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    一种 基于 距离 检测 靶标 集成化 ELISA 芯片 及其 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611159534.4

    申请日:

    2016.12.15

    公开号:

    CN106771136A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/535申请日:20161215|||公开
    IPC分类号: G01N33/535; G01N33/542; G01N33/543 主分类号: G01N33/535
    申请人: 厦门大学
    发明人: 杨朝勇; 刘丹; 周君恺; 李星锐; 李久兴; 朱志
    地址: 361000 福建省厦门市思明南路422号
    优先权:
    专利代理机构: 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 代理人: 张松亭;游学明
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611159534.4

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法,该芯片设有多个水相腔和油相腔,该水相腔和油相腔交替排列为一行,且前后的腔体互相连通,水相腔设有水相进口,油相腔设有油相进口,最左边的水相腔和一染料腔连接,该染料腔另设有第三进口;染料腔和一染料气柱通道连通,染料气柱通道旁设有刻度。本发明将繁琐的免疫实验步骤、清洗步骤、距离信号输出集成到一块微流控气动芯片上,可用于对蛋白、细胞等多种靶标的高灵敏定量即时检测。

    权利要求书

    1.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,其设有多个水相腔和油相
    腔,该水相腔和油相腔交替排列为一行,且前后的腔体互相连通,水相腔设有水相进口,油
    相腔设有油相进口,行末的水相腔和一染料腔连接,该染料腔另设有第三进口;染料腔和一
    染料气柱通道连通,染料气柱通道旁设有刻度。
    2.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,水相腔的数量和油相腔的
    数量分别为5-15个。
    3.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,水相腔中至少包括过氧化
    氢溶液,PtNPs溶液,链霉亲和素溶液和生物素化抗体溶液,每种溶液独立设于一水相腔内。
    4.一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,油相腔中含有矿物油。
    5.如权利要求1所述的一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,该芯
    片包括上层(1)、中层(2)和下层(3),其中,中层(2)中间设有一行由圆形孔和椭圆形孔交替
    设置的腔,其中圆形孔为水相腔(21),椭圆形孔为油相腔(22),且相邻的孔互相连通;在最
    左侧的圆形孔侧面设有染料腔(23),该最左侧的圆形孔和染料腔(23)连通;该中层设有S形
    弯折排列的染料气柱通道(24),染料气柱通道(24)的侧面设刻度(25);染料气柱通道(24)
    的起点和染料腔(23)连通,终点为出气孔(26);中层的右上角设多个水相通孔(27);
    上层左上角设有多个水相进样孔(12),该每个水相进样孔(12)分别和一水相槽(11)连
    接,每条油相槽(11)设于上层的下表面,起点位于水相进样孔(12),终点位于中层圆形水相
    腔(21)的对应位置;上层的右上角设有多个油相进样孔(17),其位置和数量分别和中层右
    上角的油相通孔(27)的位置和数量对应;
    下层上表面设有多道油相槽(37),每个油相槽(37)起点分别为中层的油相通孔(27)对
    应的位置,终点为中层的椭圆形油相腔(22)对应的位置。
    6.如权利要求5所述的一种基于距离检测靶标的集成化ELSIA芯片,其特征在于,上层
    的油相通孔(27)数量不少于中层的油相腔(21)的数量。
    7.一种基于距离检测靶标的方法,采用权利要求1至6任一项所述的集成化ELSIA芯片,
    包括如下步骤:
    1)根据要检测的抗原选择相对应的捕获抗体及检测抗体;
    2)对信号放大分子进行修饰,使其与检测抗体分子偶联结合,或使其能够特异性的与
    检测抗体结合;
    3)在磁珠或微球表面进行包被,加入捕获抗体使其结合于包被后的固相表面,之后进
    行封闭液封闭;
    4)将以下试剂载入芯片:检测抗原与捕获抗体包被的磁珠,检测抗体、信号放大分子,
    洗去多余试剂的洗涤缓冲液,底物以及染料;其中,水相从水相进口进入水相腔;油相从油
    相进口进入各油相腔,染料加入染料腔,磁珠和样品加入第一个水相腔;
    5)密封加样孔,磁移动,利用磁铁对磁珠拉动,将磁珠和样品从第一个水相腔拉至最后
    一个水相腔,完成每一步反应,信号放大分子催化底物分子,生成大量气体分子,气体推动
    染料前进产生距离信号;
    6)根据距离信号,记录数据,进而建立标准曲线,实现未知样品中靶标分子的定量检
    测。
    8.如权利要求7所述的一种基于距离检测靶标的方法,其特征在于:所述的分子识别包
    括,利用具有特异性识别功能的分子对所述靶标进行识别或标记,并通过将该识别分子将
    信号放大分子或粒子引入检测体系中。
    9.如权利要求7所述的一种基于距离检测靶标的方法,其特征在于:利用分子识别技术
    对所述靶标进行识别或标记,所述靶标包括蛋白、核酸、肽链、糖类、脂类、有机小分子、无机
    离子、细胞、细菌或病毒等可以进行免疫反应的至少一种。
    10.如权利要求7所述的一种基于距离检测靶标的方法,其特征在于:所述信号放大分
    子包括能够催化底物产生气体的催化剂或酶,其催化底物为受催化后产生气体分子的物
    质,气体分子为底物受催化后的产物。

