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    关 键 词:
    一种 中药饮片 枳壳 黄酮 化合物 分离 检测 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611217873.3

    申请日:

    2016.12.26

    公开号:

    CN106770768A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20161226|||公开
    IPC分类号: G01N30/02; G01N30/06 主分类号: G01N30/02
    申请人: 上海微谱化工技术服务有限公司
    发明人: 秦秋明; 宁飞飞; 侯小刚; 贾梦虹; 姜俊婕
    地址: 200438 上海市杨浦区国伟路135号9号楼1楼
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611217873.3

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法的分离检测方法,包括如下步骤:(1)称取中药饮片枳壳,粉碎,采用加热回流的方式提取,得到粗提取物;(2)将步骤(1)中粗提取物中,加入甲醇后超声处理,过滤,得到滤液;(3)采用高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分离。本发明提供的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法对中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物具有优异的分离效果,由于壳聚糖廉价易得,大大降低了分离的成本,适于工业大规模生产。

    权利要求书

    1.一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
    (1)称取中药饮片枳壳,粉碎,采用加热回流的方式提取,得到粗提取物;
    (2)将步骤(1)中粗提取物中,加入甲醇后超声处理,过滤,得到滤液;
    (3)采用高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分离。
    2.根据权利要求1所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述高效液相色谱法的固定相填料为硅胶类填料。
    3.根据权利要求2所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述高效液相色谱法的固定相填料为壳聚糖改性硅胶填料。
    4.根据权利要求1所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述高效液相色谱法的流动相包括水相和有机相。
    5.根据权利要求4所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述有机相选自甲醇或乙腈中的任意一种。
    6.根据权利要求4所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述水相选自甲酸溶液或纯水中的任意一种。
    7.根据权利要求4所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述有机相与水相的体积比为30:70~20:80。
    8.根据权利要求6所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述甲酸溶液的摩尔浓度为0.1%~0.5%。
    9.根据权利要求8所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述甲酸溶液的摩尔浓度为0.2%~0.4%。
    10.根据权利要求1所述的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在
    于,所述中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法中检测波长为245~285nm。

    说明书

    一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法

    技术领域

    本发明涉及中药饮片中活性成分的分离方法,更具体地,本发明涉及一种中药饮
    片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法。

    背景技术

    积壳为芸香科柑橘属植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种的干燥未成
    熟果实。7月果皮尚绿时采收,自中部横切为两半,晒干或低温干燥?;俏犊?、辛、酸,微寒。
    归脾、胃经。具有理气宽中,行滞消胀等功效,可用于胸肋、气滞,胀满疼痛,食积不化,痰饮
    内停,脏器下垂。国内外学者研究发现积壳中化学成分较多,主要有黄酮、生物碱、香豆素、
    柠檬苦素、挥发油及微量元素等类化合物。

    传统的对于枳壳饮片中黄酮类物质的分离,多选用C18为固定相的色谱柱,但存在
    分离效果差,准确性低,重现性差,在柱子上吸附量等问题,因此,本发明人在大量实验的基
    础上,主要针对枳壳汇总黄酮苷类化合物进行了研究,高效分离并鉴定出了异柚皮苷、柚皮
    苷、橙皮苷、新橙皮苷四种物质,具备分离效果好,重现性好的特点。

    发明内容

    为了解决上述问题,本发明提供了一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检
    测方法的分离检测方法。

    为了实现上述发明目的,本发明采取了以下技术方案:

    一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,包括如下步骤:

    (1)称取中药饮片枳壳,粉碎,采用加热回流的方式提取,得到粗提取物;

    (2)将步骤(1)中粗提取物中,加入甲醇后超声处理,过滤,得到滤液;

    (3)采用高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分离。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱法的固定相填料为硅胶类填料。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填料为壳聚
    糖改性硅胶手性色谱柱。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相。

    作为一种优选的技术方案,所述有机相选自乙腈或甲醇中的任意一种。

    作为一种优选的技术方案,所述水相选自甲酸溶液或纯水中的任意一种。

    作为一种优选的技术方案,所述有机相与水相的体积比为30:70~20:80。

    作为一种优选的技术方案,所述甲酸溶液的摩尔浓度为0.1%~0.5%。

    作为一种优选的技术方案,所述甲酸溶液的摩尔浓度为0.2%~0.4%。

    作为一种优选的技术方案,所述中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法
    中检测波长为245~285nm。

