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    一种 定量 检测 含糖 醛酸 多糖 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611215391.4

    申请日:

    2016.12.26

    公开号:

    CN106770871A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20161226|||公开
    IPC分类号: G01N30/88; G01N30/06; G01N30/14 主分类号: G01N30/88
    申请人: 大连工业大学
    发明人: 宋爽; 徐鑫; 温成荣; 艾春青; 鲁姣姣; 郭丽; 刘斌; 张豹; 孙晓玥
    地址: 116034 辽宁省大连市甘井子区轻工苑1号
    优先权:
    专利代理机构: 大连格智知识产权代理有限公司 21238 代理人: 刘琦
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611215391.4

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种定量检测含糖醛酸多糖的方法,具体步骤:用三氟乙酸配制含糖醛酸多糖标准品溶液,含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸??氨基己糖或己糖醛酸??己糖重复二糖片段构成的多糖;将标准品进行酸水解、除酸,得到待测样品酸水解残余物;对标准样品酸水解残余物进行溶解,利用高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪分析,得到多反应监测色谱图及标准曲线;采用与相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物;鉴定含糖醛酸多糖种类、得到待测样品中含糖醛酸多糖的含量。本发明操作步骤简捷,试剂价格低廉,耗时较短,且能够同时对多个由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖片段组成的多糖进行准确定量。

    权利要求书

    1.一种定量检测含糖醛酸多糖的方法,其特征在于,具体步骤如下:
    S1、用1.3mol/L的三氟乙酸水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液,
    其中所述含糖醛酸多糖标准品溶液中含糖醛酸多糖浓度在0.02~2.0mg/mL范围内;
    所述含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸-氨基己糖或己糖醛酸-己糖重复二糖片段构成
    的多糖;
    S2、准确量取1.00mL步骤S1制得的一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液,分别
    密封,105℃下水解3h,放至室温,采用冷冻离心浓缩除去1.3mol/L的三氟乙酸水溶液,然后
    加入0.3~1mL甲醇,再采用冷冻离心浓缩除去甲醇及残留的三氟乙酸,以上操作重复三次,
    得到标准样品酸水解残余物;
    S3、对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解,利用高效液相色谱仪串联三重四
    极杆质谱仪进行分析,即可得到所述多糖标准品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱
    图,根据标准多糖溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准曲线;
    分析检测的条件为:
    高效液相色谱:
    Amide-80亲水相互作用色谱柱,
    以含甲酸和乙酸铵的水溶液、乙腈为流动相等梯度洗脱,所述含甲酸和乙酸铵的水溶
    液中甲酸体积浓度为0.02~0.1%、乙酸铵摩尔浓度为5~25mmol/L,所述含甲酸和乙酸铵
    的水溶液与乙腈的体积比为30:70,
    柱温30℃,
    流速0.2mL/min;
    质谱条件:
    离子源ESI源,
    正离子模式,
    喷雾电压5.5kV,
    辅助加热气温度600℃,
    多反应监测,监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/114.00、
    356.10/338.10、356.10/162.10、356.10/144.00;
    所述对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解的具体过程为:
    用1mL与所述流动相组成相同的溶液将步骤S2制得的酸水解残余物溶解,将溶解液转
    移到10mL离心管中,转速10000×g、离心20min、采集上清液;
    S4、取待测样品,采用与步骤S1、S2相同的方法对所述待测样品进行酸水解、除酸,得到
    待测样品酸水解残余物;
    S5、采用与步骤S3相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物,得到酸水解残余物
    中多糖样品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱图;
    S6、将步骤S5得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3得到的标准样品多反应监测
    色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定含糖醛酸多糖
    种类;根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线,即可得到待测样品中含糖醛酸多糖的含量。
    2.根据权利要求1所述定量检测含糖醛酸多糖的方法,其特征在于,步骤S3所述流动相
    组成为含体积浓度为0.05%甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈=30:70。
    3.根据权利要求1所述定量检测含糖醛酸多糖的方法,其特征在于,步骤S3所述监测的
    离子对的选择:主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择356.10/162.10作为定
    量离子对,主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择379.09/203.00作为定量离
    子对。

    说明书

    一种定量检测含糖醛酸多糖的方法

    技术领域

    本发明涉及含糖醛酸多糖的检测技术领域,特别涉及一种定量检测含糖醛酸多糖
    的方法。

    背景技术

    含糖醛酸多糖在动物体内广泛存在,包括糖胺聚糖以及其它一些的含糖醛酸的非
    糖胺聚糖。糖胺聚糖主要是指由一个氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖重复单元构成的
    直链多糖,如透明质酸、硫酸软骨素等。而在贝类等一些生物中,还发现了含有糖醛酸与己
    糖连接而成的重复二糖片段的多糖,如鲍鱼性腺多糖AGSP等。含糖醛酸多糖在生理过程中
    起着重要作用,已引起了广泛的关注,其中一些已经被开发为药品、保健品、化妆品等。因
    此,建立含糖醛酸多糖定量检测方法将为相关药品、食品、保健品等产品的质量控制提供有
    力手段。

