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    必赢客重庆时时彩破解: 一种建立急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的方法.pdf

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    一种 建立 急性 缺血性 脑卒中 特征 蛋白 模型 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510799682.1

    申请日:

    2015.11.20

    公开号:

    CN106770618A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/64申请日:20151120|||公开
    IPC分类号: G01N27/64 主分类号: G01N27/64
    申请人: 中国康复研究中心
    发明人: 王屹
    地址: 100068 北京市丰台区角门北路10号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510799682.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2018.12.18|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种用于急性缺血性脑卒中早期诊断的特征蛋白的质谱模型及其构建方法,该质谱模型由质荷比为4247m/z和6429m/z的峰构成,模型中表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白是急性缺血性脑卒中早期诊断的特征蛋白,当表征为质核比4247m/z的蛋白显著降低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时,预示为急性缺血性脑卒中或潜在患者。本发明的质谱模型,可用于急性缺血性脑卒中的筛查和早期检测,方法简单易于操作,准确性高。为急性缺血性脑卒中筛查和早期检测提供了新的思路。

    权利要求书

    1.用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱标记,其包括质荷比为
    4247m/z和6429m/z的峰。
    2.用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型,其特征在于,该质谱
    模型中有5个表达差异显著的蛋白峰4247,4265.66,1982.69,5979.9,
    6429.97,根据受试者工作特征ROC曲线下面积>90%,选择质荷比为4247m/z和
    6429.97m/z的两个峰,其中4247m/z的峰在急性缺血性脑卒中显著降低,质荷
    比6429m/z的峰在急性缺血性脑卒中组明显上调。
    3.建立权利要求2所述质谱模型的构建方法,包括如下步骤:
    1)将多例临床确诊的急性缺血性脑卒中血清和正常对照人员的血清作为两
    组血清标本,进行低温冷冻备用;
    2)对血清蛋白进行质谱前预处理:
    3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取,获得两组血清多肽的指
    纹图谱;
    4)对所有的急性缺血性脑卒中和正常人血清多肽的指纹图谱进行标准化处
    理,并收集数据;
    5)对所得数据进行标准化处理,实验质控,筛选出具有下列质荷比峰的2
    个急性缺血性脑卒中特征蛋白:4247m/z和6429m/z,根据这两个质荷比峰建立
    检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型。
    4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,其中步骤2)预处理的方法是
    采用MB-WCX磁珠对血清蛋白进行富集。
    5.如权利要求3或4所述的方法,其特征在于,所述的实验质控处理指保
    留峰数量大于50的质谱图谱数据。

    说明书

    一种建立急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的方法

    技术领域

    本发明涉及神经系统疾病领域,为一种全新的质谱模型及其构建
    方法,对急性缺血性脑卒中进行早期的筛查和早期检测,其敏感性和
    特异性均达到90%以上。

    背景技术

    据WHO的统计数据,全球每6秒,脑卒中夺去一个生命;每隔一
    秒,脑卒中袭击一个人;每年1500万人脑卒中,600万人死于脑卒
    中,3000万人因脑卒中而残疾。目前中国是老龄化最快的国家之一,
    因此脑卒中造成的死亡率仍在不断攀升。50-65%的脑卒中病例是由缺
    血性事件所引起。脑卒中病程进展快,带来的后果又十分严重,因此
    该疾病的早诊断早治疗对于预后有着重大的影响。目前,由于尚无快
    速简便的实验室血液检测方法用于该疾病的筛查和早期检测,耽误了
    最佳治疗时机或延误治疗,给神经系统带来不可恢复的损伤,甚至
    有8%的患者会发生再次卒中。

    液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术是为解决在不损害功能及不增
    加背景的条件下分离蛋白质的难题,根据色谱及探针的原理,磁珠(液
    体芯片)表面经化学(疏水、亲水、阳离子、阴离子及金属离子螯合
    等)或生物化学(抗体、受体、配体、酶、DNA等)处理,所获得蛋
    白经过选择性清洗,与加入的能量吸收分子(EAM)结合,形成晶体,
    样品被送入质谱仪,在特异的激光照射后,带电分子在通过电场时加
    速,不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需时间不同,
    蛋白质的质荷比(M/Z)与离子飞行时间的平方成正比。信号由高速
    的模拟数字转化并记录,被测定的蛋白质以一系列波峰的形式出现,
    并由此绘制出待测蛋白的质谱图。再采用软件进行质谱图的比对和分
    析,即可发现各样本间的蛋白质表达和含量的异同。主要用于从复杂
    体液如血清、血浆、尿液、唾液或脑脊液、组织裂解液、细胞培养上
    清液中发现潜在的生物标志物。