    附图说明

    为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,显而易见地,下面描述中的附图仅
    仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,
    还可以根据这些附图获得其他的附图。

    图1本发明检查分析方法对中药饮片枳壳中柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷四
    种物质的高效液相谱图

    具体实施方式

    参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发
    明的内容。除非另有限定,本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通
    技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时,以本说明书中的定义为准。

    本技术领域技术人员可以理解,除非另外定义,这里使用的所有术语(包括技术术
    语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义?;褂Ω?br />理解的是,诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意
    义一致的意义,并且除非像这里一样定义,不会用理想化或过于正式的含义来解释。

    一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法,其特征在于,包括如下步
    骤:

    (1)称取中药饮片枳壳,粉碎,采用加热回流的方式提取,得到粗提取物;

    (2)将步骤(1)中粗提取物中,加入甲醇后超声处理,过滤,得到滤液;

    (3)采用高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分离。

    枳壳:

    枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时
    采收,自中部横切为两半,晒干或低温干燥。枳壳味苦、辛、酸,微寒。归脾、胃经。具有理气宽
    中,行滞消胀等功效,可用于胸胁气滞,胀满疼痛,食积不化,痰饮内停,脏器下垂。枳壳的栽
    培变种主要为黄皮酸橙、代代花、朱栾、塘橙。枳壳所含化学成分较为复杂,目前已知的有效
    成分主要有黄酮类、挥发油类、生物碱类、香豆素类和一些微量元素等。主要有效成分为黄
    酮苷类化合物,包括异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷。

    高效液相色谱

    高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称"高压
    液相色谱"、"高速液相色谱"、"高分离度液相色谱"、"近代柱色谱"等。高效液相色谱是色谱
    法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不
    同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进
    入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。

    本发明中所述的高效液相色谱仪选自Agilent 1200HPLC。

    固定相

    分离载体是实现分离分析过程的核心。硅胶基质载体具有强度好,多孔结构,比表
    面积易于人为控制,良好的物理化学稳定性、生物相容性,具有足够的具有反应活性的硅羟
    基等优点,因而是各种分离载体的理想基质材料,同时也是众多复合材料分离介质的重要
    组成部分?;诠杞夯实姆掷朐靥寮壕还惴河τ糜诖呋?、环境科学和色谱等领域,对其
    进行功能化修饰是至关重要的。众多分离难题的解决都与硅胶基质分离载体的功能化发展
    有着密不可分的联系。

    硅胶的化学成分是二氧化硅,物理化学性质极其稳定。用作分离载体基质的硅胶
    都是人工合成的。随着合成方法的逐渐改进和对硅胶基本性质研究的深入,目前所合成的
    硅胶具有机械强度高、比表面积大及表面易于修饰与控制的特点,其优异的物理、化学和机
    械特性使其成为功能化分离载体的一种不可替代的基质。

    硅胶颗??梢苑治蛐秃臀薅ㄐ土街?。一般而言,球型硅胶由于其可渗透性强,比
    无定型硅胶更有利于传质,且可减小操作压力,因而更适合用作高相液相色谱填料。较之硅
    胶颗粒的外形,粒径分布显得更为重要,它将直接影响硅胶基质填充柱的压力。在高效液相
    色谱中,色谱柱所用填料的粒径分布对其柱效影响很大??悸堑街У奈侍?,硅胶颗粒的孔
    结构是非常重要的参数。因为孔结构不仅影响到孔径的计算,而且影响到孔径分布、孔容及
    表面积等重要参数,正是这些参数决定着其作为正、反相乃至其它高效液相色谱用填料的
    性能,且对其作为基质进行化学键合反应以及分离过程与机理等均有不可忽视的影响???br />结构有几个重要表征参数:平均孔径,比表面积,比孔容和孔径分布等。多孔硅胶可以分为
    微孔、中孔和大孔硅胶。一般将小于2nm的称为微孔硅胶,对于大于2nm而小于50nm的称为中
    孔硅胶,超过50nm的称为大孔硅胶。作为一种优选的技术方案,本发明选用的硅胶为中孔硅
    胶。