    说明书

    一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法

    本发明涉及一种将繁琐的免疫实验步骤、清洗步骤、信号输出集成到一块微流控
    气动芯片上的集成检测方法,用于对蛋白、细胞等多种靶标的高灵敏定量即时检测。

    背景技术

    酶联免疫吸附反应(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)最早在1971年
    由Engvall和Perlmann提出。它是一种将已知抗体或抗原吸附在固相载体(如聚苯乙烯板、
    微孔滤膜、磁珠等)表面并保持其免疫原性,利用酶标抗原抗体间的特异性反应进行标记,
    根据酶催化底物显色深浅程度进行定性或定量检测的技术。该方法具有适用范围广、灵敏
    度高、特异性强、操作规范及易于自动化等优点,在食品安全检测、水污染防治和临床疾病
    诊断等领域成为备受重视并广泛应用的检测分析方法。目前,基于免疫反应的临床诊断等
    主要依赖于光学、电学、磁学等分析方法。然而这些检测手段一般均需大型仪器和专业操作
    人员,操作复杂,耗时久,且费用昂贵。为了克服这些局限性,发展新型的信号转导、简单输
    出方法是目前科学家们的研究热点,例如研究者们已发展了以血糖仪、时间、气味等作为信
    号输出方法的便携式传感器,用于快速、原位、低成本检测,然而这些方法仍然存在操作复
    杂、灵敏度低等、集成化程度低等问题(1.Y.J.Song,Y.Q.Zhang,P.E.Bernard,J.M.Reuben,
    N.T.Ueno,R.B.Arlinghaus,Y.L.Zu,L.D.Qin,Nat.Commun.2012,3,1283.;2.H.Noh,
    S.T.Phillips,Anal.Chem.2010,82,8071–8078.;4.H.Mohapatra,S.T.Phillips,
    Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11145–11148;Angew.Chem.2012,124,11307–11310.)。因此,
    发展更为高灵敏、高选择性、简单、廉价、集成化程度高的新型即时检测技术,用于生物医学
    分析,尤其是特定疾病的生物标志物的定量检测,成为目前生物医学亟待解决的问题。

    建立ELSIA作为一个快速、廉价以及集成化的检测方法用于POCT的检测,研究者们
    做出了很多尝试。Vashist等尝试用一步法ELSIA降低整个实验的时间,但其整个操作过程
    仍然需要专业操作,以及专门的信号读出仪器(5.S.K.Vashist,E.M.Schneider,E.Lam,
    S.Hrapovic and J.H.T.Luong,Scientific Reports,2014,4,7.)。Yeh等将三明治ELSIA集
    成到一块芯片上,即使用智能手机可以将信号读出方式,但其仍然需要将样品用枪头析出
    然后再进行检测,不算真正意义的集成(6.Y.-T.Yeh,M.Nisic,X.Yu,Y.Xia and S.-
    Y.Zheng,Annals of Biomedical Engineering,2014,42,2333-2343.)。Dai-Wen Pang等人
    用纸芯片实现了CRP蛋白的检测,而荧光作为信号也限制了其在POCT领域的应用(7.Jiao
    Hu,Zhi-Ling Zhang,Cong-Ying Wen,Man Tang,Ling-Ling Wu,Cui Liu,Lian Zhu,and
    Dai-Wen Pang.Anal.Chem.,2016,88(12),pp 6577–6584)。所以尽管POC检测目前研究者们
    已经做出来大量尝试,然而建立一种真正集成化、便携、快速廉价、高灵敏的检测方法迫在
    眉睫。