    MALDI质谱技术具有高灵敏性、高特异性、高通量和快速检测的
    特点,使用MALDI质谱进行临床诊断5分钟即可测试一个样本,一台
    仪器即可达到全年3万6千例的筛查通量,可大大减少检测的时间耗
    费,达到早诊断、早治疗的效果。此外,由于MALDI质谱技术的特点,
    使其大大降低了筛查诊断的假阳性和假阴性。该技术已广泛应用于损
    伤和疾病早期诊断研究中。虽然近年,血清多肽组学已成功的应用于
    多种肿瘤的诊断研究,但对急性缺血性脑卒中的蛋白标记物的筛选和
    鉴定,较多采用液相色谱和双向电泳的方法,将质谱技术应用于寻找
    急性缺血性脑卒中的血清蛋白组/多肽模式诊断模式的报道极少。

    发明内容

    本发明目的在于提供一种用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白
    的质谱模型及其制备方法。

    为实现上述目的,本发明首先提供一种用于检测急性缺血性脑卒
    中特征蛋白的质谱标记,该质谱标记是质荷比为4247m/z和6429m/z
    的峰。表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白
    是急性缺血性脑卒中血清特征蛋白,当表征为质核比4247m/z的蛋白
    显著降低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时,预示为急性缺
    血性脑卒中或潜在患者。

    进而本发明提供一种用于检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质
    谱模型,该质谱模型包括质荷比为4247m/z和6429m/z的峰,模型中
    表征为质荷比4247m/z的蛋白和表征为质荷比6429m/z的蛋白是急性
    缺血性脑卒中血清特征蛋白,当表征为质核比4247m/z的蛋白显著降
    低和表征为质荷比6429m/z的蛋白上调表达时,预示为急性缺血性脑
    卒中患者或潜在患者,其临界值为4247降低【21.62±5.54/84.45±
    21.62】、6429.97上调【18.19±8.68/6.28±4.78】。(数字表
    现形式:急性缺血性脑卒中组平均峰面积±标准差/正常对照组平均
    峰面积±标准差)

    本发明质谱模型的构建方法包括如下步骤:

    1)收集多例临床确诊的急性缺血性脑卒中患者血清和正常对照
    人员的血清作为两组血清标本,进行低温冷冻备用;

    2)对血清蛋白进行质谱前预处理:

    3)对预处理过的两组血清蛋白进行质谱检测读取,获得两组血
    清多肽的指纹图谱;

    4)对所有的急性缺血性脑卒中患者和正常人血清多肽的指纹图
    谱进行标准化处理,并收集数据;

    5)对所得数据进标准化处理,筛选出具有下列质荷比峰的2个
    急性缺血性脑卒中特征蛋白:4247m/z、6429m/z,根据这两个质荷比
    峰建立检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型。

    上述方法其中步骤2)预处理的方法是采用MB-WCX磁珠对血清
    蛋白进行富集预处理。

    上述的实验质控处理只保留峰数量大于50的质谱图谱数据。

    本发明结合生物信息学方法筛选出相应的急性缺血性脑卒中标
    志并建立检测模型进行分析检测,所述的生物信息学方法包括对指纹
    图谱进行标准化处理、对所得数据进实验质控处理、筛选期望的血清
    特征蛋白并建立质谱模型,以及可选择地包括使用遗传算法结合最近
    邻算法建立并验证质谱模型等。其中,所述的实验质控处理只保留峰
    数量大于50的质谱图谱数据,并采用系统重复性验证(日间-日内重
    复性)来保证实验的一致性。

    本发明检测急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱标记,可用于建立
    血清特征蛋白质谱模型以及应用于在急性缺血性脑卒中筛查和早期
    检测。本发明的质谱模型,可用于急性缺血性脑卒中筛查和早期检测。
    本发明与其它急性缺血性脑卒中的检测方法比较,具有以下优点:

    第一,本发明采用急性缺血性脑卒中患者与正常人具有差异的两
    个特征蛋白组合进行对急性缺血性脑卒中血清的检测,并采用了传统
    统计学与现代生物信息学方法相结合的方法进行数据处理,从而得到
    急性缺血性脑卒中患者和健康人血清蛋白质指纹图谱检测模型,并且
    所发现的一系列蛋白质质荷比峰为寻找新的更理想的诊断标志物提
    供了基础和资源。

    第二,与以往的血清学检测方法比较具有较高的敏感性和特异
    性,并能用于急性缺血性脑卒中筛查和早期检测中。

    第三,本发明模型的构建方法设计合理可行,为提供急性缺血性
    脑卒中新的筛查和早期诊断方法,同时也为探索急性缺血性脑卒中早
    期预防提供了新的思路。

    第四,利用本发明分析了89份血清样品,其中对照组40,验证
    结果显示两组间有明显差异,因此本发明可对急性缺血性脑卒中进行
    早期筛查和诊断,降低死亡率和致残率,提高患者的生活质量,减少
    经济负担。