    目前,主要有化学显色法对含糖醛酸多糖进行定量检测,也有采用高效液相色谱-
    液质联用技术对糖胺聚糖酶解后产生的二糖进行定量,而化学显色法的无特异性、误差较
    大,酶的价格比较高昂,操作繁琐,不适合常规的检测。

    发明内容

    本发明的目的是提供一种定量检测含糖醛酸多糖的新方法,通过对含糖醛酸多糖
    酸降解产生的二糖进行高效液相色谱-质谱检测,有效确定含糖醛酸多糖的含量。

    为达到上述目的,本发明提供了一种定量检测含糖醛酸多糖的方法,具体步骤如
    下:

    S1、用1.3mol/L的三氟乙酸水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶
    液,其中所述含糖醛酸多糖标准品溶液中含糖醛酸多糖浓度在0.02~2.0mg/mL范围内;

    所述含糖醛酸多糖为主链由己糖醛酸-氨基己糖或己糖醛酸-己糖重复二糖片段
    构成的多糖;

    S2、准确量取1.00mL步骤S1制得的一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品溶液,
    分别密封,105℃下水解3h,放至室温,采用冷冻离心浓缩除去1.3mol/L的三氟乙酸水溶液,
    然后加入0.3~1mL甲醇,再采用冷冻离心浓缩除去甲醇及残留的三氟乙酸,以上操作重复
    三次,达到除酸目的,得到标准样品酸水解残余物;

    S3、对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解,利用高效液相色谱仪串联三
    重四极杆质谱仪进行分析,即可得到所述多糖标准品降解产生的二糖片段的多反应监测
    (MRM)色谱图,根据标准多糖溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准曲线;

    二糖片段即经过步骤S2酸水解得到的,本发明中的酸水解条件可以产生二糖片
    段。

    分析检测的条件为:

    高效液相色谱:

    Amide-80亲水相互作用色谱柱,

    以含甲酸和乙酸铵的水溶液、乙腈为流动相等梯度洗脱,所述含甲酸和乙酸铵的
    水溶液中甲酸体积浓度为0.02~0.1%、乙酸铵摩尔浓度为5~25mmol/L,所述含甲酸和乙
    酸铵的水溶液与乙腈的体积比为30:70,

    柱温30℃,

    流速0.2mL/min;

    质谱条件:

    离子源ESI源,

    正离子模式,

    喷雾电压5.5kV,

    辅助加热气温度600℃,

    多反应监测(MRM),监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/
    114.00、356.10/338.10、356.10/162.10、356.10/144.00;

    所述对步骤S2所得标准样品酸水解残余物进行溶解的具体过程为:

    用1mL与所述流动相组成相同的溶液将步骤S2制得的酸水解残余物溶解,将溶解
    液转移到10mL离心管中,转速10000×g、离心20min、采集上清液;

    所述流动相优选组成为含体积浓度为0.05%甲酸的10mmol/L乙酸铵水溶液:乙腈
    =30:70。

    采用与所述流动相组成相同的溶液溶解酸水解残余物可以改善酸水解残余物中
    二糖色谱峰峰型。

    S4、取待测样品,采用与步骤S1、S2相同的方法对所述待测样品进行酸水解、除酸,
    得到待测样品酸水解残余物;

    S5、采用与步骤S3相同的方法处理并检测待测样品酸水解残余物,得到酸水解残
    余物中多糖样品降解产生的二糖片段的多反应监测色谱图;

    S6、将步骤S5得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3得到的标准样品多反应
    监测色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定含糖醛酸
    多糖种类;根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线,即可得到待测样品中含糖醛酸多糖的
    含量。

    优选方式下,主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择356.10/162.10
    作为定量离子对,主链由己糖醛酸-氨基己糖重复片段构成的多糖选择379.09/203.00作为
    定量离子对。

    本发明所检测的含糖醛酸多糖是指含有由一个糖醛酸与一个氨基己糖、或一个糖
    醛酸与一个己糖组成的重复二糖片段的多糖。

    本发明的有益效果是:

    1、本发明方法能够同时定量测定多种由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重
    复二糖单元构成的多糖,操作步骤简捷,耗时较短。

    2、本发明利用与流动相同比例的溶液溶解酸降解后的多糖片段,以及采用含0.02
    ~0.1%甲酸和5~25mM乙酸铵的水溶液都可以改善三种多糖质谱图的峰型,提高定量检测
    的准确度。

    3、本发明方法适用于定量检测由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖
    片段组成的多糖,如硫酸软骨素、透明质酸、鲍鱼性腺硫酸多糖(AGSP)等。本发明提供的方
    法可以无需衍生化,可直接进质谱分析,能够对这些多糖进行准确的定量测定,可用于检测
    含有这些多糖的药品、保健品等产品的质量。

    综上,本发明操作步骤简捷,试剂价格低廉,耗时较短,且能够同时对多个由一个
    糖醛酸与一个氨基己糖或己糖的重复二糖片段组成的多糖进行准确定量。

    附图说明

    图1是实施例1中标准多糖混合溶液的总离子流色谱图;

    图2是实施例1中透明质酸(HA)二糖的质谱图;

