• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 8
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩龙虎怎么赢: 一种抗RA33抗体IGG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法.pdf

    关 键 词:
    一种 RA33 抗体 IGG 化学 发光 免疫 检测 试剂盒 及其 制备 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201611018775.7

    申请日:

    2016.11.21

    公开号:

    CN106404757A

    公开日:

    2017.02.15

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/76申请日:20161121|||公开
    IPC分类号: G01N21/76; G01N33/577 主分类号: G01N21/76
    申请人: 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
    发明人: 张光辉; 李爽; 张昭; 姜儒; 曾旭玲
    地址: 518057 广东省深圳市南山区南山街道兴海路荔山工业区5栋1-4层
    优先权: 2016.06.30 CN 2016206805668
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611018775.7

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.16|||2017.02.15

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括:RA33抗原包被的磁微粒、鼠抗人IgG单克隆抗体包被的吖啶酯、抗RA33抗体IgG定标品、预激发液、激发液。另外本发明还公开了一种抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒与现有试剂盒相比操作简便,灵敏度高,检测范围广等优点。

    权利要求书

    1.一种抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒,所述试剂盒包括:RA33抗原包被的-
    纳米磁微球、化学发光标记物、化学发光底物液、抗RA33抗体IgG定标品。
    2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述RA33抗原包被的固相载体为磁微
    粒。
    3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述RA33抗原包被的固相载体为羧基化
    的粒径为0.05-1um磁微粒。
    4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯
    磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺、吖啶酯三氟甲基磺酰胺。
    5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光标记物优选吖啶酯。
    6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光底物液包括化学发光激发
    液、化学发光预激发液。
    7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述化学发光预激发液为质量分数
    0.005% ~ 0.5%的双氧水(H2O2)溶液,激发液为0.005mol/L ~ 0.025mol/L的氢氧化钠
    (NaOH)溶液。
    8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述抗RA33抗体IgG定标品为用标准品
    缓冲液将抗RA33抗体IgG配制成浓度为0AU/mL、5 AU/mL、20 AU/mL、50 AU/mL、90 AU/mL、
    165 AU/mL,4 ℃保存备用。
    9.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的制备方法,其特征在于包
    括RA33抗原包被的磁微粒的制备、鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯的制备、化学发光底
    物液的制备、抗RA33抗体IgG定标品的制备。
    10.根据权利要求1和权利要求9所述试剂盒的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
    1)RA33抗原包被的磁微粒的制备:
    取羧基化的纳米磁珠悬浮液,磁分离去上清, MES缓冲液重悬,加入EDC水溶液,活化磁
    珠表面羧基,加入RA33抗原,室温下混悬2-10 h,磁分离,去除上清, Tris缓冲液重悬,得到
    RA33抗原包被的磁微粒;可选的,羧基化纳米磁珠直径为0.1μm ~ 2.0μm;
    MES缓冲液浓度为10mM ~ 100mM,pH 5.5 ~ 8.5;
    2)鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯的制备:
    鼠抗人IgG单克隆抗体,加入碳酸盐缓冲液,混匀,然后加入吖啶酯混匀,室温下避光反
    应,1-2 h后取出,离心脱盐柱脱盐处理,脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处
    理,最后加入得到的鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯溶液,收集离心管中的液体至保存
    管得到鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯;
    3)抗RA33抗体IgG定标品的制备:
    用标准品缓冲液将抗RA33抗体IgG配置成浓度为0 AU/mL、5 AU/mL、20AU/mL、50 AU/
    mL、90 AU/mL、165AU/mL,分装冻干,4 ℃保存备用;
    4)化学发光预激发液的制备:
    量取1.0升纯化水,依次加入0.5 ~100uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、0.5 ~ 5克防
    腐剂、0.5 ~ 5克表面活性剂,摇匀后避光存放;可选的,防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300,
    表面活性剂为吐温20、吐温80、Triton X100、Triton 405;
    5)化学发光激发液的制备:
    量取1.0升纯化水,依次加入0.2 ~ 1克氢氧化钠、0.5 ~ 5克防腐剂、0.5 ~ 5克表面活
    性剂,摇匀后避光存放;可选的,防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300,表面活性剂为吐温20、吐
    温80、Triton X100、Triton 405。

    说明书

    一种抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法

    技术领域

    本发明涉及体外诊断免疫检测领域,具体地,本发明提供了一种化学发光免疫检
    测抗RA33抗体IgG试剂盒及其制备方法。

    背景技术

    类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一常见的自身免疫性疾病,以慢性、
    进行性、对称性关节炎为主要临床特点。1989年,奥地利学者Hassfeld等利用Hela细胞核提
    取物为抗原,采用免疫印迹法在36%的RA患者血清中检测到一种分子量33KD的抗体,特异性
    为99.6%,认为一定程度上具有标记物的特性,命名为抗RA33抗体。