    综上所述,在未来的科学研究中,如何发展一种高灵敏、高选择性、简单、廉价、集
    成化程度高的新型即时检测技术,用于生物医学分析,尤其是特定疾病的生物标志物的定
    量检测,可应用于即时诊断的的定量检测分析方法是亟待解决的问题。

    发明内容

    本发明针对现有高灵敏定量检测分析方法及其仪器设备价格昂贵、实验方法成本
    高、免疫反应操作复杂、耗时等缺点,发展了一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片方
    法。该方法采用分子识别引入信号放大分子如酶或纳米粒子,通过信号放大分子或粒子催
    化底物释放出大量气体分子,实现信号放大,因而可以用于实验室中高灵敏度、高选择性的
    无机离子、小分子、生物大分子例如蛋白质、DNA、甚至病毒、细菌、细胞等多种靶标的高灵敏
    度定量。另外,将繁琐的免疫反应以及距离信号输出集成在一起,所有实验方法均在芯片内
    完成,不需任何外接仪器的即时检测系统,能用于集成化地、高灵敏度POC定量检测分析。

    本发明的技术方案如下:

    一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片,其设有多个水相腔和油相腔,该水相
    腔和油相腔交替排列为一行,且前后的腔体互相连通,水相腔设有水相进口,油相腔设有油
    相进口,行末的水相腔和一染料腔连接,该染料腔另设有第三进口;染料腔和一染料气柱通
    道连通,染料气柱通道旁设有刻度。

    在较佳的实施例中,水相腔的数量和油相腔的数量分别为5-15个。

    在较佳的实施例中,水相腔中至少包括过氧化氢溶液,PtNPs溶液,链霉亲和素溶
    液和生物素化抗体溶液,每种溶液独立设于一水相腔内。

    在较佳的实施例中,油相腔中含有矿物油。

    在酶联免疫吸附法体系中,基于距离检测靶标的定量检测方法包括如下步骤:(1)
    根据要检测的抗原选择相对应的捕获抗体及检测抗体;(2)对信号放大分子进行修饰,使其
    与检测抗体分子偶联结合,或使其能够特异性的与检测抗体结合;(3)在磁珠或微球表面进
    行包被,加入捕获抗体使其结合于包被后的固相表面,之后进行封闭液封闭。(4)将以下试
    剂载入芯片:检测抗原与捕获抗体包被的磁珠,检测抗体、信号放大分子,洗去多余试剂的
    洗涤缓冲液,底物以及染料,其中;水相从水相进口进入水相腔;油相从油相进口进入各油
    相腔,染料加入染料腔,磁珠和样品加入第一个水相腔;(5)密封加样孔,磁移动,利用磁铁
    对磁珠拉动,将磁珠和样品从第一个水相腔拉至最后一个水相腔,完成每一步反应,信号放
    大分子催化底物分子,生成大量气体分子,气体推动染料前进产生距离信号;(6)根据距离
    信号,记录数据,进而建立标准曲线,实现未知样品中靶标分子的定量检测。

    本发明一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片方法,将繁琐的免疫实验步骤、
    清洗步骤、距离信号输出集成到一块微流控气动芯片上,利用分子识别引入信号放大分子
    或粒子,通过信号放大分子或粒子催化底物释放出气体分子,导致气体推动染料前进,并最
    终通过读取染料移动的距离,实现高灵敏定量集成化检测。

    其中,所述的集成,是将繁琐的免疫反应以及距离信号输出集成在一起,所有实验
    方法均在芯片内完成,组成一个不需任何外接仪器的即时检测系统。

    其中,基于距离的可视化定量方法是将不同浓度的待测物作为信号输入,经过特
    定的反应后以不同长度的有色条带作为输出信号。用户只需要通过读取条带的长度,即可
    实现对待测物的可视化定量检测。

