生长机理,掌握冰晶的形态与冻结
    过程。

    附图说明

    图1为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈五边形或梭形的冰晶形态40x显微照片;

    图2为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈柱形的冰晶形态40x显微照片;

    图3为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈五边形的冰晶形态40x显微照片;

    图4为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形的冰晶形态40x显微照片;

    图5为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形的冰晶形态的另一张40x显微照
    片;

    图6为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈三边形的冰晶形态40x显微照片;

    图7为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈六棱锥形的冰晶形态40x显微照片;

    图8为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形或五边形的冰晶形态40x显微照
    片;

    图9为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈六边形的冰晶形态40x显微照片;

    图10为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形或六边形的冰晶形态40x显微照
    片;

    图11为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈六棱锥形的冰晶形态40x显微照片;

    图12为实施例1水中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;

    图13为实施例1水中呈梭形的冰晶形态40x显微照片;

    图14为实施例1蔗糖溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;

    图15为实施例1蔗糖溶液中呈圆形的冰晶形态的另一张40x显微照片;

    图16为实施例1NaCl溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;

    图17为实施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形态40x显微照片;

    图18为实施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形态的另一张40x显微照片;

    图19为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形态40x显微照片;

    图20为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形态40x显
    微照片;

    图21为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈梭形的冰晶形态40x显微照片;

    图22为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;

    图23为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈棒状的冰晶形态40x显微照片。

    具体实施方式:

    本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的
    任意合理组合。

    具体实施方式一:本实施方式冰结构蛋白的冰晶观察方法按以下步骤进行:

    一、样品的准备

    取冰结构蛋白粉,溶解于水或磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为10~30mg/mL的冰结
    构蛋白溶液,离心处理,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18℃冰箱冷冻20~
    30min;

    二、冰晶的观察

    从冰箱中取出冷冻的血球计数板,在5~10s内转移至于普通光学显微镜下,首先
    在10×镜下,调节光源,寻找目标物,待目标物清晰,转40×镜观察,拍照;其中,由于冰结构
    蛋白大多是白色略带颜色,其溶液是无色或浅色形成,在观察冰晶形态时,要适当调低光源
    亮度。

    本实施方式具备以下有益效果:

    1、冰结构蛋白具有吸附冰晶表面改变冰晶形态的特点,可使冰晶产生各种不同形
    状,且大小不一,主要形态为四边形、五边形、六角形、菱形、椭圆形、梭形、棒状和针状等;本
    实施方式利用该特点并结合普通光学显微镜,很好地观察到了冰结构蛋白的冰晶形态,方
    法简便,使用普通光学显微镜即可进行冰晶观察,观察效果好,解决了必须借助于专用仪器
    设备如低温显微镜观察冰晶的难题,克服了仪器设备昂贵,检测方法复杂的缺点;

    2、本实施方式方法中采用的血球计数板为优质厚玻璃制成,玻璃载片厚、凹槽深,
    利用血球计数板观察液体的冰晶形态,便于室温下保持冰冻液体的温度,有利于观察;

    3、氯化钠和蔗糖是常用的冷冻?;ぜ?。氯化钠和蔗糖溶液的冰晶形态特点是冰晶
    小、数量多,而水的冰晶非常大,这些都是常见的冰晶形态;本实施方式观察时利用氯化钠、
    蔗糖和水进行对照是可以验证冰结构蛋白冰晶的形态丰富多样,对冰晶形态的修饰作用显
    著,同时也是对本实施方式实用性和冰晶观察结果的验证;

    4、冰结构蛋白的抗冻活性特性包括修饰冰晶形态、数量及重结晶形态,利用本实
    施方式方法可以应用普通光学显微镜对其抗冻活性进行鉴定,并且鉴定结果真实可靠,准
    确性与低温显微镜相同;

    5、利用本实施方式冰晶观察方法可以了解液体溶液的固化过程,在此过程中冰晶
    的形成与生长,冰晶的再结晶冻结过程中冰晶的生长属性和生长机理,掌握冰晶的形态与
    冻结过程。

    具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤一所述磷酸盐缓
    冲溶液的pH为6.0~8.5,磷酸根浓度为10~150mmol/L。其他步骤和参数与具体实施方式一
    相同。

    具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:步骤一所述磷酸
    盐缓冲溶液的pH为6.0~8.5,磷酸根浓度为40mmol/L。其他步骤和参数与具体实施方式一
    或二相同。

    具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:步骤一所述
    离心处理时,离心机的转速为4000~6000r/min。其他步骤和参数与具体实施方式一至三之
    一相同。

    具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:步骤一所述
    离心处理时,离心时间为10~15min。其他步骤和参数与具体实施方式一至四之一相同。