    Hassfeld等研究发现 RA33/36本质为蛋白质。1992年,Steiner等提纯并分析RA33
    的氨基酸序列,并与异质性核糖核蛋白体(hnRNP)比较发现,RA33与hnRNPA2蛋白等同。在各
    项RA早期诊断指标中,抗RA33抗体特异性最高,在RA中的阳性率为27%~45%,尤其在RA早期
    出现。

    此外,抗RA33 抗体除见于部分RA 患者外,约20%的系统性红斑狼疮(SLE)患者和
    40%-60%的混合性结缔组织?。∕CTD)患者中也存在该抗体。但有文献报道,SLE 患者和
    MCTD患者中抗RA33 抗体常常与另外两种自身抗体U1-RNP和Sm抗体同时出现,所以只要同
    时检查U1-RNP 和Sm 抗体即可排除SLE和MCTD。

    临床检测抗RA33抗体IgG的常见方法有免疫印迹法、酶联免疫吸附法、化学发光
    法,但这些方法都存在着一些不足之处。

    一、免疫印迹法

    免疫印迹是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应
    抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。其不足之处在
    于:

    (1) 只能进行定性和半定量分析,无法得出被检物质具体的量;

    (2) 操作步骤繁琐,试验用时较长;

    (3) 检测的灵敏度还有待提高。

    二、酶联免疫吸附法

    酶联免疫吸附法(ELISA) 被广泛应用,但该方法也存在着下述的不足之处:

    (1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔专用微孔板作为抗原包被用具和反
    应容器,在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用,无法进行独立的、单人份
    的检测;

    (2) 定量测定所用的试剂种类较多,每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装,并且每使
    用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中,不但试剂瓶种类多,加注
    试剂的操作也极为繁琐;

    (3) 缺少对检测信息的相应标注,只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知
    悉检测试剂的生产批号及有效期信息,而且所知悉的信息在检测过程中不受控,具有很大
    的随意性;

    (4) 检测试剂在检测过程中处于开放的空间,容易引起各种试剂之间的交叉污染而影
    响检测结果的准确性;

    (5) 检测过程多采用手工操作,试剂或样本的加量不很精确,操作过程极为繁琐和复
    杂,容易发生操作差错,检测结果的准确度和精密度较差;

    (6) 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份,如果需要检
    测10 个项目,则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份,如果只有一份样本需要检测10
    个不同的项目,也需要配置10×48/96人份的试剂,存在着不够经济合理的缺点。

    三、化学发光法

    化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。

    酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶两种,但都有一定的局
    限性,辣根过氧化物酶主要缺点为:鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下,也会被H2O2
    氧化自身发光,本底相对较高,影响信噪比,反应动力学复杂,影响因素多,结果不够稳定,
    要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为:底物达到平台期的时
    间长,底物成本高,导致检测成本高,患者负担重。

    吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势,主要表现
    在:反应不需要催化剂,只要碱性环境即可进行,反应迅速,背景发光低,信噪比高,干扰因
    素少,试剂稳定性好,可以两点定标,体系简单,激发液成本低,吖啶酯易与蛋白质联结,且
    联结后光子产率不减少。

    发明内容

    目前抗RA33抗体IgG检测技术存在以下缺点:检测成本高、检测灵敏度低、检测线
    性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。

    本发明正是为了克服以上所述缺点,公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性
    范围广、重现性高、可以定量、操作简单的抗RA33抗体IgG试剂盒及其制备方法。本发明首先
    制备化学发光免疫分析试剂盒,主要包括:RA33抗原包被的磁颗粒、鼠抗人IgG单克隆抗体
    包被的吖啶酯以及抗RA33抗体IgG定标品;然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品
    进行检测,绘制标准曲线,内置于电脑软件,测试实际样本,根据样本发光值计算样本浓度;
    最后对抗RA33抗体IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰
    性)的评价。

    本发明与目前技术相比,具有以下优点:

    1、本发明选择吖啶酯作为标记材料,并应用于化学发光免疫分析系统,该发光体系为
    直接化学发光,与传统的酶促化学发光相比,该反应不需要酶的参与,更加节约成本;

    2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高,能够达到1AU/mL,相比
    其它的抗RA33抗体IgG检测方法灵敏度至少提高了10倍;

    3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽,能达到3-165 AU/mL,其它
    的抗RA33抗体IgG化学发检测方法的检线性范围为20-135 AU/mL;

    4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高,批内及批间差均在5%以内,
    这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的;

    5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量,通过内置标准曲线到测试软
    件,只需测试样本就可直接得到样本的浓度值;