    以硅胶为基质制备的液相色谱固定相具有机械强度高、化学性质和热稳定性好等
    优点,广泛应用于化学、工业和催化等领域。其在化学方面主要应用于含量的测定和化合物
    的分离分析。硅胶表面含有丰富的硅羟基(Si-OH),这些硅羟基是硅胶表面的主要吸附位点
    和最具反应活性的官能基团,是进行表面化学键合和改性的基础??赏ü?种途径对硅胶表
    面进行修饰,即涂层法、整体修饰和表面硅羟基的化学修饰。其中表面硅羟基的化学修饰简
    单易行,且所得到的固定相能稳定,本发明选择此种方法制备得到具有优异分离性能的固
    定相。在这类方法中,采用各类有机试剂与硅羟基进行反应,从而在硅胶的表面共价键合不
    同的官能基团,可得到满足不同分离需求的色谱固定相。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱法的固定相填料为硅胶类填料。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填料为壳聚
    糖改性硅胶手性色谱柱。

    壳聚糖改性硅胶色谱柱固定相的制备

    将酸浸泡硅胶,并回流,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,烘烤除水活
    化,冷却后保存于干燥器中备用。取经活化的干燥硅胶,加入无水干燥甲苯,搅拌下加入KH-
    560和三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?,冷却,用甲苯抽提,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗
    涤,下真空干燥,得到偶联剂键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体,加热搅拌下,向其中加入壳聚糖,乙酸、甲苯。滴加高氯酸用作催化
    剂,在N2?;は录尤然亓?,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳聚糖改性硅胶色谱柱固定
    相。

    作为一种优选的实施方式,所述高效液相色谱法所用色谱柱的固定相填料为壳聚
    糖衍生物改性硅胶手性色谱柱。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的三口烧瓶中,加入一定量体积比为的石蜡和水、乳化剂司盘80以
    及乙酸,乳化加入壳聚糖,搅拌均匀,升温至,同时将溶液pH调至9~10之间,加入一定量的
    环氧氯丙烷,升温,加入足量2-甲氧基苯甲酰胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生
    物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将盐酸浸泡硅胶,并回流,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,烘烤除水
    活化,冷却后保存于干燥器中备用。取经活化的干燥硅胶,加入无水干燥甲苯,搅拌下加入
    KH-560和三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?,冷却,用甲苯抽提,依次用丙酮、甲醇和丙酮
    洗涤,真空干燥,得到偶联剂键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体,加热搅拌下,向其中加入上述壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴加高氯
    酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳聚糖衍生物改
    性硅胶手性色谱柱固定相。

    色谱柱的填充

    将空柱子仔细以乙醇或丙酮清洗干净,用表面活性剂和去离子水依次清洗,并以
    长竹签或塑料棒扎上棉纱或纱布往复抽擦,以除去污垢。但应注意不要伤及内壁表面的光
    洁度,尤其不能造成轴向的划痕。将清洁的柱管的一端装配上带滤板的柱头,另一端则连接
    至匀浆罐上。配置四氢呋喃:异丙醇=95%:5%的溶液20mL,称取2.50g上述自制填料倒入
    上述溶液中摇动或搅拌均匀后,超声处理,以中强的超声波令填料粒子均匀而稳定地悬浮
    起来。最后,再以强超声波短时间强化一下。超声处理的时间不宜过长,不超过3min,过长则
    可能造成颗粒的破碎。使用RPL-ZD 10装柱机。首先以2Hz排除气泡。色谱柱为4.6mm×150mm
    的柱子,取20ml丙酮装入匀浆罐中打底,接着快速倒入准备好的匀浆液,如匀浆罐不满用丙
    酮填满,装满后,将匀浆罐盖好、旋紧,迅速加压到40MPa,直至流出液体为80mL左右,缓慢减
    小压力直至停泵,停泵30min后再卸柱。拆下己填装好的柱子并装配上带有筛板的柱头,即
    得。