    具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:步骤一所述
    取冰结构蛋白粉,溶解于磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为30mg/mL的冰结构蛋白溶液,离心
    处理,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18℃冰箱冷冻20min。其他步骤和参数
    与具体实施方式一至五之一相同。

    实施例1

    本实施例苜蓿冰结构蛋白的冰晶观察方法按以下步骤进行:

    一、样品的准备

    取苜蓿冰结构蛋白粉,溶解于水或磷酸盐缓冲溶液中,配成浓度为30mg/mL的冰结
    构蛋白溶液,于4000r/min下离心10min,用移液枪取30μL上清液置于血球计数板上,于-18
    ℃冰箱冷冻20min;所述磷酸盐缓冲溶液的pH为8.0,磷酸根浓度为40mmol/L;

    二、冰晶的观察

    从冰箱中取出冷冻的血球计数板,在10s内转移至于普通光学显微镜下,首先在10
    ×镜下,调节光源,寻找目标物,待目标物清晰,转40×镜观察,拍照;其中,由于冰结构蛋白
    大多是白色略带颜色,其溶液是无色或浅色形成,在观察冰晶形态时,要适当调低光源亮
    度。

    取水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麦冰结构蛋
    白溶液作为对照,将水、30mg/mL的NaCl溶液、30mg/mL的蔗糖溶液和30mg/mL的寒地冬小麦
    冰结构蛋白溶液分别置于-18℃冰箱冷冻20min;然后置于40×光学显微镜下观察并拍照;

    本实施例制备的苜蓿冰结构蛋白溶液的冰晶形态40x显微照片如图1~11所示;其
    中,图1为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈五边形或梭形的冰晶形态40x显微照片;图2为
    实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈柱形的冰晶形态40x显微照片;图3为实施例1苜蓿冰结构
    蛋白溶液中呈五边形的冰晶形态40x显微照片;图4为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四
    边形的冰晶形态40x显微照片;图5为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形的冰晶形态
    的另一张40x显微照片;图6为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈三边形的冰晶形态40x显微
    照片;图7为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈六棱锥形的冰晶形态40x显微照片;图8为实
    施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈四边形或五边形的冰晶形态40x显微照片;图9为实施例1苜
    蓿冰结构蛋白溶液中呈六边形的冰晶形态40x显微照片;图10为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶
    液中呈四边形或六边形的冰晶形态40x显微照片;图11为实施例1苜蓿冰结构蛋白溶液中呈
    六棱锥形的冰晶形态40x显微照片;由图1~11可知,苜蓿蛋白溶液的冰晶体积对比水的冰
    晶体积要小但是比蔗糖溶液冰晶体积大,但冰晶形态丰富,部分是与NaCl冰晶相似的柱形
    冰晶;部分呈梭形、四边形、五边形的冰晶形态、六边形冰晶和立体的六棱锥形的冰晶;

    本实施例获得的水的冰晶形态40x显微照片如图12~13所示;其中,图12为实施例
    1水中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;图13为实施例1水中呈梭形的冰晶形态40x显微照
    片;由图12~13可知,水的冰晶形态是较大的圆形,排列紧密;

    本实施例获得的蔗糖溶液的冰晶形态40x显微照片如图14~15所示;其中,图14为
    实施例1蔗糖溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;图15为实施例1蔗糖溶液中呈圆形的
    冰晶形态的另一张40x显微照片;由图14~15可知,蔗糖溶液冰晶的体积对比水的冰晶体积
    要很多小,且形态单一,和水的冰晶形态相似,多为圆形;

    本实施例获得的NaCl溶液的冰晶形态40x显微照片如图16~18所示;其中,图16为
    实施例1NaCl溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;图17为实施例1NaCl溶液中呈梭形的
    冰晶形态40x显微照片;图18为实施例1NaCl溶液中呈梭形的冰晶形态的另一张40x显微照
    片;由图16~18可知,NaCl溶液的冰晶体积较小,数量较多,但形态较为单一;

    本实施例获得的寒地冬小麦冰结构蛋白溶的冰晶形态40x显微照片如图19~23所
    示;其中,图19为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈水滴形的冰晶形态40x显微照片;
    图20为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈梭形或水滴形的冰晶形态40x显微照片;图
    21为实施例1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈梭形的冰晶形态40x显微照片;图22为实施例
    1寒地冬小麦冰结构蛋白溶液中呈圆形的冰晶形态40x显微照片;图23为实施例1寒地冬小
    麦冰结构蛋白溶液中呈棒状的冰晶形态40x显微照片。由图19~23可知,寒地冬小麦冰结构
    蛋白溶液的冰晶形态大多呈水滴形和圆形,分布均匀,也出现多边形,短棒形或针形。

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