    附图说明

    图1为急性缺血性脑卒中患者和正常对照组的血清多肽平均谱。

    图2为急性缺血性脑卒中患者和正常对照组多肽分布散点图。

    图3为蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平展示。

    图3-1表示用于建模型的荷质比为4247m/z的急性缺血性脑卒中
    显著降低的特征蛋白峰所有建模型样品中的表达水平。

    图3-2表示用于建模型的荷质比为6429m/z的急性缺血性脑卒中
    特征蛋白峰在所有建模型样品中的表达水平。

    图4急性缺血性脑卒中检测模型的验证散点图。

    图5急性缺血性脑卒中特征蛋白的质谱模型的构建方法

    具体实施方式

    以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的
    限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或
    条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。

    若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟
    知的常规手段。

    实施例1急性缺血性脑卒中质谱模型的建立

    1 样本和仪器:

    1.1 共231例血清样本,病例组在出现脑卒中相关的神经系统症状后
    取样,对照组于安静状态取样。均抽取静脉血4ml,分离血清,标
    记并于-80℃保存。

    1.2 基质辅助激光解析飞行时间质谱为autoflex speed III,α-
    氰基-4-羟基肉桂酸(α-CCA)基质,弱阳离子交换磁珠MB-WCX,普通
    384靶板和8位手动分离磁架均购自布鲁克·道尔顿公司。乙腈、
    无水乙醇、三氟乙酸,购自美国Sigma公司。

    1.3 使用Bruker公司的数据分析软件Clinprotools做数据的预处
    理,处理后的数据采用统计分析软件R2.6.2的遗传算法包genalg进
    行处理。

    2、血清采集及处理:

    2.1 血清的采集:收集静脉血在BD管中,避免溶血?;郝厣舷抡?br />荡管五次,使血液中的凝结块混匀。室温(25℃)血凝结1小时,垂
    直放置。其中血液必须精确凝结1小时,否则,由于样品不同的凝结
    时间而导致不同的肽谱。室温下,用临床离心机以1.400-2.000g离
    心真空采血管(BD公司)十分钟。吸取血清(上清液)到对应的已
    标记管中。标记干净的0.5ml离心管,同一血清样品50ul一管,分
    装多管。立即冻存血清样品于-80℃。由于反复冻融血清样品易造成
    多肽沉淀,从而使得肽谱丢失部分多肽,应避免反复冻融。冻存血清
    分为永久保存和待分装的。血清分装后可在-80℃保存多年。

    2.2 血清样品的磁珠处理:在进行ClinProt实验前,4℃冰箱取出磁
    珠试剂盒,取出弱阳离子磁珠悬浮液一管,手动上下摇动,完全混匀
    磁珠悬浮液,1分钟;取出10ul磁珠结合缓冲液(BS)加入200ul样
    品管中,再加入10ul磁珠至样品管,用加样枪上下吸打混匀,避免
    起泡;向样品管加5ul血清,用加样枪上下吸打混匀至少5次,避
    免起泡,室温静置5min;将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1
    分钟,磁珠与悬浮的液体分离,液体应清澈;用加样枪吸去悬浮的液
    体,枪头应避免接触到磁珠,避免吸走磁珠,再向样品管中加入100ul
    磁珠清洗缓冲液(WS),在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品
    管10次;使样品管在磁珠分离器上静置,磁珠贴壁,磁珠与悬浮的
    液体分离,液体应清澈;用加样枪吸去悬浮的液体,枪头应避免接触
    到磁珠,避免吸走磁珠;重复7-10步骤两次,最后一次加样枪吸去
    悬浮的液体时,要保证悬浮液完全被吸走;从磁珠分离器上取下样品
    管,并向样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液(ES),混匀贴壁的磁珠,
    反复吸打10次,吹打过程应避免起泡;样品管放入磁珠分离器,磁
    珠贴壁2min,磁珠与悬浮的液体充分分离后,将上清液移入干净的
    0.5ml样品管(先在管内加入5ul稳定缓冲液(SS),用加样枪小心吸
    打混匀)

    2.3 点靶

    取1μl上面得到的液体样品与1μl预先配置好的HCCA基质溶
    液(四氢肉桂酸在40%乙腈与60%的0.1%三氟乙酸中的饱和溶液)
    充分混和,将其点在质谱样品靶上。待其自然干燥后,使用MALDI-
    TOF/TOF质谱仪在0~10000Da的质量范围进行检测,储存全部实验
    结果。