    6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化,试剂及样本的添加全有仪器完
    成,操作更加简便,减少了人为的误差。


    附图说明


    图1为实施例3得到的抗RA33抗体IgG标准曲线图。

    具体实施方式


    实施例1:抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒制备方法

    (1)RA33抗原包被的纳米磁珠制备:

    取50mg羧基化的磁微粒(粒径为0.05-1um)悬浮液,磁分离去上清,用0.02 M,pH为5.5
    MES缓冲液重悬,加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液,活化磁珠表面羧基,加入3-5
    mg RA33抗原包,室温下混悬2-10 h,磁分离,去除上清,用含2% BSA 的0.1 M pH为8.0的
    Tris缓冲液重悬到1mg/mL,得到RA33抗原包包被的磁颗粒,每瓶5mL分装保存于4℃备用。

    (2)鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯的制备:

    取50 uL 25mg/mL的鼠抗人IgG单克隆抗体,加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳
    酸盐缓冲液,混匀,然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀,室温下避光反应,1-2 h后取
    出,用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理,脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处
    理,最后加入得到的鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯溶液,收集离心管中的液体至保存
    管得到鼠抗人IgG单克隆抗体标记的吖啶酯,每瓶5 mL分装保存于4℃备用。

    (3)抗RA33抗体IgG定标品的制备:

    用标准品缓冲液(40 mM Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 8.0)将抗RA33抗体IgG配置
    成浓度为0 AU/mL、5 AU /mL、20 AU /mL、50 AU /mL、90 AU /mL、165 AU /mL,每瓶0.5 mL
    分装冻干,4 ℃保存备用。

    (4)化学发光预激发液的配制:

    量取1.0升纯化水,依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5
    克吐温20,摇匀后避光存放。

    (5)化学发光激发液的配制:

    量取1.0升纯化水,依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克Triton
    405,摇匀后避光存放。

    实施例2:抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测方法:

    本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具,本发明的方法学模式为竞争法,即
    仪器依次加入5 uL的样品95μL样本稀释液、50 uL的RA33抗原包被的磁颗粒,反应10 min
    后,进行磁分离。加入100 uL的鼠抗人IgG单克隆抗体包被的吖啶酯,反应10 min后,进行磁
    分离,仪器将反应混合物送入暗室,依次加入100uL化学发光预激发液、200uL化学发光激发
    液进行发光反应,最后记录发光强度,从标准曲线计算出被测样品的 抗RA33抗体IgG含量。

    实施例3:抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒性能评价

    检测曲线见附图1。

    灵敏度的检测:

    参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案,计算抗RA33抗体IgG化学发光免疫层析试剂盒
    的灵敏度,求得的灵敏度为1 AU / mL。

    线性的检测:

    对浓度为5 AU /mL、20 AU /mL、50 AU /mL、90 AU /mL、165 AU /mL标准品做线性分
    析,计算线性相关系数,r=0.9996,另外,该试剂盒对抗RA33抗体IgG样品检测的线性范围为
    3-165 AU /mL。

    精密度测定:

    取浓度为2 AU /mL及100 AU /mL两个抗RA33抗体IgG样品,每个样本每个浓度各做3个
    平行,用三批试剂盒进行检测,计算试剂盒批内及批间差,结果表明该试剂盒批内及批间差
    均小于5%。

    干扰性实验:

    取混合血清分别添加干扰物包括: 结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘
    油酯,添加比例按照 1: 20 进行,分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测
    值,计算二者之间的偏差,以 ±10%为可接受范围。结果表明,干扰性均达到 NCCLS 的文件
    标准,可用于临床实验室维生素 D 状况的准确评估。

    实施例4:抗RA33抗体IgG化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度对比实验

    分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0 AU /mL的校准品或样
    本稀释液为样本进行检测,重复测定20次,得出20次测量结果的RLU值(相对发光值),计算
    其平均值(M)和标准差(SD),得出M-2SD,将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值。
    采用化学发光检测方法得到的浓度值为1.0 AU /ml,相对于传统的酶联免疫吸附法最低检
    测限8.2 AU /ml,提高了约8倍。

    关于本文
    本文标题:一种抗RA33抗体IGG化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6013853.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
  • 六肖三期必中 11选5计划软件哪个好 大乐透走势图带连线图表 北京pk赛车龙虎压法 pk10官网开奖直播 4码15期倍投方案 大乐透最近200期 新加坡28稳赚的方法 2019篮球世界杯开战 北京pk拾赛车官网 pk10一分赛车技巧图片 重庆时时现场开直播 助赢计划软件官网地址 幸运28预测在pc28点ga 万人龙虎 七星彩美期开奖计划