    其中,所述的分子识别包括,利用具有特异性识别功能的分子对所述靶标进行识
    别或标记,并通过将该识别分子将信号放大分子或粒子引入检测体系中。

    其中,所述信号放大分子包括能够催化底物产生气体的催化剂或酶,其催化底物
    为受催化后产生气体分子的物质,气体分子为底物受催化后的产物。

    其中,所述的信号放大分子包括过氧化氢酶、金纳米粒子、铂纳米粒子、金铂纳米
    粒子、锰氧化物纳米粒子或其他可以催化底物产生气体的催化剂或酶。

    其中,检测探针上偶联有能够催化底物产生大量气体的信号放大分子,例如酶或
    纳米粒子。

    其中,使用的检测探针通过化学或生物的偶联方法与信号放大分子(酶或纳米粒
    子)偶联,通过检测探针的特异性引入酶或纳米粒子。

    本发明的优点在于:首先,该方法在设计上符合ASSURED(Martinez A.,Phillips
    S.,Whitesides G.,et.al.,Diagnostics for the Developing World:Microfluidic
    Paper-Based Analytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.)的国际标
    准,它灵敏度高、选择性好,检测结果可靠;其次,整个反应过程简单、快速,只需移动磁珠完
    成整个免疫过程,时间在2个小时内,集成化程度高;再者,将产生O2的体积量转化为距离,
    并与免疫反应集成在一张微流控芯片上,能用于集成化地、高灵敏度POC定量检测分析。该
    发明是以距离作为信号输出,ELSIA过程一体化,即将不同浓度的待测物作为信号输入,经
    过特定的反应后以不同长度的有色条带作为输出信号,用户只需要通过读取条带的长度,
    即可实现对待测物的可视化定量检测。此类芯片设计灵活,通用性强,可以针对不同靶标达
    到相应的动态检测范围。该方法不需任何外接仪器,检测结果不受用户个体差异和环境的
    影响,并且易于集成,在医疗诊断、环境监测、食品安全领域具有很大的应用价值。鉴于成本
    低廉,检测快速,用户友好、集成化以及基于距离检测的优势,我们提出的基于距离检测靶
    标的集成化ELSIA芯片方法有可能发展成为公众用于广泛的靶标定量检测工具。

    本发明利用油水互不相容的原理,将水相试剂以及磁珠物理的隔开,再通过磁铁
    拉动磁珠完成每一步反应,实现反应的集成;利用纳米粒子催化双氧水生成大量气体,将检
    测靶标分子的信号转换为气体信号,实现信号放大,气体推动染料前进,并最终通过读取染
    料移动的距离,实现高灵敏定量集成化检测。本发明中,以具有广泛临床意义的C-反应蛋白
    (C-reaction protein,CRP)作为靶标,证明了该发明的可行性、适用性、及可靠性。并以通
    过对肿瘤标志物前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)的检测,证明该发
    明的体系通用性。

    本发明方法检测灵敏度高,且具有操作简单、价格低廉、反应快速、集成化程度高,
    且通用性好,可用于血液、唾液等各种复杂体系中蛋白靶标的快速、高灵敏定量检测。

    附图说明

    图1为在室温下,不同浓度生物素化的PtNPs的距离响应情况可行性考察。

    图2为在室温下,不同浓度的Tween20对磁珠滞留及免疫实验的影响考察。

    图3为在室温下,气柱深度对实验灵敏度以及重现性的影响。

    图4为在室温下,不同浓度生物素化的PtNPs的距离响应情况考察。

    图5为在室温下,不同浓度生物素化的PtNPs的距离线性响应情况。

    图6为在室温下,免疫体系中,信号分子为生物素化的PtNPs,在10min时间内,用于
    C-反应蛋白的检测,考察体系的可行性。

    图7为在室温下,免疫体系中,信号分子为生物素化的PtNPs,在10min时间内,用于
    C-反应蛋白(CRP)的检测,进行工作标准曲线的绘制,时间为5min。

    图8为在室温下,免疫体系中,以人血清白蛋白(HSA)、羊抗鼠二抗(IgG)、凝血酶
    (Thr)为负对照,考察该体系对C-反应蛋白(CRP)的选择性,图为对于0.05μg/ml HSA、IgG、
    Thr、PSA的响应,反应时间为5min。

    图9为在室温下,免疫体系中,使用芯片方法,将不同浓度靶标蛋白加入到血清中
    排除基质效应,考察C-反应蛋白(CRP)检测的标准曲线,时间为5min。

    图10为在室温下,免疫体系中,以常规免疫比浊为标准方法,将不同浓度靶标蛋白
    加入到血清中排除基质效应,考察C-反应蛋白(CRP)检测的标准曲线,时间为5min。

    图11为在室温下,对未知临床样品进行检测,比较临床标准方法和芯片方法的准
    确性。

    图12为在室温下,以人前列腺特异性抗原(PSA)作为靶标,考察芯片的体系通用
    性。

    图13为芯片的结构示意图,其中A为上层结构示意图,B为中层结构示意图,C为下
    层结构示意图。

    具体实施方式

    实施例1:芯片的制作

    根据计算机中Auto CAD的芯片设计,在PMMA材料上激光刻蚀产生所要的微结构与
    微通道,中间一层包含11个圆形孔,9个椭圆孔,以及气柱通道。上面一层为水相加入通道以
    及加样孔,最下层为油相加入通道。三层芯片的厚度均为2.2mm。光切割好的PMMA片利用热
    键和的方式将三层键合在一起。为了防止毛细作用,键合后的芯片通道用氟油孵化,过夜氟
    油挥发后,芯片待用。