    3、生物信息学方法

    3.1 质谱数据采集

    应用Autoflex II TOF/TOF质谱仪。激光能量50%时,10shots去
    杂,36%时100shots采集一个样品结晶点的某一个点,平均每个样品
    结晶点收集100次共1000shots。激光频率:30Hz。数据收集范围:
    1-10KDa。在每8个样品结晶点收集数据前用标准品进行外标校正,
    平均分子量偏差小于100ppm。

    3.2 实验质控

    3.2.1 对于每一张采集到的原始图谱,设定S/N>=5的峰数量做
    为评判图谱质量的一个标准;对于峰数量大于50的图谱才保存,合
    弃峰数量小于50的图谱。

    3.2.2 针对整个实验操作,系统重复性验证(日间-日内重复性)
    为保证实验数据的可靠性和有效性,对MALDI-TOF-TOF系统检测和
    磁珠血清前处理体系统进行了稳定性的分析。应用多个样本混合,分
    成30份样本,每天选5份样本进行样本前处理和质谱检测,连续检
    测6天对系统日内重复性和日间重复性进行验证,通过评价几个峰的
    平均相对强度和变异系数,评价系统的重复性。


    表1系统稳定性验证(日间-日内重复性),MRI为平均相对强度,

    3.3 原始数据预处理

    原始数据经Bruker公司数据分析软件Clinprotools处理,
    800-10K的峰值经由Top hat方法做基线校准,最小基线宽度10%,
    以10%最小阀值聚类;然后用总离子流方法做归一化处理。

    3.4 急性缺血性脑卒中特征蛋白的选择

    每个质荷比蛋白峰对各类样本的区分的相对重要性都不同,这里
    综合运用了T检验P值和受试者接受曲线(ROC)的方法来评价每个蛋
    白峰的相对重要性。

    3.5 遗传算法

    遗传算法是一种很有效的全局随机化搜索算法,它借鉴了生物界
    自然选择和自然遗传的机制,其主要特点是群体搜索策略和群体中个
    体之间的信息交搜索不依赖于梯度信息。遗传算法对多个个体组成的
    群体进行操作,通过遗传算子可以使个体间的信息得以交换,这样的
    群体中的个体一代一代地得以优化,并逐步逼近最优解。它尤其适用
    于处理传统搜索方法难以解决的复杂和非线性问题,可广泛用于涉及
    高维空间的组合优化领域。本发明方法的遗传算法从统计差异蛋白子
    集形成的特征空间中搜索次优特征子集。分类函数采用遗传算法
    (GA)。在利用遗传算法对训练样本建立质谱数据分类模型后,利用
    验证样本(89份)来检验所建立模型的分类能力。

    实施例2急性缺血性脑卒中检测

    应用实例1的方法对健康人群54例,急性缺血性脑卒中患者90
    例的血清蛋白质图谱作了检测分析。用初步筛选的质荷比峰按照P值
    小于0.05为统计差异显著的差异蛋白峰,利用遗传算法建立最终的
    诊断模型。

    对急性缺血性脑卒中患者49例,正常对照40例进行模型验证,
    验证结果显示模型对急性缺血性脑卒中患者的诊断敏感性为100%,
    特异性为92.5%,判断的正确率为96.3%。如图4所示,图中的黑点
    代表用于验证的正常对照组样本分布,其中,蓝色圆圈标注的是未被
    模型正确判断的样本。

    实施例3与其他急性缺血性脑卒中检测方法的比较

    目前,对于急性缺血性脑卒中的诊断,主要依赖于患者的临床表
    现和神经影像学资料,如CT或MRI。对于出血性脑卒中的诊断,CT
    检查是行之有效的方法,而对于缺血性脑卒中尤其是程度较轻的病
    例,CT的作用大不如前者;虽然脑部的MRI检查对于该疾病的诊断
    作用显而易见,但由于其价格昂贵、耗费时间长,且很多急诊医疗部
    门无能力配置如此庞大的设备,同时可能由于患者自身原因,如躁动
    不安,有心脏起搏器或其他金属植入物而无法进行检查,以上种种原
    因限制了MRI的广泛使用。本发明获得的生物学诊断模型为其早期
    诊断并及时选择适当的治疗方案提供快速准确的生物标记物,这对于
    急性缺血性脑卒中患者的治疗和预后将具有非常重大的意义,在很大
    程度上可以提高患者病后的生活质量,减轻家庭和社会的负担,节约
    医疗资源。如该发明能实现产业化,应用于高危人群的院外甚至家庭
    诊断,必将对急性缺血性脑卒中的预防和早期治疗产生深远影响。

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