    图3是实施例1中硫酸软骨素(CS)二糖的质谱图;

    图4是实施例1中鲍鱼性腺多糖AGSP二糖的质谱图;

    图5是实施例1中透明质酸(HA)对应的色谱峰;

    图6是实施例1中硫酸软骨素(CS)对应的色谱峰;

    图7是实施例1中鲍鱼性腺多糖AGSP对应的色谱峰。

    具体实施方式

    下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以
    任何方式限制本发明。

    S1、用1.3mol/L的三氟乙酸的水溶液配制一系列浓度梯度的含糖醛酸多糖标准品
    溶液,其中含糖醛酸多糖浓度在0.02~2.0mg/mL范围内。

    S2、准确量取1.00mL标准溶液和待测样品溶液,密封,105℃下水解3h,放置室温,
    采用冷冻离心浓缩除去溶剂,然后加入0.3~1mL甲醇,再采用冷冻离心浓缩除去溶剂,以上
    操作重复三次,达到除酸目的。

    S3、用与流动相相同组成的含甲酸和乙酸铵的乙腈水溶液将酸水解残余物溶解,
    溶解液转移到10mL离心管中,转速10000×g,离心20min并采集上清液。

    S4、高效液相色谱-质谱联用分析的条件如下:

    高效液相色谱-三重四极杆质谱仪;Amide-80色谱柱;以含0.02%~0.1%甲酸和5
    ~25mM乙酸铵的水溶液(A):乙腈(B)等度洗脱;柱温30℃;流速0.2mL/min。

    质谱条件:离子源ESI源;正离子模式;喷雾电压5.5kV;辅助加热气温度600℃;进
    样体积2μL;监测的离子对包括379.09/203.00、379.09/198.90、379.09/114.00、356.10/
    338.10、356.10/162.10、356.10/144.00。

    S5、根据色谱峰保留时间和监测离子丰度比或二级质谱区分各多糖的二糖片段,
    然后根据色谱峰面积和标准多糖浓度绘制工作曲线。

    实施例1

    (1)准确称取10.0mg硫酸软骨素(CS)、10.0mg透明质酸(HA)以及20.0mg鲍鱼性腺
    多糖AGSP,混合后用1.3mol/L的三氟乙酸溶解,配制成系列浓度(AGSP:0.04、0.12、0.2、
    0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL,CS、HA:0.02、0.06、0.1、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的混合标准
    多糖溶液,每个浓度两平行。

    (2)自制样品:含有10%透明质酸、20%硫酸软骨素、70%淀粉。

    (3)制备待测样品多糖溶液:取25mg自制样品于10mL容量瓶,用1.3mol/L的三氟乙
    酸溶液溶解定容,取1ml待加热水解;精确量取0.50mL待测样品多糖溶液于1mL水解管中再
    加入0.50mL混合标准多糖溶液,制成加标样品,密封,待加热水解。

    (4)取标准品溶液和待测样品溶液,密封,放置在105℃烘箱中酸水解3h,冷却至室
    温后采用冻干浓缩一体机除去溶剂,然后加入0.5mL甲醇再次用冻干浓缩一体机除去溶剂,
    重复三次,以除净三氟乙酸,得到标准品溶液和待测样品溶液的酸水解残余物。

    (5)用与流动相相同组成的含甲酸和乙酸铵的乙腈水溶液将标准品溶液和待测样
    品溶液的酸水解残余物溶解,将溶解液转移到10mL离心管中,转速10000×g,离心20min并
    采集上清液。

    (6)色谱条件:高效液相色谱仪(日本SHIMADZU公司);色谱柱为Amide-80 3μm(2.0
    ×150mm);柱温30℃;洗脱条件为含0.05%甲酸的10mM乙酸铵水溶液(A):乙腈(B)洗脱=
    30:70;流速0.2mL/min。质谱条件:4000QTRAP三重四极杆串联线性离子阱质谱仪(美国AB
    SCIEX公司);离子源ESI源;正离子模式;喷雾电压5.5kV;辅助加热气温度600℃;进样体积2
    μL;选择多重反应监测(MRM)-信息相关采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)。其它参数如表1
    所示。

    表1酸水解二糖片段的质谱分析条件



    CE:碰撞能量,DP:去簇电压,EP:入口电压,CXP:碰撞室出口电压。

    (7)检测得到的总离子流图如图1所示。通过IDA-EPI获得的二级质谱如图2~4所
    示。分别选择356.1/162.10、356.1/162.10、379.10/203.00三个离子色谱图来对透明质酸、
    硫酸软骨素、鲍鱼性腺多糖AGSP的二糖片段进行定量,获得的色谱图如图5~7所示,工作曲
    线和精密度结果如表2所示。根据工作曲线计算待测样品中硫酸软骨素的含量为0.1280g/
    g,RSD=0.60%(n=5),透明质酸的含量为0.0714g/g,RSD=3.35%(n=5)。

    表2



    上述实施例实现了同时定量了三个物质:透明质酸、硫酸软骨素、鲍鱼性腺多糖
    AGSP。

    以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的?;し段Р⒉痪窒抻诖?,
    任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其
    发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的?;し段е?。

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