    具体的,参见图13,该芯片包括上层1、中层2和下层3,其中,中层2中间设有一行由
    圆形孔和椭圆形孔交替设置的腔,其中圆形孔为水相腔21,椭圆形孔为油相腔22,且这些孔
    是互相连通的。在最左侧的圆形孔侧面设有染料腔23,该最左侧的圆形孔和染料腔23连通。
    该中层设有S形弯折排列的染料气柱通道24,染料气柱通道24的侧面设刻度25.染料气柱通
    道24的起点和染料腔23连通,终点为出气孔26。中层的右上角设多个油相通孔27,其数量和
    油相腔22的数量一致或更多。

    上层左上角设有多个水相进样孔12,该每个水相进样孔12分别和一水相槽11连
    接,每条水相槽11设于上层的下表面,起点位于水相进样孔12,终点位于中层水相腔21的对
    应位置。上层的右上角设有多个油相进样孔17,其位置和数量分别中层右上角的油相通孔
    27的位置和数量对应,数量也可更多。上层还设有连通染料腔23的第三进样孔13,用于加可
    视化的红色染料。

    下层上表面设有多道油相槽37,每个水相槽37起点分别为中层的油相通孔27对应
    的位置,终点为中层的油相腔22对应的位置。

    在使用时,油相从上层的各油相进样孔17进入,然后分别经过中层的油相通孔27,
    再经过下层的油相槽37进入各油相腔22;水相从上层的水相进样孔12进入,经过水相槽11
    分别进入各水相腔21。染料腔23的原料从第三进样孔13进入。

    在其它的实施例中,油相槽37和水相槽11也可分别设于中层的上下表面,或是两
    者之一设在中层。

    实施例2:biotin基团及巯基基团修饰的核酸分子的合成与纯化

    以普通CPG作为固相载体,以DNA单体碱基为原料,在DNA合成仪上由3′端向5′端合
    成表1中的序列DNA,具体合成的序列见表1。以biotin修饰的CPG作为固相载体,以DNA单体
    碱基为原料,在DNA合成仪上由3′端向5′端合成,最后5′端修饰修饰巯基。合成结束后,将上
    述CPG转移至2mL洁净灭菌的Eppendorf管中,加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65℃下
    氨解30min,使DNA从CPG上切割下来。氨解完毕后提取上清,并用少量超纯水清洗CPG,合并
    上清。向体系中加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaCl,于-20℃冰箱
    进行酒精沉淀30min。酒精沉淀完毕后,在14,000rpm的转速下离心10min,弃上清。将得到的
    粗产物溶解在pH 8的0.1mol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中,使用反相高效液相色谱仪进行纯
    化。将通过反相-HPLC纯化后的产品进行真空干燥。除巯基修饰DNA外,其余DNA溶于80%乙
    酸中脱DMT,反应30min后,抽干再用超纯水后溶解,使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用紫
    外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度,根据DNA的消光系数计算出其相应的物质
    的量和浓度值。定量后真空浓缩。5’巯基修饰DNA在HPLC纯化后,加入pH 6.5的0.1M TEAA溶
    解DNA,测A260,将其稀释至A260=100,记录总体积为V;之后加入0.15V的1M AgNO3,混匀,
    室温反应30min;再加入0.20V的1M DTT(二硫苏糖醇),混匀,室温反应5min;离心,取上清
    (DTT络合物),沉淀用1V 0.1M TEAA洗涤,合并洗涤液;使用凝胶过滤柱进行脱盐处理。使用
    紫外-可见分光光度计测定260nm处核酸的吸光度,根据DNA的消光系数计算出其相应的物
    质的量和浓度值。定量后真空浓缩。