    本发明提供的手性色谱柱固定相解决了传统高效液相色谱柱对枳壳中手性成分
    分离效果差,检查不灵敏,手性柱成本高的问题,采用壳聚糖改性硅胶基体制备得到新型固
    定相壳聚糖分子链的糖残基上含有羟基和氨基,因此壳聚糖的化学改性即可以在羟基上反
    应,又可以在氨基上反应??蔷厶巧嫌辛街拄腔?,一种是C6—OH,这是一级羟基;另一种是
    C3—OH,这是二级羟基,C6—OH既是一级羟基,在空间构象上来说,又可以较为自由地旋转,
    位阻也小,而C3—OH既是二级羟基,又不能自由旋转,空间位阻大些,所以一般情况下C6—OH
    的反应活性大于C3—OH??蔷厶堑奶遣谢贑2上有一个氨基,在C3上有一个羟基,从构象上
    来看,它们都是平伏键,这种特殊的结构,使得在分离重要饮片枳壳中的有效成分的时候,
    具有高的分离准确性。

    本发明人经大量实验证明,对于枳壳中多种手性物质的分离具有高的分离度,由
    于枳壳可以制成中药饮片的形式,中药成分的分离检出并不灵敏,常?;旌显又?,造成对这
    些成分的不完全分离。采用壳聚糖改性的硅胶作为手性柱填料对于枳壳饮片中黄酮成分的
    分离,具有优异的分离效果,壳聚糖不同于其他天然多糖类,由于其分子结构中存在大量的
    游离氨基,游离氨基活性较高,中药饮片枳壳中的活性成分异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙
    皮苷分子内的羟基与氨基、无机流动相形成强度不一的氢键,有利于枳壳中药饮片中的有
    益成分的分离。在对壳聚糖进行改性,后引入2-甲氧基苯甲酰胺基团加强了分离的效果。

    作为一种优选的技术方案,所述高效液相色谱的流动相包括由水相和有机相。

    作为一种优选的技术方案,所述有机相选自乙腈或甲醇中的任意一种。

    作为一种优选的技术方案,所述水相选自甲酸溶液或纯水中的任意一种。

    作为一种优选的技术方案,所述有机相与水相的体积比为30:70~20:80。

    作为一种优选的技术方案,所述甲酸溶液的摩尔浓度为0.1%~0.5%。进一步优
    选的甲酸溶液的摩尔浓度为0.2%~0.4%。

    作为一种优选的技术方案,所述中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法
    中检测波长为。

    高效液相色谱条件:检测流速为每分钟1ml;柱温常温;检测波长为245~285nm。

    下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

    本发明所述的原料没有特殊说明均为市售。

    实施例1

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.5%,且与甲
    醇的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为245nm。

    固定相的制备

    将3mo1/L盐酸中浸泡8g硅胶,并加热回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙
    酮洗三次,在150℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥
    硅胶,加入100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は?br />加热回流26h,冷却,用甲苯抽提20h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得
    到偶联剂键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体10g,加热搅拌下,向其中加入壳聚糖,乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用
    作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳聚糖改性硅胶
    色谱柱固定相。

    实施例2

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.4%,且与甲
    醇的体积比为80:20,流速为每分钟1ml;检测波长为250nm。

    固定相的制备

    将3mo1/L盐酸中浸泡8g硅胶,并加热回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙
    酮洗三次,在150℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥
    硅胶,加入100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は?br />加热回流26h,冷却,用甲苯抽提20h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得
    到偶联剂键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体10g,加热搅拌下,向其中加入壳聚糖,乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用
    作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳聚糖改性硅胶
    色谱柱固定相。

    实施例3

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.4%,且与甲
    醇的体积比为75:25,流速为每分钟1ml;检测波长为255nm。

    固定相的制备

    将3mo1/L盐酸中浸泡10g硅胶,并加热回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙
    酮洗三次,在150℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥
    硅胶,加入100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は?br />加热回流26h,冷却,用甲苯抽提20h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得
    到偶联剂键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体10g,加热搅拌下,向其中加入壳聚糖,乙酸、甲苯。滴加2滴高氯酸用
    作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳聚糖改性硅胶
    色谱柱固定相。