    表1实施例2中所用DNA序列





    实施例3:PtNPs的合成及修饰

    将100μL新鲜配置的0.4M抗坏血酸溶液加至含有1mL浓度为1mM的氯铂酸溶液中,
    并迅速放置于80℃恒温干浴锅中反应30min,即得30nm大小的PtNPs。为将PtNPs用于后续免
    疫反应,需对其进行生物分子修饰。文中利用SH-PEG-biotin linker修饰PtNPs获取生物素
    化的PtNPs(biotin-PtNPs)。具体操作为,将10μL 1%的Tween-20和5μL 100μM的mPEG-SH
    (MW~5KD)加至1mL 4.5nM的PtNPs中,涡旋混匀后加入10μL 120μM的SH-PEG-biotin
    linker和50μL 0.2M的H3PO4溶液,涡旋混匀后于37℃条件下反应1h。反应结束后,用含有
    0.1%Tween-20和0.5%BSA的PBS溶液(pH7.4)在13000rpm转速下离心洗涤3次,每次4min,
    最后重悬在1mL上述溶液中即得终浓度为2.5nM的biotin-PtNPs,放置于4℃冰箱保存备用。

    实施例4:生物素化辣根过氧化物酶(HRP)的制备

    利用Biotin-NHS与蛋白-NH2之间发生酯交换反应制备生物素化的抗体(biotin-
    antibody)。用pH 9.0的0.1M NaHCO3缓冲液稀释抗体得1mg/mL HRP溶液,向其中缓慢滴加
    1/8体积的含有1mg/mL Biotin-NHS的DMF溶液,涡旋混匀后,4℃冰箱过夜反应。反应结束
    后,在30k大小的超滤离心管中,用含有0.1%Tween-20,pH 7.4的PBS缓冲液,14000rpm,4℃
    下离心洗涤3次,每次30min。最后重悬于500μL含有0.1%Tween-20,0.5%BSA,pH 7.4的PBS
    缓冲液中,得1mg/mL的biotin-HRP,4°C冰箱保存备用。

    实施例5:试剂载入芯片

    依次将可视化的红色染料、过氧化氢,PtNPs,链霉亲和素,生物素化抗体,以及洗
    液PBST加入到圆形孔中(可视化的红色染料通过第三进样孔13加入染料腔23,其余通过进
    样孔12加入,加样顺序从左至右,每个圆形孔加一种样品;在ELISA每一步之间加入一步
    PBST用于清洗,链霉亲和素和PtNPs之间加入两步PBST,用于彻底清洗)。然后通入矿物油至
    椭圆孔(油相进样孔17加入,加样顺序从左至右),;然后将样品和磁珠混合物加至最右边第
    一个圆形孔,最后在最右边第一个油相孔中加入矿物油。

    样品和磁珠混合物的制备过程:2mg/mL的磁珠吸去上清,加入一系列浓度的CRP样
    品,混匀。

    实施例6:磁移动及数据记录

    利用直径20mm/厚1mm的超薄磁铁片,连续5-10个,将磁微珠从一个圆形孔拖到另
    一个圆形孔。反应时间依次为,样品反应30min,抗体反应30min,链霉亲和素反应15min,
    PtNPs反应15min,每一孔洗涤时间5min,用superglue粘盖玻片,保证气密性,将磁珠转移至
    过氧化氢孔中,产气记录数据。

    其结果见图1至图13。

    图1结果表明:随着产气时间的延长,不同浓度的PtNPs具有不同的距离响应。

    图2结果表明:不同浓度的tween20对ELISA的结果没有影响,1%的tween20条件
    下,磁珠没有残留。

    图3结果表明:不同高度的气柱通道条件下,气柱通道为600微米时,距离响应具有
    很好的稳定性和灵敏度。

    图4结果表明:不同浓度的PtNPs在10min内具有不同的距离响应。

    图5结果表明:不同浓度的PtNPs对距离具有良好的线性响应。

    图6结果表明:0.05μg/mL的CRP在5min产气情况下,具有一定的距离响应。

    图7结果表明:不同浓度的CRP对距离具有良好的线性响应。

    图8结果表明:本发明方法具有良好的特异性。

    图9结果表明:以血清作为基质,不同浓度的CRP对距离具有良好的线性响应。

    图10结果表明:临床标准方法对CRP的检测的响应曲线。

    图11结果表明:通过对16例临床标本的检测,本发明的方法和临床标准方法具有
    很好的一致性,

    图12结果表明:通过对PSA的检测,本发明的方法具有很好的通用性。

    以上所述,仅为本发明的较佳实施例而已,故不能依此限定本发明实施的范围,即
    依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰,皆应仍属本发明涵盖的范围。

    关于本文
    本文标题:一种基于距离检测靶标的集成化ELISA芯片及其检测方法.pdf
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