    实施例4

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.4%,
    且与甲醇的体积比为75:25,流速为每分钟1ml;检测波长为255nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例5

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.4%,
    且与甲醇的体积比为75:25,流速为每分钟1ml;检测波长为260nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为6%,且与甲醇的体积比为78:22,流速为每分钟
    1ml;检测波长为225nm。

    实施例6

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.3%,
    且与甲醇的体积比为75:25,流速为每分钟1ml;检测波长为265nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例7

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.2%,
    且与乙腈的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为270nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例8

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.1%,
    且与甲醇的体积比为80:20,流速为每分钟1ml;检测波长为270nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例9

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.3%,
    且与甲醇的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为275nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例10

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为纯水,摩尔浓度为0.1%,且与
    甲醇的体积比为80:20,流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    实施例11

    (1)称取10g中药饮片枳壳,采用粉碎机粉碎,加入分析纯1L甲醇溶剂,采用加热回
    流的方式提取,得到粗提取物。

    (2)取步骤(1)中粗提取物3g中,加入300mL甲醇后超声处理,过滤,得到滤液。

    (3)采用Agilent 1200HPLC高效液相色谱法对步骤(2)中制备得到的滤液进行分
    离。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.3%,
    且与甲醇的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。

    壳聚糖衍生物的制备

    向装有搅拌器的500mL三口烧瓶中,加入100ml体积比为1:1的石蜡和水、3g司盘80
    以及1mL乙酸,在30℃下乳化30min加入2g壳聚糖,搅拌均匀,升温至60℃,同时将溶液pH调
    至9~10之间,加入2.3g环氧氯丙烷,反应2h,继续升温至70℃,加入4.3g2-甲氧基苯甲酰
    胺,至反应完全,重结晶分离,即得壳聚糖衍生物。

    壳聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相的制备

    将3mo1/L盐酸浸泡硅胶,并回流10h,然后用二次蒸馏水洗至中性,用丙酮洗三次,
    在160℃下烘烤除水活化8h,冷却后保存于干燥器中备用。取6.0g经活化的干燥硅胶,加入
    100mL无水干燥甲苯,搅拌下加入4.0mL KH-560和3滴三乙胺催化剂。在N2?;は录尤然亓?br />24h,冷却,用甲苯抽提24h,依次用丙酮、甲醇和丙酮洗涤,80℃下真空干燥8h,得到偶联剂
    键合硅胶物质,制备得到硅胶前体。

    称取硅胶前体5g,加热搅拌下,向其中加入上述1.5g壳聚糖衍生物,乙酸、甲苯。滴
    加2滴高氯酸用作催化剂,在N2?;は录尤然亓?4h,冷却,调节PH至中性,析出固体,即得壳
    聚糖衍生物改性硅胶手性色谱柱固定相。

    流动相为醋酸铵水溶液,摩尔浓度为8%,且与甲醇的体积比为75:25,流速为每分
    钟1ml;检测波长为240nm。

    对比例1

    固定相为C18的手性柱,购买自北京绿百草科技发展有限公司。型号150×4.6mm。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.3%,
    且与甲醇的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。

    对比例2

    固定相为纤维素涂敷型手性柱,购买自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。

    固定相为壳聚糖衍生物改性硅胶的填料;流动相为甲酸溶液,摩尔浓度为0.3%,
    且与甲醇的体积比为70:30,流速为每分钟1ml;检测波长为280nm。

    性能测试

    将实施例中手性柱的制备参照说明书中具体实施方式中的制备方法。按实施例与
    对比例中的分离条件对枳壳中活性成分进行分离,进样量为10μL。

    表1分离测试结果



    通过表1的实施例与对比例的分离测试结果得到如下结论:

    本发明提供的中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法对枳壳中的各活
    性成分具有优异的分离度,由于壳聚糖廉价易得,大大降低了分离的成本,适于工业大规模
    生产。

    关于本文
    本文标题:一种中药饮片枳壳中黄酮苷类化合物的分离检测方法.pdf
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